富集和检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrP的制作方法

专利名称：富集和检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrP的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测活生物体的病理学改变的朊病毒蛋白质的方法。
背景技术：
可传播的海绵样脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies)(TSE)是传染性的，通常是致命的，中枢神经系统的退行性病变。这些疾病中出现的脑内组织病理学改变与病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)(其是天然存在的细胞朊病毒蛋白质(PrPC)的构象异构体)的累积有关。出现在病程中的朊病毒的复制，是PrPSc和PrPC之间直接相互作用的结果，其中病理性PrPSc的构象被强加到PrPC上。通过与PrPc进行对比，PrPSc的特征为β折叠的含量增加以及对蛋白酶(例如蛋白酶K)的高度抗性。
PrPSc的这种抗性目前用于检测牛海棉样脑病(BSE)的体外诊断中。目前的检验系统的原则是将来自脑干(脑闩区)的组织部分进行匀浆，并且用蛋白酶K进行处理。蛋白酶处理将正常PrPC完全分解，但来自感染了BSE的动物的PrPSc只缩短了几个氨基酸，从而将其相对分子量从33-35kDa降低到27-30kDa。随后，通过Western印迹或者ELISA技术用单克隆抗体显示保留的PrP。
这一检验系统的重要缺点是其低敏感性。在感染BSE的牛中PrPSc的浓度的高度仅高到使得在检验系统只能存在中枢神经系统(CNS)中，并因此，目前诊断只限于死亡后检查，并依赖于感染生物体的至少18个月到几年的潜伏期(incubaion period)。
除了上述检测PrPSc，诊断TSE还有两种方法在CNS中检测典型的海绵样变的组织病理学方法，和一种生物试验，其显示了小鼠模型中样品的感染力。这两种方法也都有重要的缺点。该组织病理学方法不适于临床前诊断，因为脑内的结构改变只出现在潜伏晚期，即在临床期前不久。此外，用这种方法进行诊断是在死亡后进行的，这是因为必需的脑组织不能从活生物体中获得。在理论上，生物试验能够检测单个感染单元，但这种方法需要至少几个月或者甚至几年。
为了在可能的感染之后和/或在仍存活的生物体中尽快进行诊断，前一检测方法的敏感性必须在实质上得到提高，而且除在CNS中可以进行检测以外，必须还有可能在组织/体液中进行检测。
病理性PrPSc与人血清蛋白例如纤溶酶原(plamsinogen)的结合已经由Fischer等描述[Fischer，MB；Roeckl，C；Parizek，P；Schwarz，HP；Aguzzi，A(2000)；“Binding of disease-associated prion proteins to plasminogen”.Nature，408479-483]。朊病毒蛋白质与纤溶酶原的结合有赖于所述蛋白的构像，因为PrPC不能进行结合。血纤维蛋白原也能和PrPSc结合，但是缺乏Ca2+离子时则不能。
根据WO 02/00713，PrPSc与人纤溶酶原的特异性结合用于将PrPSc从CNS物质中分离出来。为此，将人纤溶酶原固定在磁性颗粒上。然而，这种方法仅适合检测体液和组织(不含纤溶酶原)中的PrPSc，但不适合，例如，检测血清中的PrPSc。这一方法的其它缺点是其费用昂贵以及载有纤溶酶原(plasminogen-loaded)的磁性颗粒的蛋白结合能力有限。
本发明的目的因此为提供一种可增加敏感性并使得能在活生物体中诊断TSE的方法。
本发明的目的通过专利权利要求中限定的主题实现。


图1图示了本发明使用固相偶联的β-折叠结合分子进行PrPSc的富集和检测的方法原理。
图2图示了微量滴定板模型(microtitre-plate format)(MTP)中的PrPSc结合实验的结构(实施例1)。各种β-折叠分解物(breaker)(BSB)肽被固定在载体上作为有效的β-折叠结合分子以及PrPSc捕获物；与样品物质共同温育后，结合的PrPSc使用单克隆抗-PrP抗体显示。
图3显示来自BSE阳性牛的脑匀浆中的PrPSc与KLVFF琼脂糖结合以后，各级分(fraction)中所含PrPSc的洗脱曲线。各级分中所含PrPSc的量是以半定量的方式，使用PlateliaBSE检测试剂盒测定的，并表示为光密度[OD]值。
图4显示对来自BSE阳性牛的房水和脑脊液样品中的PrPSc的检测的评估。在该实例中，肽KLVFF用于ELISA模型中作为PrPSc的捕获分子。所述检验是用针对PrPSc的单克隆抗体VB52(r-Biopharm，Darmstadt)和多克隆过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体进行的。

发明内容
本文术语“β-折叠结合分子(β-pleated-sheet-binding molecule)”描述了一种有机分子，因其三维结构和/或其物理性质，所述分子能够与蛋白质中的β-折叠结构，例如病理学改变的单体/寡聚体朊病毒蛋白质中的β-折叠结构相互作用，并且能够基于这种相互作用与它们结合。示例性β-折叠结合分子显示在SEQ ID NO1-10中。
本文术语“β-折叠分解物(BSB)”描述了短肽，其不仅与β-淀粉样蛋白(Alzheimer’s病中的蛋白聚集物)的β-折叠结构结合，而且还与淀粉样蛋白样结构结合，但也可阻断或逆转它们的异常折叠。
本文术语“病理学改变的朊病毒蛋白质”指PrPSc。PrPSc可以以单体和/或寡聚体的形式存在，也可以以原纤维状的(fibrillary)，淀粉样蛋白聚集体的形式存在。
于死后检测其脑干组织中的蛋白酶K-抗性PrPSc的牛在本文定义为“BSE阳性牛”。
本发明涉及检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)的方法，包括以下步骤a)将样品和固相载体一同温育，其中所述固相载体与β-折叠结合分子偶联；b)除去没有和β-折叠结合分子结合的样品组分；和c)检测与β-折叠结合分子结合的病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)。
根据本发明的方法，体液、细胞裂解物或身体组织中所含的单体和/或寡聚体病理学改变的朊病毒蛋白质被富集，使得可以显示甚至是最小的、至今不可检测的浓度的PrPSc。结果，活的动物或人在即使感染了激发TSE(TSE-triggering)的朊病毒后不久，就可定为感染。这在以前是不可能的，因为无法获得这样敏感的检验，且此外，所述检测只能在死后对脑组织进行，其中PrPSc的浓度足够高。此外，由于其高敏感性，该方法在身体组织例如脑匀浆中出现感染以后基本上较早的时间提供了结果，而现有的检测方法只有在感染已经进展到明显程度时才显示结果。
待研究的样品可以是体液，例如血液，血清，血浆，脑脊液，房水，泪液，尿液，唾液，淋巴液，乳汁，或细胞裂解物，例如来自白细胞或者来自淋巴组织的细胞的裂解物)，或组织匀浆(例如来自中枢神经系统组织，或来自淋巴组织(例如脾，扁桃体，淋巴结)或其它器官。
温育以前，样品可选地经过样品准备阶段。这对组织样品而言尤其必要。这些样品可以在加入适当的缓冲溶液(例如50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5)之后，例如使用超声或者核糖裂解物(ribolyser)处理，进行机械粉碎，然后进行匀浆，从而将其组分转变成溶液或者悬液。为了分离通过机械处理所得的组织或者细胞悬液中的固体组分，或者存在于体液中的固体组分，所述样品也可通过离心和/或过滤阶段。
经过或者不经过上述样品准备，所述样品可选地，附加地或者唯一地，可以经过蛋白酶处理以在温育之前通过蛋白水解分解PrPC。这主要是在待检测的PrPSc，例如单体和/或寡聚体形式的PrPSc，将是用抗体进行检测时进行，所述抗体仅能在蛋白酶处理之后从PrPC中分辨PrPSc。为此，使用蛋白酶处理所述样品物质，例如蛋白酶K。所述蛋白酶消化可以在各蛋白酶的标准条件下进行，或者根据制造商产品说明进行，优选在37℃进行1小时。使用的酶浓度可在大约10μg/ml到大约1mg/ml，这与样品物质有关，优选用大约50μg/ml的酶处理含有大约0.5到大约10mg/ml蛋白的样品物质。
固相载体可以是球形聚合物(例如琼脂糖凝胶，琼脂糖，或者乳胶)，塑料界面(例如微量滴定板)，硅胶包被的玻璃板(例如薄层层析)，毛细管或者膜。球形聚合物可以用作柱层析或者批量加工中的载体(例如磁性珠)。如果所述聚合物用于柱层析，它们优选用于预装好的(pre-packed)一次性柱。除了所列出的固相载体，任何可用于偶联β-折叠结合分子的固相载体都适合。
所述样品可以和固相载体所述固相载体例如玻璃板，微量滴定板在封闭的容器中一同温育大约5到约120分钟，其中温度范围从约4℃到约50℃。所述温育优选在低转动频率(例如80rpm)的温育摇床中在37℃进行1小时。通过将样品和固相载体一同温育，样品中所含PrPSc和固定在所述固相载体上的β-折叠结合分子结合。如果所述固相载体，例如球形聚合物，用于聚合物层析中，温育可在柱中进行。温育期根据柱而不同，与柱和仪器之间的连接以及样品的流通速率有关。
偶联于固相载体的β-折叠结合分子与PrPSc结合的亲合力比与PrPC结合亲合力的高得多，并且根据本发明能够捕获体液中出现的可溶的以及单体和/或寡聚物形式的PrPSc。根据本发明，β-折叠结合分子是由3到大约30个氨基酸组成的寡肽，优选由4，5或6个氨基酸组成的寡肽。这些肽可以在C末端和/或N末端经过修饰，例如为了获得改善的溶解性。除了其结合PrPSc的性质，β-折叠结合分子也可提供β-折叠分解物[BSB]的特性。然而，除了这些BSB性质，本发明的β-折叠结合分子提供对PrPSc的结合特性(亲合力，结合的可逆性)，使其能够从溶液中捕获并富集PrPSc。BSB肽与β-折叠结构结合过紧，或者以不可逆的方式结合，从而阻碍洗脱，所述BSB肽不适合作为β-折叠结合分子。BSB与PrPSc的结合亲合力太低，或者以非持久的方式结合(例如β-折叠结构分解后，从BSB中释放PrPSc)，其也不合适作为β-折叠结合分子。尤其优选的β-折叠结合分子在表1中显示，并列为SEQ ID NO1-10。B-折叠结合分子也可以是被取代的杂环芳香族，优选类黄酮(flavonoid)，例如硫代黄素(thioflavin)T，黄岑苷(baicalin)或栎苷(quercitrin)。
B-折叠结合分子优选通过共价键固定在固相载体上。β-折叠结合分子上的功能基团，例如氨基，羧基，或羟基用来实现与载体的偶联。如果β-折叠结合分子是肽，所述偶联优选通过在N末端的氨基或者C末端的羧基实现。如果寡肽是具有序列KLVFF(SEQ ID NO2)的五肽，所述偶联优选通过C末端的羧基形成，这是如果通过氨基进行偶联，多肽也可被固定在赖氨酸残基的侧链，从而导致PrPSc结合的位阻现象。
将样品与固相载体一同温育之后，去除不与β-折叠结合分子结合的样品组分，优选在洗涤阶段进行。具有适当的严谨度渐增的添加物的缓冲溶液用作洗涤溶液。洗涤溶液的pH值在中性范围以内，优选大约pH7.5。优选，使用50mM的磷酸盐缓冲液以缓冲所述溶液。另外，可在中性范围内调节pH值的任何缓冲液都适合。严谨度渐增的添加物可以是无机盐，例如NaCl，清洁剂(detergent)，例如SDS，Triton X 100或Tween 20，或离液剂，例如尿素，盐酸胍，或异硫氰酸胍。具有1-4M的NaCl的缓冲溶液优选用作洗涤溶液。
根据载体物质表面的性质，与β-折叠结合分子结合的PrPSc可选地从固相载体(例如在柱层析中使用球形聚合物时)洗脱出来。使用其它载体，例如膜或塑料界面，可直接在固相载体上检测PrPSc。然而，在这种情况下如需要也可进行洗脱。
为将PrPSc从β-折叠结合分子中洗脱，并相应地从所述固体载体上洗脱，使用极小体积的洗脱溶液冲洗所述载体。为了获得适合所用检测系统的敏感性的浓度作用，洗脱体积应该比样品体积小得多。
含有可分解PrPSc和捕获分子之间的连接的添加物的缓冲溶液用作洗脱溶液。洗脱溶液的pH值在大约pH6到大约pH8.5的范围内，优选大约7.5。优选使用50mM磷酸盐缓冲液缓冲所述溶液。或可在上述范围内，优选在中性范围内调节pH的任何缓冲液是适合的。所述添加物可以，例如是清洁剂，例如SDS，Triton X 100或Tween 20，离液剂(例如尿素，盐酸胍，或异硫氰酸胍)，无机盐例如NaCl。洗脱溶液优选含有清洁剂，例如5％的SDS。
随后，在前述阶段中富集的PrPSc可被检测。为此，可用免疫化学检测方法(例如ELISA，Western印迹，免疫沉淀)；生物物理检测法(例如质谱法，荧光关联光谱法(fluorescence correlation spectroscopy))；生物化学检测法(例如生化参数的测定，如相对摩尔质量，N末端或C末端氨基酸序列，结合配偶体的结合和解离常数)；或者生物检测法(例如细胞毒性实验)。
优选，所述检测使用可快速检测PrPSc的方法进行。所述方法可以是，例如免疫检测法，优选夹心-ELISA。使用已知的方法进行夹心ELISA。本文中，检测抗体例如酶(例如辣根过氧化物酶)，可用染过色的化合物，荧光染料(例如荧光素)，金颗粒或者核酸(例如DNA或RNA寡核苷酸)进行标记。
在酶标记的情况下，在底物转化之后通过光度计记录染料的强度，并且所述强度与样品中所含的PrPSc的量成正比。如果抗体标志是染色的化合物或者荧光染料，染料的强度或者其各自的荧光可直接测定。如果抗体标志是核酸，结合的抗体量可通过DNA或RNA标志的吸收而测定，其中所述信号使用PCR进行扩增(例如实时(real-time)PCR)。
本发明还涉及用于检测体液，细胞裂解物，组织匀浆或者其它液体中的PrPSc的试剂盒。根据本发明，所述检验试剂盒含有用于富集PrPSc的固相载体，免疫检测系统，溶解、洗涤和洗脱缓冲液浓缩物，各种对照，酶标抗PrP抗体，和相应的底物以及终止溶液。
所用固相载体优选是亲合力层析物质，例如琼脂糖凝胶，其可用于一次性柱中，或者塑料界面上(如微量滴定板)，根据本发明所述载体与β-折叠结合分子偶联。如果固相载体是具有本发明所述偶联的亲合力层析物质，其可包含于悬液中，以干的形式存在，或者已经装到检验试剂盒的一次性柱中。
免疫检测系统优选是夹心ELISA，其中第二固相载体，例如微量滴定板由PrP的特异性抗体包被，优选由单克隆抗PrP抗体包被，具体为小鼠抗PrP抗体。具体地，检测试剂盒中的固相载体以真空包装的形式提供。
以重组方式生产的PrP和/或PrP肽优选用作对照。辣根过氧化物酶优选用于标记抗体。
本发明的方法和试剂盒允许使用大量样品进行的大范围研究，例如用于医药和农业。在具有适当设备的实验室中，检测方法的自动化是可能的。通过与前述方法进行对比，本发明的方法也适合对活动物或人的TSE诊断。
具体实施例方式
本发明将参考以下实施例具体说明实施例1使用MTP形式的不同肽从脑匀浆中分离PrPSc微量滴定板(MTP)(Nunc-ImmunoTMPlate MaxisorpTMSurface，F96(Nunc，Roskilde，Denmark))，用表1中所列的肽进行包被(见图2)。所述包被通过每孔与100μl肽溶液(10μg/ml，0.1M碳酸盐缓冲液中，pH9.6)在4℃共同温育16小时进行。将液体通过真空吸出，并使用300μl洗涤缓冲液(PBS(10mM磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH7.2)；0.05％ Tween 20))洗涤各孔三次。游离结合位置通过与含0.5％的酪蛋白的洗涤缓冲液在室温共同温育1小时而封闭。
经过洗涤阶段以后(300μl洗涤缓冲液/每孔)，经包被的MTP用箔覆盖，并与100μl含PrPSc样品/每孔(来自BSE阳性动物的脑匀浆，其在Platelia中OD＞4.0；通过脑组织的免疫组织学研究确认为阳性发现)在37℃共同温育1小时。非结合的样品物质通过真空吸出，并使用300μl洗涤缓冲液/每孔洗涤3次。根据制造商产品说明，将具有检测抗体(PlateliaBSE Detection，Kit，Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)的培养物在室温温育1小时。通过300μl洗涤缓冲液/每孔洗涤五次以去除多余的检测抗体。加入底物溶液(N-四甲联苯胺(Tetramethylbenzidine)[TMB]，PlateliaBSEDetection Kit，Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)后30分钟时，通过加入1M H2SO4终止染色的进行，并通过在450nm进行消光度测定(对照620nm)记录染色强度。
测定的消光度和与肽结合的PrPSc的量成正比，并因此可测定捕获分子的效力。检测肽的相对结合效率总结在表1中，来自最佳β-折叠结合分子(肽2)的信号设定为100％。
表1各种肽的PrPSc结合效率比较

实施例2与MTP模型中的KLVEF结合的PrPSc的洗脱PrPSc与捕获分子之间的结合非常强，并且需要相对强烈的条件来从固相载体中洗脱PrPSc。洗脱条件使用MTP模型检测。
如实施例1，用肽2(KLVEF)包被MTP，并充满含PrPSc的脑匀浆(Platelia中OD＞3.0)。使用300μl洗涤缓冲液(PBS；0.05％Tween 20)/每孔洗涤3次后，每孔加入100μl强效(potential)洗脱缓冲液(见表2)，并在室温温育5分钟。随后，去除液体，并使用PlateliaBSE Detection Kit(Bio-RadLaboratories，Hercules，USA)测定洗脱缓冲液中洗脱的PrPSc的量和留在MTP上的PrPSc的量。对比洗脱效率(表2)显示只有含清洗剂的缓冲液(含5％SDS)适合完全从捕获分子洗脱PrPSc。在存在离液剂(例如6M尿素)的条件下，PrPSc只部分被洗脱。如果是具有低pH值(例如pH3)或者高离子强度(例如2MNaCl)的洗脱溶液，PrPSc几乎完全保持与捕获分子结合。
表2不同洗脱条件的对比


实施例3肽KLVFF与EAH琼脂糖凝胶的共价结合如果通过氨基结合，所述肽将固定于N末端和侧链(Lys)，这样可破坏三维结构。为此，β-折叠结合分子KLVFF与固相载体的特异性结合可通过所述肽C末端的羧基实现。EAH-琼脂糖凝胶4B(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)用作载体物质。
为准备结合反应，用0.5M NaCl洗涤EAH-琼脂糖凝胶，并且完全去除任何多余的液体。配体是具有KLVEF序列的五肽，其溶于水，终浓度为5mg/ml，并用HCl将pH调节到4.5。将凝胶重悬于配体溶液中(1份凝胶+2份配体溶液)，并加入EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)使其终浓度为0.1M。结合反应在室温进行24小时同时轻轻搅动(rotation)。随后，将上清完全从凝胶沉淀中去除。根据制造商产品说明，存在的任何游离结合位点在存在0.1M EDC的条件下，用1M乙酸封闭。充满KLVFF的凝胶被置于层析柱中(床体积1ml)，并交替用3×2ml缓冲液A(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH4)和3×2ml缓冲液B(0.1M tris/HCl，0.5M NaCl，pH8)洗涤，最后用10×2ml H2O进行洗涤。
实施例4通过KLVEF琼脂糖从脑匀浆中分离PrPSc为证明KLVEF-琼脂糖适合作为β-折叠结合分子，来自BSE阳性牛的脑匀浆的PrPSc与柱物质结合，并随后再次洗脱。使用BSE纯化试剂盒(Bio-RadLaboratories，Hercules，USA)根据产品说明制备脑物质。样品物质根据制造商产品说明溶解于样品稀释缓冲液R6中(PlateliaBSE Detection Kit，Bio-Rad实验室，Hercules，USA)(Platelia中的OD为6.0)。
使用1ml KLVFF-琼脂糖如实施例3所述制备drip column，并在室温用PBS充满和平衡。加入样品(250μl)后，用2ml PBS洗涤柱，并分别收集洗出物作为级分。结合的PrPSc随后由含1.5ml 5％SDS的PBS洗出。每个级分中所得的PrPSc量使用PlateliaBSE检测试剂盒通过免疫方法进行检测。
图3显示该实验的洗脱图线，并记录KLVFF-琼脂糖可逆性结合PrPSc，的能力，并从而获得该基质将从大体积的样品中选择性富集PrPSc的能力。在本文中，洗出物中所含的PrPSc是由于加样超过了该柱的适应能力，因为所用脑样品具有很高的PrPSc含量(Platelia中的OD为6.0)。洗脱中所得的信号由于洗脱缓冲液中SDS的ELISA中的干扰作用而降低。
实施例5通过MTP模型中的KLVEF从体液中分离PrPSc(朊病毒型体内BSE实验(Priontype in-vivo BSE-test))MTP(Nunc-ImmunoTMPlate MaxisorpTMSurface，F96(Nunc，Roskilde，Denmark))用肽KLVFF包被(图2)。所述包被是通过与100μl肽溶液(10μg/ml，0.1M碳酸盐缓冲液中，pH9.6)/每孔在4℃温育16小时进行的。随后，液体用真空吸出，并且用300μl洗涤缓冲液(PBS；0.05％Tween 20；pH7.2)/每孔洗涤3次。游离的结合位置通过与含0.5％的酪蛋白的洗涤缓冲液在室温温育1小时而被封闭。洗涤阶段(300μl洗涤缓冲液/每孔，3次)后，包被的MTP用箔覆盖，并与100μl含PrPSc的样品/每孔在室温温育1小时。
在该实验中，研究了来自9只BSE阳性牛和5只BSE阴性牛的房水样品，以及来自6只BSE阳性牛和13只BSE阴性牛的脑脊液样品。所有样品已经经过BSE纯化试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)准备。非结合的样品物质通过真空吸出，并且使用300μl洗涤缓冲液/每孔洗涤MTP三次。在室温与检测抗体(含5μg/ml V5B2的洗涤缓冲液，r-Biopharm，Darmstadt)温育1小时。随后，再次用300μl洗涤缓冲液洗涤该板三次，并在室温和山羊抗小鼠IgG过氧化物酶偶联物(1∶20000，洗涤缓冲液中，Jackson，USA)温育一小时。通过用300μl洗涤缓冲液/每孔洗涤5次去除多余的偶联物。加入底物溶液(TMB)后15分钟，通过加入1M H2SO4终止染色，并通过测定450nm的消光度(以620nm为对照)记录染色强度。测定的消光度与和肽结合的PrPSc的量成正比。如图4所示，与BSE阴性动物相比，从BSE阳性动物所得的值(t-检验)明显升高。房水样品中的阳性和阴性样品的之间的差异基本上比脑脊液样品之间的差异明显。这可以通过存在于相应体液中的PrPSc浓度解释。根据这些结果，房水比脑脊液更优选作为检测活动物体液内的PrPSc样品物质。
序列表<110>普里昂泰普两合公司(Priontype GmbH & Co.KG)凯瑟琳.施勒斯纳(SCHLEUSSNER，Cathrin)<120>富集和检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)的方法<130>LAB-001 PCT<140>PCT/DE 03/02249<141>2003-07-04<150>102 30 141.7<151>2002-07-04<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>β-折叠结合肽<400>10Arg Arg Ala Phe Phe Val1 权利要求
1.检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)的方法，包括以下步骤a)将样品和固相载体一同温育，其中所述固相载体与β-折叠结合分子偶联；b)去除不与β-折叠结合分子结合的样品成分；和c)检测与β-折叠结合分子结合的样品成分。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)前对所述样品进行蛋白酶处理。
3.前述权利要求之一的方法，其中所述固相载体是球形聚合物，塑料界面，硅胶包被的载玻片，毛细管或膜。
4.前述权利要求之一的方法，其中所述β-折叠结合分子是具有3-30个氨基酸残基的寡肽或者经过取代的杂环芳香族。
5.权利要求4的方法，其中所述寡肽提供根据SEQ ID NO1-10的氨基酸序列。
6.前述权利要求之一的方法，其中所述检测通过免疫检测法进行。
7.检测病理学改变的朊病毒蛋白质(PrPSc)的试剂盒，包括至少一种与β-折叠结合分子偶联的固相载体，洗涤溶液，洗脱溶液和检测系统。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述检测系统是免疫检测系统，并包含用抗PrP抗体包被的第二固相载体，酶标记的第二抗体，底物溶液和终止溶液。
9.权利要求7或8的试剂盒，其中一种固相载体包装在一次性柱中，并且所述第二固相载体是微量滴定板。
全文摘要
本发明涉及富集和检测活生物体的病理学改变的朊病毒蛋白质(PrP
文档编号C07K7/02GK1666106SQ03815590
公开日2005年9月7日 申请日期2003年7月4日 优先权日2002年7月4日
发明者克劳迪娅·恩格曼, 卡特加·霍施勒, 乔尔格·莱曼, 乔尔格·加伯特, 乌尔里克·克鲁姆莱 申请人:普里昂泰普两合公司, 凯瑟琳·施勒斯纳