专利名称：富含甘氨酸蛋白及其活性片段与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及富含甘氨酸蛋白及其活性片段与应用，特别涉及该富含甘氨酸蛋白及其活性片段在抗细菌中的应用。
背景技术：
20多年来，医药界没有发现任何新的抗菌素家族，但是抗药性现象的发展却极为迅速，尤其可怕的是，对付金黄色葡萄球菌的障碍刚刚攻克，美国医生就发现了对可有效抑制细菌的最新抗菌素—万古霉素具有抗性的菌株。致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽作为生物天然免疫的活性分子，被各种生物用来抵御来自外界病菌的侵染，在生物界中广泛存在。人为分离出来的天然抗菌肽表现出抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等特点，因而在医药工业、食品工业和农业上被认为有着广阔的应用前景。
抗菌肽是指由基因编码，在核糖体上合成的相对分子质量通常在10kDa以下，具有抗菌活性的多肽类物质，也叫多肽抗生素。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100℃下加热10～15min仍能保持其活性。抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。此外，研究发现不同家族的抗菌肽之间在序列上极少存在同源性，而同一家族的不同成员之间序列上却存在高度的保守性，这意味着其功能也非常保守。抗菌肽除了具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。抗菌肽在生物界中广泛存在。迄今为止，人们已经从细菌、真菌，到两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、直至人类体内发现了多达700种以上的多肽抗生素。目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前研究；此外，抗菌肽转基因动物、转基因植物，抗菌肽在食品防腐，鲜花保鲜，化妆品，种子包衣和动物饲料添加剂等方面的应用研究也正在进行之中。
鉴于抗菌肽在医药工业、食品工业和农业上有着广阔的应用前景，通过各种途径从生物界中寻找新型的天然抗菌肽就成为目前世界范围内热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种富含甘氨酸蛋白及其活性片段以及它们的抗菌用途。
本发明所提供的富含甘氨酸蛋白，名称为Glyrichin，选自(克隆自)下述蛋白质家族(Glyrichin家族)中的至少一种1)人Glyrichin(hGlyrichin)和鼠Glyrichin(mGlyrichin)均具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；2)黑猩猩(Pan troglodytes)Glyrichin具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；3)犬(Canis familiaris)Glyrichin具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；4)线虫(Caenorhabditis elegans)Glyrichin具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；5)拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)Glyrichin具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；6)斑马鱼(Danio rerio)Glyrichin具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列6的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质。
所述缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加的氨基酸残基的数目为1至10个，优选为1至5个，尤其优选为1至3个。
上述富含甘氨酸蛋白的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列8的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；2)具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列9的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；3)具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列10的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；4)具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列11的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽。
具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的多肽，名称为PEP1，来源于人，鼠，黑猩猩和犬；具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的多肽，名称为PEP2，来源于斑马鱼；具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的多肽，名称为PEP3，来源于线虫；具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的多肽，名称为PEP4，来源于拟南芥。
所述缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加的氨基酸残基的数目为优选为1至3个。
例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
所述取代方式优选为如表1所示的取代。
表1.Glyrichin蛋白家族可取代氨基酸列表
还可对本发明的富含甘氨酸蛋白及其活性片段进行修饰(通常不改变一级结构)。修饰形式包括体内或体外的多肽的化学形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
上述富含甘氨酸蛋白及其活性片段的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述富含甘氨酸蛋白为人Glyrichin和鼠Glyrichin，其编码基因具有序列表中SEQ ID №7的DNA序列或与序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码序列表中序列1的氨基酸残基序列的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中的序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的序列7由240个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端起第1位-240位碱基，编码具有序列表中序列1的人Glyrichin。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述富含甘氨酸蛋白及其活性片段的编码基因的表达载体，细胞系和工程菌也属于本发明的保护范围。
本发明的富含甘氨酸蛋白及其活性片段可用于抗细菌，具体包括以下几方面的用途1)用于制备抗菌药物；2)用于制备预防和/或治疗具有潜在细菌感染的不同种类生物用制品；3)用于生产抗病虫害的转基因生物；4)用于制备针对所述富含甘氨酸蛋白及其活性片段的衍生物或拮抗剂及其配体、抗体；5)用于研制调控家族成员蛋白表达的药物。
使用本发明的富含甘氨酸蛋白家族及其活性片段进行抗菌，具有抗菌活性高，抗菌谱广，靶菌株不易产生抗性突变等特点，有广阔的应用前景。
图1为富含甘氨酸蛋白家族人源基因的Northern Blot实验结果图2为全长hGlyrichin和5’-缺失体基因转化酵母后表达产物对大肠杆菌BL-21菌体外生长的抑制作用(A为S2放大图，B为S5放大图，C为AMP放大图，D为S12放大图，E为L4放大图)图3A为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌BL-21生长的影响图3B为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌HB101生长的影响图3C为pCM-19，pMG-19，pMG-16，pMT-7对大肠杆菌DH5α生长的影响图4为pCM-19多肽对减毒型鼠疫杆菌生长的影响图5为富含甘氨酸蛋白家族7条蛋白的多序列比对结果图6为hGlyrinchin的二级结构分析结果图7为hGlyrinchin信号肽分析结果8为PEP1，PEP2，PEP3和PEP4抗BL-21菌的试管法测试结果图9为PEP1，PEP2，PEP3和PEP4抗BL-21菌的菌落计数法测试结果图10为四种人工合成多肽与BL-21菌相互作用的流式细胞仪分析结果图11为四种人工合成多肽的溶血作用测试结果具体实施方式
发明人利用抑制性差减杂交的方法，对LTC(long term culture)培养前后的小鼠骨髓基质细胞差异表达基因进行了大量筛选，获得了131个差异表达的EST克隆。生物信息学分析证实，这些克隆代表了26种已知或部分已知功能的基因和7条全新的基因，其中5条具有完整的开放阅读框架，3条已在GenBank注册，鼠源的mL52(mGlyrichin)基因就是其中之一，该基因全长cDNA序列521bp，其GenBankTM注册号为AY028425。有关抑制性差减杂交实验及结果参见《实验血液学杂志》2002第10期第177-182页。
在得到鼠源mL52基因后，发明人根据mL52基因设计一对简并引物，采用实验室常规PCR法扩增人胎肝cDNA文库，获得人源具有完整ORF的序列共240bp(序列7)，以及根据ORF序列推测的氨基酸序列(序列1)，命名为人富含甘氨酸蛋白((hGlyrichin))。接着，采用Intnet-NCBI电子PCR基因定位法对该基因进行了染色体定位，证实其定位于人20q11.21区。采用NCBI-BlastN进行了基因组结构分析，提示该基因含有三个外显子和两个内含子。进一步，为了确定该基因转录本数目和大小进行了Northern Blot分析。结果证实，选用的四个细胞株均有该基因的表达，且只有大小为600bp左右的单一转录本(图1)。上述分析研究结果已经证实了富含甘氨酸蛋白基因的天然结构特性。
通过PCR引物设计，PCR扩增全长hGlyrichin基因和5′端缺失序列7的自5′端第1到第60位碱基的5′缺失体基因。将PCR扩增获得的全长hGlyrichin基因和5’-缺失体基因分别插入到pPIC9K酵母表达质粒(Invitrogen)的EcoRI和NotI之间，经转化大肠杆菌BL-21工程菌和克隆筛选，获得构建后分别带有全长和5’缺失的hGlyrichin基因的质粒。所获得的高纯度质粒经SalI内切酶线性化后，采用电转法转化GS115酵母菌，经含G418(50ug/ml)的MD平板筛选获得阳性克隆。将阳性克隆接种到含5ml BMGY培养基中，表达产物分泌于上清中，用上清作活性测试。活性测试采用琼脂平板扩散法，同时以氨苄青霉素作为活性对照。经过活性筛选，获得了表达全长hGlyrichin的阳性克隆(L4克隆)和表达5’-缺失hGlyrichin的阳性克隆(S2，S12和S5克隆)。L4，S2，S12和S5克隆的抑菌效果如图2所示，表明转化了无论含全长还是5’-缺失的hGlyrichin基因的阳性克隆(L4，S2，S12和S5)上清具有明显抑制琼脂板表面大肠杆菌BL-21生长的效果。上述实验结果证实，酵母表达系统可以表达hGlyrinchin蛋白，而且，表达产物具有抗菌活性；全长和5’-缺失的基因均表达活性蛋白，为进一步寻找代表该基因活性的确切结构奠定了牢固的基础。根据上述系列实验结果，业内人员极易利用类似方法进一步筛选获得具有相似活性的最小蛋白质分子。
上述实验结果说明酵母菌表达的hGlyrinchin蛋白具有抗菌作用后，发明人根据hGlyrinchin基因的氨基酸序列，分段合成了不同长度的多肽，从蛋白水平直接证明hGlyrinchin蛋白的抗菌作用和发现核心肽段。四条肽段的位置分别为hGlyrichin氨基酸序列的第31-46(pMG-16)，42-60(pCM-19)，53-59(pMT-7)，61-79(pMG-19)个氨基酸。所合成肽段的纯度为85-90％。上述肽段经用灭菌去离子水溶解后进行抗菌活性检测。采用的方法为Kirby-Bauer disk diffusion(DavidT.Kingsbury et al.Microbiology，2ndedition，ed by Harwal Publishing，1990，page 37)法。所采用的靶细菌为大肠杆菌BL21(图3A)，大肠杆菌HB101(图3B)和大肠杆菌DH5α(图3C)工程菌。图3A，图3B和图3C中标号1-5分别为pCM-1932、64、128、256和512μg，标号6为pMG-19 512μg，标号7为pMG-16 512μg，标号8为pMT-7 512μg，标号9为氨苄青霉素512μg，标号10为溶剂对照。由图中结果可以发现，上述四种多肽溶液在浓度相同的条件下，对三种靶菌的作用类似，同浓度时不同多肽溶液的抗菌作用差别较大，其中pCM-19和pMT-7具有较强抗菌作用，pCM-19比pMT-7更强。
上述实验结果证实，pCM-19具有确定的抗菌作用，但只是对工程菌有效。为了证实其是否对致病菌同样有效，将100μg/200ul和200μg/200ul pCM-19肽溶液分别加入到含有1×104CFU/200ul的减毒鼠疫杆菌液中，37℃作用1小时，然后将所有混合液涂布在1％琼脂板表面并继续培养3天。图4的结果表明，经pCM-19处理后的减毒鼠疫杆菌几乎完全失去了生长能力。说明pCM-19对减毒鼠疫杆菌同样有杀伤作用。
在证实hGlyrinchin及其多肽片段的抗菌作用后，发明人利用生物信息学手段对家族各成员进行了系列比较分析。首先进行了BlastP分析，获得了同源性计分值＞40的蛋白质序列共28条，其中不同真菌来源的15条，线虫有4条序列。为了验证上述同源序列在功能上的联系，分别选取了代表人、鼠、黑猩猩、犬属、线虫、拟南芥等7条蛋白序列进行进一步分析研究，这7条蛋白序列涵盖了从进化最高的智人至线虫乃至植物相当长的时空跨度。家族各成员的序列均来自GenBank，它们的注册号分别为CAC11117、AAK18748、XP_514807、XP_534406、CAB02486、AAH59661、NP_566324。
使用DNAMAN分析软件进行了上述各成员的多序列比对分析，所获结果如图5所示。图中结果反映出富含甘氨酸蛋白家族各成员的共同特点是存在一个高度保守的、大约65个氨基酸长度、富含甘氨酸的核心结构域，为确定富含甘氨酸蛋白家族提供了有力证据。在该结构域的上游或下游的序列同源性较低，该保守区的前半部分是明显的疏水区。到目前为止，该家族所有成员的功能均未知。
进一步采用多种Intnet共享软件对富含甘氨酸蛋白家族各成员的氨基酸序列特征进行了分析。结果如表2，这些特征与目前抗菌肽的普遍特征高度吻合，尤其符合阳离子抗菌肽的特征。
表2. 富含甘氨酸蛋白家族蛋白序列的基本特征
富含甘氨酸蛋白家族各成员二级结构预测采用了DNASTAR5.0软件，结果显示各成员的结构极为类似但不尽相同，7个成员中无一为单纯α螺旋结构，是一个以β片层结构为主间或有α螺旋结构的抗菌肽家族。代表性结果为hGlyrinchin，如图6所示。以Garnier-Robson模型为主分析的结果为Homo sapiens，Mouse，Pantroglodytes，Canis familiaris等4个成员不存在α螺旋，为β折叠型肽，Arabidopsis thaliana以β折叠为主，只在序列的氨基端有形成α螺旋的可能，Danio rerio和Caenorhabditis elegans为α螺旋-β折叠交替形式结构。亲、疏水性分析显示，都含疏水性区域，多数为两段疏水性区域与亲水性区域交替存在。家族各成员信号肽分析所用软件为http://www.cbs.dtu.dk/services/，除黑猩猩Glyrinchin序列无信号肽外，其它成员都有信号肽序列。各成员信号肽的位置分别在20-45及1-20位氨基酸之间，代表性结果(CAC11117)如图7。发明人还将家族中各成员与现有抗菌肽库(http://aps.unmc.edu/ap/main.html)进行了系统比较，均提示为抗菌肽。
上述生物信息学分析的结果证实(1)富含甘氨酸蛋白家族各成员间具有高度同源的保守序列，这些结构上的相似性高度提示了功能上相似性；(2)各成员的氨基酸组成及分子量相对较小、含信号肽序列、高等电点(pI)、带阳性电荷、富含某类氨基酸(甘氨酸)等特点符合大多数抗菌肽的特征；(3)与已有抗菌肽库数据库比较，均提示为抗菌肽。综上，生物信息学分析结果强烈提示天然富含甘氨酸蛋白家族的存在。依据生物信息学系统分析结果所得此结论在业界应有很高认可度。
鉴于富含甘氨酸蛋白家族各成员进化上高度保守的特点以及其功能未知的事实，发明人对该基因家族的功能开展研究，拟证实富含甘氨酸蛋白家族成员的功能及其用途。根据生物信息学综合分析结果，在各成员间选择了同源性差别较大的4条基因的高保守区域氨基酸序列，人工合成了相应的4条多肽序列，这些多肽序列代表了具有完全相同(人，鼠，狗，黑猩猩)或部分相同序列的7个物种的基因。四条肽段由吉尔生化(上海)有限公司合成，序列分别为来源于人、鼠、黑猩猩和犬的PEP1Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-Met-Arg-Gly-Arg-Glu-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Gly-Lys-Thr-Met-NH2(序列8)来源于斑马鱼的PEP2Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-Met-Arg-Gly-Arg-Glu-Leu-Met-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Thr-NH2(序列9)来源于线虫的PEP3Gly-Phe-Arg-Ala-Gly-Met-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Leu-Leu-Gln-Thr-Gly-Lys-Thr-NH2(序列10)来源于拟南芥的PEP4Ala-Ile-Arg-Val-Lys-Val-Pro-Gly-Leu-His-Lys-Val-Arg-Phe-Ile-Gly-Gln-Thr-NH2(序列11)各肽段的纯度分别为PEP1 88.7％，PEP2 91.1％，PEP3 87.3％和PEP4 90.2％。随后采用了试管法和集落计数法测定了四种多肽的抗菌效果。图8和图9结果显示，四种肽段均有抗BL-21菌生长的作用，其中PEP2的抗菌效果最佳，其次是PEP1和PEP4，较差的是PEP3。两种不同方法测试的结果显示，四种肽段抗菌作用的强弱趋势类似。
同一家族不同成员抗菌作用机理可能具有相似性。发明人采用pI荧光素跟踪抗菌肽与细菌相互作用过程中对细菌膜完整性的影响，通过流式细胞仪(FACS)检测随肽-菌相互作用时间延长，pI阳性细菌比例的变化。图10中结果表明，当细菌分别与不同肽溶液500ug/ml和pI25ug/ml在37℃共同作用20分钟后，其中PEP1、PEP4和PEP2溶液作用后的pI阳性细菌数分别达到35％、70％和94％左右，而溶剂对照和氨苄青霉素对照组的pI阳性细菌比例＜5％。PEP3溶液处理后pI阳性细菌比例与对照组类似。虽然，pI既可以掺入死亡后细菌也可以掺入细菌膜受损的细菌，但两者结果的差别显然表明，抗菌效价确定的氨苄青霉素的抗菌机理不是直接影响细菌膜结构的完整性，而受试肽溶液中的三种具有明显破坏细菌膜结构完整性的作用。此外，当以pET-22b(+)空载体转化后并获得氨苄青霉素抗性细菌为靶细菌进行同样的实验，所获得的结果与上一实验几乎完全一致，进一步证实了氨苄青霉素与上述抗菌肽作用机理的不同，也进一步证实了抗菌肽通过破坏细菌膜结构的完整性而发挥杀菌作用的机理，这一作用机理与现有大部分抗菌肽的作用机理相符。
已知部分抗菌肽具有溶血作用。为了证实富含甘氨酸蛋白家族不同成员在溶血作用方面的异同，发明人继续以代表7个不同物种的四条肽段进行了实验研究。图11的结果表明，四种合成肽段对人红细胞均无溶血作用。这一结果在一定程度上反映了同一家族不同成员间的共同性质之一。
上述研究结果表明(1)富含甘氨酸蛋白家族各成员的一级结构具有极高的相似性，全基因序列的同源性比较计分值达到40以上，而各成员间相对保守的65个左右氨基酸之间的同源性比较的计分值更高。不同蛋白质一级结构的相似性与它们在功能上的相似性高度相关在业界具有相当高的共识度；(2)家族各成员间的二级结构也具有极高相似性，其中5个为单纯β片层结构，α螺旋结构与β片层结构二者混合型2个，无单纯α螺旋结构。这些结构特征说明，富含甘氨酸蛋白家族是一个以β片层结构为主的抗菌肽家族；(3)家族各成员分子量较小、pI值较大、都带阳性电荷、富含某种氨基酸(甘氨酸/蛋氨酸)、含疏水区等特征与现有抗菌肽公认的普遍特征相符；(4)家族中各成员与现有抗菌肽库比较的结果均提示为抗菌肽；(5)来自于家族成员中7个物种的肽段均有不同程度的抗菌作用、作用机理相似且均无溶血作用。这些结果强烈提示富含甘氨酸蛋白家族的存在，家族成员的组成数至少在7个以上。
本发明中实验验证的同源序列只有7条，与hGlyrichin同源性比较计分值＞40的氨基酸序列有28条，业内人员极易采用本发明的类似方法证实其它高度同源序列的生物学活性并进而获得药用蛋白或多肽类药物。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的富含甘氨酸蛋白或其活性片段的编码基因表达或生产重组的富含甘氨酸蛋白或活性片段。如可按以下方法进行表达或生产(1)用含有上述富含甘氨酸蛋白或其活性片段的编码基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞；(2)培养所述宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达的质粒和载体都可以用。
表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Glyrichin编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。
本领域普通技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用所述重组表达载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，表达本发明的基因编码的富含甘氨酸蛋白或其活性片段。在上述方法中的富含甘氨酸蛋白或其活性片段可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白或其活性片段。在使用本发明Glyrichin蛋白或其活性片段时，还可同时使用其它药剂，如青霉素等抗菌素。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
在本发明中，术语“Glyrichin”、“Glyrichin家族成员”、“Glyrichin蛋白”或“Glyrichin多肽”可互换使用，都指具有天然抗菌肽Glyrichin家族各成员氨基酸序列(序列表1中序列1-6的蛋白或序列8-11的多肽)。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的天然抗菌肽Glyrichin家族成员，以及含有或不含有信号肽的Glyrichin成员蛋白。
家族中不同成员的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱变突变体。变异形式还包含富含甘氨酸蛋白及其活性片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了含甘氨酸蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有含甘氨酸蛋白多肽序列的至少约7-25个连续氨基酸，通常至少约35个连续氨基酸，更佳地至少约45个连续氨基酸，最佳地至少约60个连续氨基酸。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
下面以人源富含甘氨酸蛋白基因的克隆、鉴定、生物信息学分析及抗菌活性测试、作用机理分析和溶血作用为实施例，进一步阐述如何利用本发明的富含甘氨酸蛋白家族各成员。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、人源富含甘氨酸蛋白基因的克隆及鉴定1、人源富含甘氨酸蛋白基因完整ORF序列的获得根据鼠源富含甘氨酸蛋白基因设计如下一对简并引物扩增人胎肝cDNA文库，获得人源富含甘氨酸蛋白完整的ORF序列共240bp，以及根据ORF序列推测的氨基酸序列5’引物Pa5-CGATGCCGGTGGCCGTGGGTCCCT-33’引物Pb5-TTAGCATCGTATGCCCATTCCA-3PCR扩增条件为94℃、4分钟、1循环；94℃、40秒，60℃、50秒，72℃、1分钟，30循环；72℃、7分钟、1循环。PCR产物经过Winzard PCR prepspurification kit纯化，用T4连接酶重组到pGEM-T载体中，然后转化大肠杆菌JM109，测序鉴定。结果表明人Glyrichin基因具有序列表中序列7的核苷酸序列，编码序列具有表中序列1的氨基酸残基序列的富含甘氨酸蛋白人Glyrichin。
2、Northern blot鉴定培养人4种肿瘤细胞株HepG2、HeLa、Jurket和HEK293，然后用Winzard plusRNA purification kit(购自Promega公司)提取总RNA。各取20微克总RNA，在1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶上分离，并转到Hybond-N+尼龙膜。以HGlyrichin完整ORF为探针，用Promega公司的Prime-a-gene试剂盒标记。杂交结果如图1所示，表明人Glyrichin基因在所测试的4种不同组织来源的肿瘤细胞株中都有表达，提示它可能是一种广泛表达的天然抗菌肽。同时揭示只存在一个转录本，且大小约为600bp。
实施例2、hGlyrichin酵母表达及其表达产物杀菌活性的检测通过PCR引物设计(全长上游引物5’-AGGAATTCATGCCGGTGGCCGTGGGTCCCTAC-3’；5’缺失体上游引物5’-AGGAATTCATGGGCTTCGTGATGGGTTGC-3’；全长下游引物5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGCATCGGATGCCCATCCCA ATG-3’)，以含hGlyrichin全长的pET-22b质粒为模板，在全长上游引物和全长下游引物、5’缺失体上游引物和全长下游引物的引导下分别PCR扩增全长hGlyrichin基因和5′端缺失序列7的自5′端第1到第60碱基的5′缺失体基因。其PCR反应体系(除引物外)和反应条件同实施例1的步骤3。
将PCR扩增获得的全长hGlyrichin基因和5’-缺失体基因分别插入到pPIC9K酵母表达质粒(Invitrogen)的EcoRI和NotI之间，经转化大肠杆菌BL-21工程菌和克隆筛选，获得构建后分别带有全长和5’缺失的hGlyrichin基因的质粒。所获得的高纯度质粒经SalI内切酶线性化后，采用电转法转化GS115酵母菌，经含G418(50ug/ml)的MD平板筛选获得阳性克隆。将阳性克隆接种到含5ml BMGY培养基中，30℃摇床培养至OD600＝2.0-6.0时，然后用BMMY(含终浓度为1％的甲醇)培养基稀释到OD600＝1.0，继续培养。以后每24小时补加甲醇到终浓度为0.5％，诱导培养后不同时间取1ml加入到Eppendorff离心管中，离心3000rpm，留上清作活性测试。活性测试采用琼脂平板扩散法，即在含有1％琼脂的LB平板表面均匀涂布测试菌(大肠杆菌BL-21)，再在每个小方块中央放置直径约6mm的滤纸片，将15ul不同克隆上清滴加到纸片上，20分钟后等量加入，共加3次。37℃培养4小时观察抑菌环的大小以获得阳性克隆。同时以10ul浓度为100mg/ml的氨苄青霉素作为活性对照。经过活性筛选，获得了表达全长hGlyrichin的阳性克隆(L4克隆)和表达5’-缺失hGlyrichin的阳性克隆(S2，S12和S5克隆)。L4，S2，S12和S5克隆的抑菌效果如图2所示，表明转化了无论含全长还是5’-缺失的hGlyrichin基因的阳性克隆(S2，S5，S12代表5’-缺失hGlyrichin表达阳性克隆，L4代表hGlyrichin全长基因表达阳性克隆)上清具有明显抑制琼脂板表面大肠杆菌BL-21生长的效果。上述实验结果证实，酵母表达系统可以表达hGlyrinchin蛋白，而且，表达产物具有抗菌活性；全长和5’-缺失的基因均表达活性蛋白，为进一步寻找代表该基因活性的确切结构奠定了牢固的基础。根据上述系列实验结果，业内人员极易利用类似方法进一步筛选获得具有相似活性的最小蛋白质分子。
实施例3、人工合成不同长度hGlyrichin蛋白多肽的抗菌作用分析1、抗革兰氏阴性大肠杆菌的作用根据hGlyrichin基因的氨基酸序列，由吉尔生化有限公司分段合成了不同长度的多肽，四条肽段的位置分别为hGlyrichin氨基酸序列的第31-46(H3N+-Met-Ala-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Gly-Thr-Phe-Ser-Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-COO-，pMG-16)，42-60(序列8，pCM-19)，53-59(pMT-7，H3N+-Met-Gly-Gly-Ile-Gly-Lys-Thr-COO-)，61-79(pMG-19，H3N+-Met-Gln-Ser-Gly-Gly-Thr-Phe-Gly-Thr-Phe-Met-Ala-Ile-Gly-Met-Gly-Ile-Arg-Cys-COO-)个氨基酸。所合成肽段的纯度为85-90％。用无菌去离子水溶解成20mg/ml。抗菌实验采用的方法为Kirby-Bauer diskdiffusion(David T.Kingsbury et al.Microbiology，2ndedition，ed by HarwalPublishing，1990，page 37)法。将含1％的琼脂LB培养基平铺在高压灭菌后15cm直径的玻璃皿，琼脂冷凝后将OD600＝4.0的30μl菌液(大肠杆菌BL21，HB101或DH5 α)经LB稀释到2ml，分别均匀涂布在LB琼脂固体培养基表面，在每一划定的方格中放置一直径8mm的灭菌滤纸片，将15μl测试样品滴到滤纸片上。将平皿放置在37℃培养箱中培养4-10小时后，取出平皿观察结果，与氨苄青霉素阳性对照和溶剂(无菌去离子水)阴性对照组比较，以抑菌圈的大小判定结果。结果如图3A，图3B和图3C所示，表明上述四种多肽溶液在浓度相同的条件下，对三种靶菌的作用类似，同浓度时不同多肽溶液的抗菌作用差别较大，其中pCM-19和pMT-7具有较强抗菌作用，pCM-19比pMT-7更强。图3A，图3B和图3C中标号1-5分别为pCM-19 32、64、128、256和512μg，标号6为pMG-19 512μg，标号7为pMG-16 512μg，标号8为pMT-7 512μg，标号9为氨苄青霉素512μg，标号10为溶剂对照。
2、抗革兰氏阴性鼠疫杆菌的作用在含有1×104CFU/200μl减毒鼠疫杆菌(军事医学科学院流行病学研究所)的每根试管中分别加入200μl无菌去离子水(阴性对照)、100μg/200μl和200μg/200μl的pCM-19多肽溶液，37℃作用1小时，将全部混合液均匀涂布在1％琼脂板表面，继续培养3天。结果如图4所示，表明对照平板有大量鼠疫杆菌生长，而与100μg或200μg pCM-19多肽作用后的减毒鼠疫杆菌完全失去了生长能力。图4中，A为无菌去离子水对照；B为100μg作用组；C为200μg作用组。
实施例4、来源于不同家系成员的四种多肽抗菌作用的验证根据生物信息学分析结果，在富含甘氨酸蛋白家族中选择了人(与小鼠、犬、黑猩猩保守区氨基酸序列100％相同)、斑马鱼、线虫和拟南芥4种基因的高保守区、紧接疏水区后的18-19个氨基酸序列，委托吉尔(上海)生化有限公司合成相应的4条肽段PEP1、PEP2、PEP3和PEP4，序列分别为来源于人、鼠、黑猩猩和犬的PEP1Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-Met-Arg-Gly-Arg-Glu-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Gly-Lys-Thr-Met-NH2(序列8)来源于斑马鱼的PEP2Cys-Leu-Arg-Ile-Gly-Met-Arg-Gly-Arg-Glu-Leu-Met-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Thr-NH2(序列9)来源于线虫的PEP3Gly-Phe-Arg-Ala-Gly-Met-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Leu-Leu-Gln-Thr-Gly-Lys-Thr-NH2(序列10)来源于拟南芥的PEP4Ala-Ile-Arg-Val-Lys-Val-Pro-Gly-Leu-His-Lys-Val-Arg-Phe-Ile-Gly-Gln-Thr-NH2(序列11)各肽段的纯度分别为PEP1 88.7％，PEP2 91.1％，PEP3 87.3％和PEP4 90.2％。
用水作溶剂将4条肽段分别溶解成20ug/ul后置于-20℃备用。采用“试管法”和“集落计数法”分别测定了4种肽的抗菌作用。
试管法取OD600＝0.3时的E.coli BL-21菌5μl，加LB液体培养基至20μl，分别与四种肽液10μl(100μg)、对照组为水10μl、氨苄青霉素10μl(100μg)，在37℃孵育1小时后，将各管中的孵育混合液加入到含有6ml LB液体培养基的不同试管中，37℃，175rpm条件下培养，在接种后0-9小时之间，每小时取样测OD600值，动态观察四种肽对细菌生长的影响。每种肽、溶剂对照和氨苄青霉素对照均为3个样品。根据实验结果绘图。数据为3个样品的均数值加减标准差(图8)。结果显示，四种肽段均有抗BL-21菌生长的作用，其中PEP2的抗菌效果最佳，其次是PEP1和PEP4，较差的是PEP3。
集落计数法取OD600＝0.3时的E.coli BL-21菌液5μl加LB培养液至20μl后分别与四种肽液10μl(100μg)，在37℃孵育1小时后，取相当于200菌落的孵育菌液，加LB液体培养基至1.0ml，均匀涂于LB平板，37℃倒置培养12-18小时后计数菌落数。每条肽设3个平行孵育管。显示数据为3个样品的均数值加减标准差。对照组为溶解肽的溶剂，每组3个样品。结果如图9所示，四种肽段均有抗BL-21菌生长的作用，其中PEP2的抗菌效果最佳，其次是PEP1和PEP4，较差的是PEP3。
两种不同方法测试的结果显示，四种肽段抗菌作用的强弱趋势类似。
实施例5、来源于不同家系成员的四种多肽抗菌作用的机理分析分别取OD600＝0.5时的不含pET-22b(+)的大肠杆菌BL21菌液和含pET-22b(+)的E.coli BL-21(将pET-22b(+)转化大肠杆菌BL21，筛选得到的含有pET-22b(+)的大肠杆菌BL21-pET22b(+)/BL21)菌液各100μl，分别与四种多肽PEP1、PEP2、PEP3和PEP4溶液，每种多肽溶液100μl(200μg)，再加入PI(propidium iodide)至终浓度为25μg/ml，此时体系中肽的终浓度为500μg/ml，在37℃，160rpm下作用20分钟。对照组以溶剂或等量氨苄青霉素溶液取代肽溶液。孵育20分钟后的全部样品用生理盐水将多余的PI染液洗掉，并用500μl生理盐水重悬后进行流式细胞仪分析。测试结果以pI阳性着染细胞占分析细胞的百分数表示。结果如图10所示，表明当细菌分别与不同肽溶液500ug/ml和pI 25ug/ml在37℃共同作用20分钟后，其中PEP1、PEP4和PEP2溶液作用后的pI阳性细菌数分别达到35％、70％和94％左右，而溶剂对照(生理盐水)和氨苄青霉素对照组的pI阳性细菌比例＜5％。PEP3溶液处理后pI阳性细菌比例与对照组类似。虽然，pI既可以掺入死亡后细菌也可以掺入细菌膜受损的细菌，但两者结果的差别显然表明，抗菌效价确定的氨苄青霉素的抗菌机理不是直接影响细菌膜结构的完整性，而受试肽溶液中的三种具有明显破坏细菌膜结构完整性的作用。此外，当以pET-22b(+)空载转化后并获得氨苄青霉素抗性细菌为靶细菌进行同样的实验，所获得的结果与上一实验几乎完全一致，进一步证实了氨苄青霉素与上述抗菌肽作用机理的不同，也进一步证实了抗菌肽通过破坏细菌膜结构的完整性而发挥杀菌作用的机理，这一作用机理与现有大部分抗菌肽的作用机理相符。
实施例6、来源于不同家系成员的四种多肽的溶血作用测试新鲜抗凝正常人全血经生理盐水洗3遍后，用生理盐水重悬8％(v/v)，取100μl重悬液分别与100μl不同肽溶液、100μl生理盐水、10μl去离子水加90ul生理盐水、100μl 0.1％TritonX-100混匀，37℃孵育1小时后离心1000g，5min，取上清测570nm处吸光值。每种肽溶液设125ug/ml，250ug/ml和500ug/ml三个浓度。每一测试组设3个平行样品。所得实验结果绘图。数据以3个样品的均数加减标准差表示。结果如图11所示，表明四种合成肽段对人红细胞均无溶血作用。这一结果在一定程度上反映了同一家族不同成员间的共同性质之一。图中，水表示10μl去离子水加90ul生理盐水对照组。
序列表<160>11<210>1<211>79<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculu5)<400>1Met Pro Val Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln Pro Ser Cys Phe1 5 10 15Asp Arg Val Lys Met Gly Phe Val Met Gly Cys Ala Val Gly Met Ala20 25 30Ala Gly Ala Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg35 40 45Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Met Met Gln Ser Gly50 55 60Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly Ile Arg Cys65 70 75<210>2<211>211<212>PRT<213>黑猩猩(Pan troglodytes)<400>2Met Cys His Leu Arg Glu Arg Val Arg Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gly1 5 10 15Gln Glu Gly Ser Gly Ile Phe Ser Cys Val Ala Ala Arg Arg Gly Gln20 25 30
Val Arg Ala Ser Arg Arg Ala Gly Pro Glu Arg Thr Ala Gln Ala Gln35 40 45Pro Pro Ser Gly Arg Arg Gly Leu Arg Pro Trp Ser Arg Cys His Arg50 55 60His Cys Arg Pro Pro Pro Ser Gly Ser Glu Gln His Gly Pro Ala Gly65 70 75 80Arg Ala His Leu Pro Lys Pro Leu Gln Ser Trp Ala Pro Gly Ser Arg85 90 95Lys Cys Cys Pro Ala Leu Arg Lys Arg Phe Ile Gly Pro Arg Ala Pro100 105 110Ser Pro Ser Phe Ser Val Arg Asp Val Glu Leu Ser Asp Arg Gly Arg115 120 125Glu Arg Gly Glu Met Pro Val Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln130 135 140Pro Ser Cys Phe Asp Arg Val Lys Met Gly Phe Val Met Gly Cys Ala145 150 155 160Val Gly Met Ala Ala Gly Ala Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg165 170 175Ile Gly Met Arg Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Met180 185 190Met Gln Ser Gly Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly195 200 205Ile Arg Cys210<210>3<211>124<212>PRT<213>犬(Canis familiaris)<400>3
Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gly Leu Pro Arg Thr1 5 10 15Leu Arg Phe Ala Pro His Pro Ala Ser Ser Gly Pro Arg Pro Gly Trp20 25 30Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Pro Asn Leu Arg Thr Pro Gln Met Pro Val35 40 45Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln Pro Ser Cys Phe Asp Arg Val50 55 60Lys Met Gly Phe Val Met Gly Cys Ala Val Gly Met Ala Ala Gly Ala65 70 75 80Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg Gly Arg Glu85 90 95Leu Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Met Met Gln Ser Gly Gly Thr Phe100 105 110Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly Ile Arg Cys115120<210>4<211>82<212>PRT<213>线虫(Caenorhabditis elegans)<400>4Met Pro Val Pro Ser Gly Tyr Ala Ala His Pro Gln Gly Ser Gln Pro1 5 10 15Ser Cys Phe Thr Lys Ile Arg Met Gly Leu Met Met Gly Ala Met Ile20 25 30Gly Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Gly Gly Phe Met Gly Phe Arg Ala35 40 45Gly Met Arg Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Thr Gly Lys Thr Val Ala50 55 60
Gln Ser Gly Gly Ser Phe Gly Val Phe Met Gly Val Ala Gln Gly Leu65 70 75 80Arg Cys<210>5<211>74<212>PRT<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>5Met Ala Lys Asn Ser Cys Leu Ala Lys Ile Thr Ala Gly Val Ala Val1 5 10 15Gly Gly Ala Leu Gly Gly Ala Val Gly Ala Val Tyr Gly Thr Tyr Glu20 25 30Ala Ile Arg Val Lys Val Pro Gly Leu His Lys Val Arg Phe Ile Gly35 40 45Gln Thr Thr Leu Ser Ser Ala Ala Ile Phe Gly Leu Phe Leu Gly Ala50 55 60Gly Ser Leu Ile His Cys Gly Lys Gly Tyr65 70<210>6<211>80<212>PRT<213>斑马鱼(Danio rerio)<400>6Met Pro Val Ser Val Gly Ser Tyr Gly Gln Gln Ala Gln Pro Ser Cys1 5 10 15Phe Asp Arg Val Lys Met Gly Phe Met Met Gly Phe Ala Val Gly Met20 25 30Ala Ala Gly Ala Met Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg Ile Gly Met
35 40 45Arg Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Met Gln Ser50 55 60Gly Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly Ile Arg Cys65 70 75 80<210>7<211>240<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>7atgccggtgg ccgtgggtcc ctacggacag tcccagccaa gctgcttcga ccgtgtcaaa 60atgggcttcg tgatgggttg cgccgtgggc atggcggccg gggcgctctt cggcaccttt 120tcctgtctca ggatcggaat gcggggtcga gagctgatgg gcggcattgg gaaaaccatg 180atgcagagtg gcggcacctt tggcacattc atggccattg ggatgggcat ccgatgctaa 240<210>8<211>19<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、犬(Canis familiaris)<400>8Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly5 10 15Lys Thr Met19<210>9<211>18<212>PRT<213>斑马鱼(Danio rerio)
<400>9Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Val Gly5 10 15Lys Thr18<210>10<211>18<212>PRT<213>线虫(Caenorhabditis elegans)<400>10Gly Phe Arg Ala Gly Met Arg Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Thr Gly5 10 15Lys Thr18<210>11<211>18<212>PRT<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>11Ala Ile Arg Val Lys Val Pro Gly Leu His Lys Val Arg Phe Ile Gly5 10 15Gln Thr18
权利要求
1.富含甘氨酸蛋白，选自下述蛋白质家族中的至少一种1)人Glyrichin和鼠Glyrichin均具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；2)黑猩猩Glyrichin具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；3)犬Glyrichin具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；4)线虫Glyrichin具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；5)拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)Glyrichin具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质；6)斑马鱼(Danio rerio)Glyrichin具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列6的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的富含甘氨酸蛋白，其特征在于所述缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加的氨基酸残基的数目为1至10个，优选为1至5个，尤其优选为1至3个。
3.权利要求1或2所述的富含甘氨酸蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述富含甘氨酸蛋白为人Glyrichin和鼠Glyrichin，其编码基因具有序列表中SEQ ID №7的DNA序列或与序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码序列表中序列1的氨基酸残基序列的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中的序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体，细胞系和工程菌。
6.权利要求1所述的富含甘氨酸蛋白的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列8的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；2)具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列9的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；3)具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列10的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；4)具有序列表中序列11的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列11的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽；所述缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加的氨基酸残基的数目为优选为1至3个。
7.权利要求6所述的富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因。
8.含有权利要求6所述的富含甘氨酸蛋白的活性片段的编码基因的表达载体、细胞系和工程菌。
9.权利要求1或2所述的富含甘氨酸蛋白及其编码基因在抗细菌中的应用。
10.权利要求6所述的富含甘氨酸蛋白的活性片段及其编码基因在抗细菌中的应用。
全文摘要
本发明公开了富含甘氨酸蛋白及其活性片段与应用。本发明所提供的富含甘氨酸蛋白，选自下述蛋白质之一序列表中序列1－6的氨基酸残基序列的蛋白质或将序列表中序列1－6的氨基酸残基序列经过1至20个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至20个氨基酸残基且具有抗细菌作用的蛋白质。该富含甘氨酸蛋白的活性片段，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽具有序列表中序列8－11的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中序列8－11的氨基酸残基序列经过1至5个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代以及在羧基末端和/或氨基末端添加1至5个氨基酸残基且具有抗细菌作用的多肽。本发明的富含甘氨酸蛋白及其活性片段可用于抗菌。
文档编号C07K14/435GK1699416SQ200510076908
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者赵士富 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所