专利名称：一种番茄rna病毒寄主因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与其在植物抗病毒育种上的应用。
背景技术：
番茄是一种重要的水果型蔬菜。在其生长发育过程中，容易受到各种病害的危害，其中以病毒性病害最为严重。目前报道的侵染番茄的病毒大多数是RNA病毒，其中最常见的RNA病毒有7种，即黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟草花叶病毒(Tabacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)和番茄褪绿斑病毒(Tomatochlorotic spot virus，TCSV)。
由于病毒是严格的专性寄生物，至今还没有严格选择性的化学药剂能有效地用于植物病毒病的防治。在生产实践中主要以清除毒源和切断病毒的传播途径、用化学药剂杀死介体昆虫和培育抗病新品种等预防性措施来控制病毒病的危害，其中以培育抗病新品种最为经济有效。然而，常规的抗病育种方法过程繁琐，需要大量的人力物力，更重要的是抗病基因常与不良农艺形状基因连锁，难以达到抗病优质的生产要求；另一方面，抗性基因资源的缺乏也限制了常规育种方面的应用。植物基因工程在育种上的应用为植物病毒病的防治开辟了新的途径(Powell A.P.，N elson R.S.，HoffmanN.，et al.Delay of disease development in transgenic plants that express thetobacco mosaic virus coat protein gene.Science，1986，232738-743)。目前获得抗病毒转基因植株的方法主要有两种一是将来源于病毒自身的基因或基因的调控序列(如病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因及其片段、运动蛋白基因及其3’或5’端非编码区、病毒反义RNA、核酶基因以及病毒卫星RNA等)导入受体植物，从而获得病毒起源的抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株(Lomonossoff G.P.，1995.Pathogen-derived Resistance to Plant Viruses，Annu.Rev.Phytopathol.，33323-343)，但是利用这种方法得到的抗病毒植株一般表现为垂直抗病性，而且，这一方法存在一定的潜在的危险因素，即用于转化植物的病毒序列有可能与田间存在的病毒发生重组，从而产生新的病毒；另一种方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)来获得抗病毒植物(Goldbach R.，Bucher E.，and Prins M.2003.Resistancemechanisms to plant virusesan review.Virus Research.，92207-212)。
对病毒寄主因子基因的研究，为抗病毒基因工程提供了一条新的途径。寄主因子(Host Factors)是指在病毒侵染过程(包括病毒入侵、病毒基因表达、病毒粒子装配及释放等)中寄主细胞提供给病毒的一切便利条件，也称寄主蛋白(host proteins)或细胞蛋白(cellular proteins)。寄主细胞内如果缺少这些寄主因子，病毒便不能复制或复制的效率大大降低(Ahlquist P.，Noueiry，A.O.，and Lee，W.M.，et al.，2003.Host Factor in Positive-Strand RNA Viruses Genome Replication.Journalof Virology，77(15)8181-8126.)。因此，通过抑制或沉默寄主细胞中支持病毒复制的基因，将有可能使其不支持病毒在寄主细胞内的复制和维持，从而获得广谱性的抗病毒植株。
发明内容
本发明的目的是提供一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因。
本发明所提供的番茄RNA病毒寄主因子，名称为ToTOM1，来源于番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有支持病毒复制作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由288个氨基酸残基组成。包含多个高疏水性的区域，推测该蛋白是一种具有6-7个跨膜结构域的跨膜蛋白，与拟南芥AToTOM1基因在氨基酸水平上的同源性为74.9％。
编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸也属于本发明的保护范围。
番茄RNA病毒寄主因子的编码基因(ToTOM1)包括番茄RNA病毒寄主因子的cDNA基因和番茄RNA病毒寄主因子的基因组基因。其基因组基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由6727个碱基组成，具有11个外显子和10个内含子，自5′端的第1-158位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第838-928位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第1015-1067位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第1941-2033位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第2109-2180位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第3052-3131位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第3236-3274位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第3498-3561位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5′端的第5842-5895位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5′端的第6342-6419位碱基为该基因组基因的第十个外显子，自5′端的第6497-6727位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5′端的第9-11位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第6587-6589位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第159-837位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第929-1014位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第1068-1940位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第2032-2108位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第2181-3051位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第3132-3235位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第3273-3497位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5′端的第3562-5841位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5′端的第5996-6341位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5′端的第6420-6496位碱基为该基因组基因的第十个内含子。
其cDNA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №3由1282个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第31-897位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；上述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述番茄RNA病毒寄主因子编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增番茄RNA病毒寄主因子编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗病毒植物的方法。
本发明所提供的培育抗病毒植物的方法，是将ToTOM1的反义基因片段或ToTOM1的RNA干扰表达载体导入植物中，得到转基因植株。
可按照植物基因工程领域中的常规方法，将ToTOM1的反义基因片段或ToTOM1的RNA干扰表达载体导入转化植物细胞或组织，如农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法等。被转化的植物宿主既可为茄科、十字花科或葫芦科的植物。
本发明所提供的番茄RNA病毒寄主因子ToTOM1是一种RNA病毒在植物体内存活的相关蛋白，通过转反义基因片段或RNA干扰的方法沉默植物体内的该蛋白的编码基因可得到抗病毒的植物。转基因植株的抗病性实验结果显示，转ToTOM1反义RNA的转基因番茄显著抑制了CMV在番茄中的积累量，与对照非转基因植株相比，发病时间明显推迟，症状也显著减轻，此外，转ToTOM1的RNA干扰质粒的转基因番茄植株TMV的积累量也比对照非转基因番茄显著减少，表明番茄ToTOM1是CMV和TMV的一个寄主因子基因，通过抑制或沉默ToTOM1可获得抗CMV和TMV的番茄品种。本发明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM1及其抑制该基因表达的方法，在抗病毒植物培育和育种中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
图1为ToTOM1的3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图2为含ToTOM1的3’RACE产物的重组质粒的BamH I和Xho I酶切鉴定图谱图3为ToTOM1的5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳图谱图4为含ToTOM1的5’RACE产物的重组质粒的EcoR I酶切鉴定图谱图5为PCR扩增的ToTOM1的基因组基因片段的琼脂糖凝胶电泳图谱图6为含ToTOM1的基因组基因片段的重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱图7为含ToTOM1基因片段的重组质粒的酶切鉴定图谱图8为转基因用植物表达载体pBI121图9为PCR扩增的ToTOM1基因组片段的琼脂糖凝胶电泳图谱图10为外源片段在pUCm-T中连接方向的酶切鉴定图谱图11为ToTOM1的植物转化质粒pBIT1-2的酶切鉴定图谱图12为PCR扩增的用于构建RNA干扰表达质粒的ToTOM1 cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱图13为重组质粒pUCGAT1(-370)的酶切鉴定图谱图14为RNA干扰中间载体pUCGAToTOM1(RNAi-370)的酶切鉴定图谱图15为RNA干扰表达质粒pBIToTOM1(RNAi-370)的Pst I酶切鉴定图谱图16为转化有反义ToTOM1的抗Kn番茄植株的PCR鉴定图谱图17为PCR鉴定转化有反义ToTOM1的阳性植株的Southern杂交检测结果图18为抗卡那霉素的表达RNA干扰片段的转基因植株的35S、NOS、内源ToTOM1基因和NPTII基因的PCR检测结果图19为PCR反应阳性的独立RNA干扰转基因植株的Southern杂交图谱图20为接种CMV 10天后非转基因植株图21为接种CMV 10天后反义RNA转基因植株图22为接种CMV 25天后非转基因植株图23为接种CMV 25天后表达反义RNA转基因植株具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用番茄品种为购自广西农科院的“超级大明星”。
实施例1、番茄寄主因子基因ToTOM1的全长cDNA序列的克隆1、ToTOM1 3’端cDNA的克隆根据GenBank搜寻到的与拟南芥AtTOM1[gi9967414]具有一定同源性的番茄EST序列BE458681(528nt)[gi9502983]设计两条正向引物扩增ToTOM1 3’端的cDNA序列，引物序列如下Tomato Tom1-A5’CTCCCTTTGTGCTTCC-TATGGTCT 3’；Tomato Tom1-15’GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC 3’利用3’RACE System for Rapid Amplication of cDNA Ends试剂盒(Invitrogen公司，目录号18373-027)合成ToTOM1 3’端的cDNA序列。提取番茄的总RNA，反转录合成其第一链cDNA，以此第一链cDNA为模板，在引物Tomato Tom1-A和上述试剂盒提供的引物AUAP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’引导下，进行第一次PCR，再以第一次PCR产物为模板，在引物Tomato Tom1-1和引物AUAP的引导下，进行第二次PCR，反应结束后对PCR进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNA Ladder，泳道1为ToTOM1的3’RACE产物)，表明扩增出一条长度约1000bp的特异性条带。回收该特异性PCR产物，将其与载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选后挑选阳性克隆提质粒，用限制性内切酶BamHI和Xho I进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1为ToTOM1的3’RACE PCR片段，泳道2-5为含ToTOM1的3’RACE PCR片段的重组质粒的BamH I和Xho I酶切产物)，表明克隆到的长度约1000bp的ToTOM1的3’RACE PCR片段已正确插入到载体TOPO TA中，将该重组载体命名为pCToT1-3。对pCToT1-3进行DNA序列测定，测序结果表明所插入的DNA片段长度为1077bp，具有序列表中SEQ ID №3的自5’端第206-1282位的DNA序列，该DNA片段的3’端具有长度为15个碱基的poly(A)尾。
2、ToTOM1 5’端cDNA的克隆根据GenBank搜寻到的与拟南芥ATOM1具有一定同源性的番茄EST序列BE458681(528nt)[gi9502983]设计两条正向引物扩增ToTOM1 5’端的cDNA序列，引物序列如下Tomato Tom1-25’CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’；
Tomato Tom1-B5’TCCTGAGCTTATCTGTTGGTAAACTCCTAGCCT-3’利用SMARTTMRACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech公司，目录号K1881-1)合成ToTOM1 5’端的cDNA序列。提取番茄的总RNA，反转录合成其第一链cDNA，以此第一链cDNA为模板，在引物Tomato Tom1-2和上述试剂盒提供的引物UPM5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’的引导下进行第一次PCR，再以第一次PCR产物(稀释100倍)为模板，在引物Tomato Tom1-B和引物NUP5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’的引导下进行第二次PCR，反应结束后对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为100bp DNA Ladder Plus泳道1为ToTOM1的5’RACE产物)，表明扩增出一条长度约500bp的特异性条带。回收该特异性PCR产物，将其与载体TOPO TA连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选后挑选阳性克隆提质粒，用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1为ToTOM1的5’RACEPCR片段，ToTOM1的3’RACE PCR片段，泳道2-5为含ToTOM1的5’RACE PCR片段的重组质粒的EcoR I酶切产物)，表明克隆到的长度约500bp的目的片段已正确插入到载体TOPO TA中，将该重组载体命名为pCToT1-5。对pCToT1-5进行DNA序列测定，测序结果表明所插入的DNA片段长度为448bp，具有序列表中SEQ ID №3的自5’端第1-448位的DNA序列。
3、ToTOM1全长cDNA的获得对步骤1和步骤2获得的5’RACE PCR片段和3’RACE PCR片段进行序列分析，分析结果表明两片段具有一段长度为243nt的重叠区，此重叠区在步骤2获得的5’RACE PCR片段的5’端的第279位碱基处有一个限制性内切酶Mun I的酶切位点，在载体pCToT1-3和pCToT1-5的序列上有一个限制性内切酶Xha I的酶切位点。利用Mun I和Xba I两个酶切位点将3’RACE和5’RACE的cDNA连接起来，得到ToTOM1的全长cDNA。对该全长cDNA进行测序，测序结果表明该序列具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中SEQ ID №3由1282个核苷酸组成，3’端具有长度为15个碱基的poly(A)尾。用Vector NTI软件对ToTOM1全长的cDNA序列进行序列分析，分析结果表明其开放阅读框架(ORF)为自5’端第31-897位碱基，其5’端非编码区长度为30个碱基，3’端非编码区长度为385个碱基，编码序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列，将ToTOM1与拟南芥AtTOM1编码的氨基酸残基序列进行同源性比较，ToTOM1与拟南芥AtTOM1在氨基酸水平上的同源性为74.9％。用Kyte & Doolittle的方法(Kyte & Doolittle，A simple method for displaying the hydropathiccharacter of a protein，J Mol Biol，157(1)105-132)对ToTOM1编码的蛋白质的疏水性进行分析，结果表明ToTOM1编码的蛋白质具有高疏水性的区域，推断该蛋白是一种具有6-7个跨膜结构域的跨膜蛋白。
实施例2、番茄ToTOM1基因组片段的克隆根据已获得的番茄ToTOM1的全长cDNA序列及其编码区的自5’端第23-45位碱基序列和自5’端第1035-1012位碱基序列设计引物扩增ToTOM1的基因组序列，引物序列如下ToTOM 1-D5’-GAGCTGAAATGGCTAGGTTGCCG-3’；ToTOM 1-E5’-CGTTGAATCTTTGCCTTTCCGCAG-3’以番茄的总DNA为模板，在引物ToTOM1-D和引物ToTOM1-E的引导下，进行PCR扩增，反应结束后对PCR进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1为PCR扩增的ToTOM1的基因组片段)，表明扩增出一条长度约6.7kb的特异性条带。回收该特异性扩增产物，将其克隆到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)中，对其进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6所示(泳道1为CKpCR2.1-TOPO，泳道1-6为含有ToTOM1基因组片段的重组质粒)，然后用限制性内切酶Sac I和Xba I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图7所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1为含有ToTOM1基因组基因片段的重组质粒的Sac I和Xba I酶切产物)，表明克隆到的长度约6.7kb的目的片段已正确插入到载体pCR2.1 TOPO中，将含有该目的片段的重组质粒命名为pT1DE-9。对pT1DE-9进行DNA序列测定，测序结果表明ToTOM1的基因组基因具有序列表中SEQ ID№2的多核苷酸序列，该序列由6727个碱基组成，将其与ToTOM1的全长cDNA序列进行比对，比对结果表明ToTOM1的基因组基因具有11个外显子和10个内含子，自5′端的第1-158位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第838-928位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第1015-1067位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第1941-2033位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第2109-2180位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第3052-3131位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第3236-3274位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第3498-3561位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5′端的第5842-5895位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5′端的第6342-6419位碱基为该基因组基因的第十个外显子，自5′端的第6497-6727位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5′端的第9-11位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第6587-6589位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第159-837位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第929-1014位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第1068-1940位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第2032-2108位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第2181-3051位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第3132-3235位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第3273-3497位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5′端的第3562-5841位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5′端的第5996-6341位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5′端的第6420-6496位碱基为该基因组基因的第十个内含子。
实施例3、转基因番茄植株的获得一、植物表达载体的构建本实施例中所用的二元表达载体为pBI121(Clontech)，其物理图谱如图8所示，具有T-DNA整合的必需序列，以卡那霉素抗性基因作为选择标记基因，从多克隆位点插入的外源基因由CaMV 35S启动子控制。
1、含有ToTOM1基因组基因反义片段的植物表达载体的构建根据实施例2克隆的番茄ToTOM1的cDNA序列，设计一对特异引物Tomato Tom1-1(5’-GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC-3’)和Tomato Tom1-2(5’-CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’)。以番茄的总DNA为模板，在引物Tomato Tom1-1和引物Tomato Tom1-2的引导下，进行PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示(泳道M为1Kb DNA Marker，泳道1为PCR扩增产物)，表明扩增出一条长度约2.6kb的特异性条带。回收该特异性扩增产物并进行两端测序，测序结果表明该DNA片段为ToTOM1的一段核苷酸片段。将回收的ToTOM1的特异性扩增产物经纯化后克隆到载体pUCm-T(上海生工)中，并用限制性内切酶Kpn I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图10所示(泳道M为1Kb DNA Marker，泳道1为回收片段与pUCm-T的正向连接产物，泳道2为回收片段与pUCm-T的反向连接产物的Kpn I酶切产物，泳道3为回收片段与pUCm-T的正向连接产物的Kpn I酶切产物)，表明该基因片段分别以正向与反向的形式连接到载体pUCm-T中，将其中反向连接的重组质粒命名为pUT1-2。将已克隆在pUT1-2中的ToTOM1片段用限制性内切酶EcoR V和Xba I切下，经凝胶电泳后回收该DNA片段，将其连接到经Sma I和XbaI双酶切的载体pBI121上，得到ToTOM1的植物转化质粒pBIT1-2，对其用限制性内切酶HindIII进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图11所示(泳道M为1kb DNA Marker，泳道1为未经酶切的重组质粒pBIT1-2，泳道2为pBIT1-2的HindIII酶切产物)，表明ToTOM1的DNA片段已正确连接到载体pBI121中，获得了构建正确的ToTOM1的植物表达载体。
2、番茄ToTOM1的RNAi干扰表达质粒的构建根据番茄ToTOM1的全长cDNA序列设计两条引物，引物序列如下ToTOM1-RNAi-2F(879-899)CCTCAGATCTGCACAATACCACCCAAT(划线部分碱基为Bgl II识别位点)；ToTOM1-RNAi-2R(1258-1227)CCTCACTAGTAAAGGAGATCCAGAACATC(划线部分碱基为Spe I识别位点)以含有番茄ToTOM1全长cDNA的质粒为模板，在引物ToTOM1-RNAi-2F(879-899)和引物ToTOM1-RNAi-2R(1258-1227)的引导下，进行PCR扩增，得到两端分别含有限制性内切酶Bgl II和Spe I识别位点的ToTOM1的cDNA片段，命名为TT1，该DNA片段的1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图12所示(泳道M为GeneRuler 100bp DNAladder，泳道1为TT1)，表明扩增到了370bp的DNA片段，与预期结果一致。回收该片段，将其用限制性内切酶Bgl II和Spe I双酶切后克隆到经同样酶双酶切的RNA干扰载体pUCGA(构建方法以马铃薯总DNA为模板，在引物GA-F5’-AGGGAGCTCCTCGAGACTAGTAGATCTGGTACGGACCGTACTACTCTATTCG-3’(划线部分碱基依次为限制性内切酶Sac I、Xho I、Spe I和Bgl II的识别位点)和引物GA-R5’-AGGGGATCCCTATATAATTTAAGTGGAAAAAAAGGTTAAC-3’(划线部分碱基为限制性内切酶BamHI的识别位点)的引导下进行PCR扩增，得到马铃薯GA20氧化酶基因的第一个内含子片段(199bp)，对该片段用Sac I和BamH I酶切，与经同样酶双酶切的载体pUC18(TaKaRa公司)连接，将获得的重组载体命名为pUCGA)上，得到含有该回收片段的重组载体，命名为pUCGAT1(-370)，对该重组载体用限制性内切酶Pst I进行酶切鉴定，结果如图13(泳道M为GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1为pUCGA的Pst I酶切产物，泳道2为pUCGAT1(-370)的Pst I酶切产物)所示，表明该回收DNA片段已正确连接入载体pUCGA中。用限制性内切酶Xba I和BamHI对pUCGAT1(-370)进行双酶切后，再与经Bgl II和Spe I双酶切的TT1连接，得到ToTOM1的重组RNA干扰中间质粒，命名为pUCGAToTOM1(RNAi-370)。对该重组RNA干扰中间载体用限制性内切酶Pst I进行酶切鉴定，结果如图14所示(泳道M为GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1为pUCGAT1(-370)的Pst I酶切产物，泳道2为pUCGAToTOM1(RNAi-370)的PstI酶切产物)。将连有ToTOM1的RNA干扰片段TT1的RNA干扰质粒pUCGAToTOM1(RNAi-370)用限制性内切酶Sal I酶切后补平，再用限制性内切酶Spe I进行酶切，经1.2％琼脂糖凝胶电泳后回收长度约900bp的小片段，将回收片段连接到经限制性内切酶EcoR V和Xba I双酶切的载体pBI121上，得到番茄ToTOM1的RNAi干扰植物表达质粒，命名为pBI121ToTOM1(RNAi-370)，将其用限制性内切酶Pst I进行酶切鉴定，结果如图15所示(泳道M1为GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道M2为GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1为pBI121的Pst I酶切产物，泳道2为pBIToTOM1(RNAi-370)的Pst I酶切产物)，表明获得了构建正确的番茄ToTOM1的RNAi干扰植物表达质粒。
二、番茄的遗传转化1、三亲结合将植物表达质粒pBIT1-2导入农杆菌分别将含植物表达质粒pBIT1-2的大肠杆菌与含有辅助质粒pRK2073的大肠杆菌和农杆菌EHA105进行三亲本结合(Rogers S.G.，Horsch R.B.，and Fraley R.T.1986.Gene transfer in plantproduction of transformed plants using Ti-plasmidvectors.Methods Enzymol.，118627-640)，在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素的LA平板进行筛选，得到含有植物表达质粒pBIT1-2的农杆菌转化子。
2、番茄的遗传转化1)用含表达质粒pBIT1-2的农杆菌EHA105感染外植体将步骤1获得的含植物表达质粒pBIT1-2的农杆菌在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素的YEB平板上划线，置于28℃恒温中培养约24h，长出菌落后挑取单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃恒温摇床(200转/分)培养约24h至OD600为04-0.6，转入无菌离心管中，3000rpm离心10min，弃上清液，将收集的菌体用MS培养液清洗一次并重新悬浮，稀释50倍后用于番茄的转化。参考JavierPozueta-Romero等人的方法(Pozueta-romero，J.，Houlnè，G.， ，L.，et al.2001.Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants forAgrobactereium-mediated transformation.Plant cell，Tissue and organ culture.，67173-180)制备Flamingo Bill外植体，具体方法为将番茄的种子一个个地分开，用蒸馏水洗3次，然后用80％乙醇浸泡并不停地搅动2分钟，另加4-6滴100％的Tween-80，倒去乙醇溶液，再用无菌水洗涤2-3次加入有效氯为1％的NaClO溶液和4-6滴100％Tween-80在搅拌器上搅动15分钟，把NaClO溶液倒去，用无菌水洗2次，再重复二次，直至番茄种子的颜色由褐色变为金黄色，用无菌水冲洗6-10次，在无菌滤纸上晾干。晾干后把种子接入装有1/2MS培养基(含1.5％的蔗糖)的培养瓶中，在25-28℃的光照培养箱中培养7天，再把培养瓶放在超净台中，打开盖子，并补充培养瓶中的水分，使无菌苗在开放的环境下培养15个小时，然后将培养的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去，只留一侧子叶，另外将无菌苗的大一部分根系切去只保留长度为2-3cm的胚根作为外植体。
将外植体放入活化的含表达质粒pBIT1-2的农杆菌EHA105的MS液体培养基中(另加终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮)，不停地摇动10分钟，取出后用无菌水冲洗两次，然后一根根地放入倒有MS共培养培养基(在MS基本培养基的基础上添加玉米素0.15mg/L和吲哚乙酸0.05mg/L)的15cm直径的大培养皿中，封口，在光照培养箱中培养2天。
2)分化诱导培养2天后，将含表达质粒pBIT1-2的农杆菌EHA105转化后的外植体转接入分化筛选培养基中(在MS基本培养基的基础上添加了ZT 0.15mg/L，IAA 0.05mg/L，Km 50mg/L和Cef 200mg/L)，继续在光照培养箱中培养2-3个星期，培养条件为25-28℃，15小时光照，9小时黑暗。
3)转基因植株的生根、炼苗及移栽将在分化筛选培养基中生长正常的植株(长到高度约2-3cm)从愈伤组织上切下，插入生根培养基中(在MS基本培养基的基础上添加了Km 50mg/L，Cef 150mg/L，NAA 0.2mg/L)，25-28℃，15小时光照，9小时黑暗条件下培养直至生根。待再生苗的根系长约3cm时将培养瓶的盖子打开并补充水分，在25-28℃，光照条件为15小时/天下，放置3-4天，然后将植株慢慢地拔出，洗净根部所带的琼脂，移植到土壤中，保持土壤的湿度，并将温度控制在25-30℃。
用上述同样方法将番茄ToTOM1的RNAi干扰表达质粒转化番茄植株。
三、转基因植株的分子鉴定1、反义RNA转基因植株的分子鉴定共获得19株卡那霉素(Kn)抗性反义RNA转基因植株。在盆栽前对小苗进行外源基因的PCR检测，具体方法为取抗Kn的转基因番茄植株叶片，用CTAB法提取番茄植株叶片的总DNA，并以此为模板，在引物Tomato-ToTOM1-1和根据35S启动子序列设计的一条引物序列5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’的引导下，进行PCR检测，结果如图16所示(泳道M为lambda/HindIII+EcoRI，泳道1-19为用转化有反义ToTOM1的不同转基因植株的总DNA为模板的PCR扩增产物，泳道20为阳性对照，以质粒pBIT1-2为模板的PCR扩增产物)，表明19株中有12株转基因植物中能扩增出大小约为3300bp的外源目的基因片段。将PCR鉴定的阳性转基因番茄植株命名为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12，编号分别对应图16中的泳道1、2、3、4、7、8、9、10、13、14、17和19。
将PCR鉴定的阳性转基因植株进行盆栽，4个星期后提取其总DNA，用Sal I酶切后经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，通过向下毛细管法转移到杂交膜上，与P32标记的以Tomato-ToTOM1-1以及35S启动子上的一条引物5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’获得的PCR片段进行Sonthern杂交，结果如17所示(泳道M为1kb DNA marker，泳道CK为非转基因植株，泳道T1-T12为不同的转基因株系)，表明除了出现内源ToTOM1的杂交带外(图中箭头所示)，还有外源ToTOM1的杂交带，所有PCR检测阳性的植株均有外源ToTOM1片段的插入。由Sal I酶切片段显示的大小差异判断，一半以上的转基因植株的外源基因片段插入到染色体的不同位点，即属于不同的转基因株系。部分植株的插入片段大小相近(如T1、T3)，不易判断，还需用其它酶切后再进行杂交分析才能确定。不过，番茄的染色体碱基数目巨大，外源基因插入到同一位置的可能性极小，所以，所得到的转基因植株有可能均是不同的株系。图17还显示出大多数转基因植株是单拷贝的，但有3株是双拷贝的(T4、T9、T10)。
2、RNA干扰转基因植株的鉴定共获得93株抗卡那霉素的RNA干扰转基因植株。盆栽前作初步的PCR检测，在引物Kam-R5’-GATCTGGATCGTTTCGCATG-3’和引物Kam-F5’-AAGGCGATAGAAGGCGATGC-3’的引导下扩增NPTII，在引物NOS-F5’-TGCTACCHAHCTCHAATTTC-3’和NOS-R5‘-ACGACGGCCAGTGAATTCCC-3’的引导下扩增NOS，在引物35S-F5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’和ToTOM1-RNAi-2F(的引导下扩增35S，在引物TA-TOM1-15’-GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC-3’和TA-TOM1-25’-CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’的引导下扩增ToTOM1，其中63株抗性植株的NPTII、NOS、35S和内源ToTOM1基因检测为阳性，部分检测结果如图18所示(泳道M为GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1-5为抗性植株的35S检测(泳道1-5依次为MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道6-10为NOS检测(泳道6-10依次为MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道11-15为内源ToTOM1检测(泳道11-15依次为MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道16-20为NPTII基因检测(泳道16-20依次为MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)。将阳性植株进行盆栽。一个月后用同样的方法进行检测，结果在32株中仅有3株(MLC-TOTOM1-RNAi370-71，-79和-80)仍有阳性信号。提取这3株呈阳性转基因植株的总DNA，用EcoR I完全酶切后经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，通过向下毛细管法转移到杂交膜上，与P32标记的RNA干扰TT1片段进行Sonthern杂交，结果如图19所示(泳道M为GeneRuler 1kb DNAladder，泳道ck(-)为非转基因番茄的EcoR I酶切产物，ck(+)为pBITOTOM1RNAi-370的EcoR I酶切产物，泳道1为MLC-TOTOM1-RNAi370-80，泳道2为MLC-TOTOM1-RNAi370-79，泳道3为MLC-TOTOM1-RNAi370-71)，表明除了4.2kb的内源杂交带外，所有的转基因植株均出现一条大小不同的第二条杂交带，证明RNA干扰片段已整合到番茄基因组上。
实施例4、转基因植株的抗病性检测一、反义RNA转基因植株的抗病性实验采用摩擦接种法，用黄瓜花叶病毒(CMV)对实施例3获得所有5-6叶期转基因番茄进行摩擦接种，以相同生长期的非转基因番茄为对照。
1、症状表现接种CMV 10天后，非转基因的番茄实生苗对照开始出现花叶症状，新长出的叶片明显失绿(图20)，而转基因植株表现正常(图21)；二十五天时，对照非转基因植株的症状已非常严重，新长出的叶片几乎完全失绿，而且新叶畸形(图22)。此时的转基因植株虽然也表现症状，但比对照要明显减轻，叶片仅有些褪绿(图23)。
2、转基因番茄植株内病毒相对量的测定以苋色藜为枯斑寄主，用生物定量法测定转基因番茄植株内病毒相对含量。接种二十天后，取番茄植株的部分新叶(约0.5g)磨成匀浆，分别接种到枯斑寄主植物苋色藜的叶片，每个处理接2张叶片，设2个重复，五天后统计枯斑的数目并进行差异显著性分析。结果如表1所示，表明以转基因番茄为接种源，在苋色藜上形成的枯斑数均显著低于对照实生番茄植株。其中转基因植株T9形成的枯斑数(34.5个/叶)仅为对照(119个/叶)的29％。不同的转基因株系在苋色藜上形成的枯斑的数量有明显的差异，如T1植株的枯斑数(68.5个/叶)比T9植株(34.5个/叶)高出近1倍。枯斑试验表明，转反义ToTOM1番茄的CMV浓度要明显低于非转基因番茄。
表1 转反义ToTOM1基因番茄在枯斑寄主苋色藜上的生物定量
二、表达RNA干扰片段转基因植株的抗病性实验采用摩擦接种法，用烟草花叶病毒(TMV)对实施例3获得的3株RNA干扰转基因植株(5-6叶期)进行接种实验，以处于相同生长期的的非转基因番茄为对照，观察并记录结果，结果表明接种10天后，非转基因番茄苗呈现斑驳症状，而转基因植株无任何症状表现。接种70天后，非转基因植株仍表现为斑驳症状，转基因植株仍无任何症状表现。75天后，称取转基因植株和对照植株的新生叶(倒数第三张新生叶)0.1g，用DAS-ELISA法测定转基因植株内的病毒含量，具体方法为样品加1ml包被缓冲液(0.015 M Na2CO3，0.035 M NaHCO3，pH9.6)磨成匀浆，稀释1000倍后进行检测，检测结果如表2所示，表明所有的转基因植株内TMV的浓度均明显低于非转基因植株。
表2 表达ToTOM1 RNA干扰片段转基因植株的TMV的DAS-ELISA定量
序列表<160>3<210>1<211>288<212>PRT<213>番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)<400>1Met Ala Arg Leu Pro Leu Gly Ser Ser Pro Ile Asp Ile Ala Gly Pro1 5 10 15Val Thr Asn Trp Trp Asp His Val Asn Glu Ser Val Gln Trp Gln Asp20 25 30Gly Ile Phe Tyr Ser Leu Cys Ala Ser Tyr Gly Leu Val Ser Ala Val35 40 45Ala Leu Ile Gln Leu Ile Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Glu Tyr Gly50 55 60Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe His Leu Met Asn Phe Val Val Asn Gly65 70 75 80Val Arg Ala Ile Val Phe Gly Phe His Lys His Val Phe Leu Leu His85 90 95Tyr Lys Val Leu Thr Leu Ala Ile Leu Asp Leu Pro Gly Leu Leu Phe100 105 110Phe Ser Thr Phe Thr Leu Leu Val Leu Phe Trp Ala Glu Ile Tyr His115 120 125Gln Ala Arg Ser Leu Pro Thr Asp Lys Leu Arg Ile Ser Tyr Ile Ala130 135 140Ile Asn Gly Ala Ile Tyr Phe Ile Gln Ala Cys Ile Trp Val Tyr Leu145 150 155 160Trp Ile Asn Asp Asn Ser Thr Val Glu Phe Ile Gly Lys Ile Phe Met165 170 175
Ala Val Val Ser Val Ile Ala Ala Leu Gly Phe Leu Leu Tyr Gly Gly180 185 190Arg Leu Phe Leu Met Leu Arg Arg Phe Pro Ile Glu Sar Lys Gly Arg195 200 205Arg Lys Lys Leu His Glu Val Gly Ser Val Thr Ala Ile Cys Phe Thr210 215 220Cys Phe Leu Ile Arg Cys Phe Val Val Val Leu Ser Ala Phe Asp Ser225 230 235 240Asp Ala Ser Leu Asp Val Leu Asp His Pro Val Leu Asn Leu Ile Tyr245 250 255Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser Ala Leu Val Leu Tyr Ile Leu260 265 270Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Val Ser Ala Gln Tyr His Pro Ile Ser275 280 285<210>2<211>6727<212>DNA<213>番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)<400>2gagctgaaat ggctaggttg ccgcttgggt cgtcgccgat tgacatcgcc ggtccggtga 60ccaactggtg ggaccacgtc aacgaatccg ttcagtggca agatgggatt ttctactccc120tttgtgcttc ctatggtctt gtttcagcag ttgccctagt aagtttctct ttctcttcca180ttctcttttt ctgctctgta gatatgtaaa gattggtttt ttctttcctt tttgtgaatt240tcacgatcaa agtagagttt gggagctgaa atgccggaat tgatgttaga tgatttatat300tttcaactcc tactaatttg atgttgagat gcagttgata gaattgcagt gtctagttca360tgtataaagt caagtacttg ctgttagttg tttttttttt cgtaacttct gttaaaaatg420gaaaatcttg gttggtcaac tgtaggaatg aaataatgga gtagggaatc agacgagaat480gtttgattac caagtgcaat ttaggggttt ccattaagac aaattacggt atattttgtg540cttttttatg tcgctaataa aagtttggag cagtggactg actggttaat catacttctg600gtaggttcgg ttagatggtt agtatttggg agtactcctt ttgtgtgtgc ttgtgaagct660
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1.一种番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有支持病毒复制作用的蛋白质。
2.权利要求1所述的番茄RNA病毒寄主因子的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其基因组基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其cDNA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2或3或4所述编码基因的表达载体。
6.含有权利要求2或3或4所述编码基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3或4所述编码基因的宿主菌。
8.一种培育抗病毒植物的方法，是将ToTOM1的反义基因片段或ToTOM1的RNA干扰表达载体导入植物中，得到转基因植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述被转化的植物宿主为茄科、十字花科或葫芦花科的植物。
10.权利要求2或3或4所述编码基因在培育抗病毒植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与应用。其目的是提供一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与其在植物抗病毒育种上的应用。该番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有支持病毒复制作用的蛋白质。通过转反义基因片段或RNA干扰的方法沉默植物体内的该蛋白的编码基因可得到抗病毒的植物。本发明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM1及其抑制该基因表达的方法，在抗病毒植物培育和育种中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号C07K14/415GK1709908SQ20051007665
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者陈保善, 程海荣, 蒙姣荣, 刘遥测, 林海燕 申请人:广西大学