专利名称：融合表达含有二硫键蛋白质的方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种在真核宿主细胞中正确表达重组蛋白质的方法和应用，特别是正确表达生物活性与二硫键(链内和链间)的形成密切相关的真核重组蛋白质。
背景技术：
早在七八十年代有文献报道，发现一种后翻译酶(Post-I^anslational Enzymes) -—Prolyl 4-hydroxylase,即脯氨酰基_4_羟化酶，简称P4H。它能够对胶原家族蛋白的特征重复序列(Gly-X-Y) n中的Y进行羟化修饰(当Y是脯氨酸残基时)，成为羟脯氨酸。只有当一定数量的脯氨酸残基被修饰成4羟脯氨酸以后，胶原蛋白的三条多肽链才能正确折叠成三螺旋结构域，也就是说只有被羟基化的胶原蛋白才可溶，才能正确折叠成有活性的蛋白。(Prockop et al.，N. Engl. J. Med. 311 :376-386 (1984).)脯氨酰基-4-羟化酶，P4H是以α 2 β 2四聚体的形式存在的。(Berg et al. , J. Biol. Chem. 248 :1175-1192(1973) ；Tuderman e t al. , Eur. J. Biochem. 52 9-16(1975).)其中，α亚基包含有4脯氨酰基羟化的活性位点，是具有催化活性的部分。但是α亚基在没有β亚基存在时不可溶，也没有活性；而β亚基单独能够催化二硫键的形成，提高蛋白的稳定性，有助于蛋白的正确折叠，被称作二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，即PDI)。当形成四聚体以后，β亚基仍然保留有50 %的二硫键异构活性。 (Pihlajaniemi et al. , Embo J. 6 :643-649(1987) ；Parkkonen et al. , Biochem. J. 256 1005-1011(1988) ；Koivu et al.，J.Biol. Chem. 262 :6447-6449(1987))。由于对胶原家族蛋白有翻译后修饰作用，近年来，脯氨酰基-4-羟化酶成为世界各国研究的热点。美国、加拿大、芬兰、澳大利亚、日本等国均有相关研究。其中，芬兰的科学家Kari. Kivirikko在对脯氨酰基_4_羟化酶与各类型胶原蛋白的关系方面有十分卓著的研究成果，他有多篇论文和相关专利(美国)发表。Kari. Kivirikko关于脯氨酰基_4_羟化酶的最近一篇专利(美国)发表于2005 年7月观日(U. S. Pat. NO. 2005/0164345A1)。在该专利中，他描叙了在酿酒酵母表达系统、 甲醇酵母表达系统、昆虫细胞表达系统中，用重组人脯氨酰基-4-羟化酶(P4H)协助表达重组人胶原蛋白或胶原蛋白原的方法。其中对重组人胶原蛋白Type I、TypeII、TypeIII、 TypeIV、TypeXIII、TypeX V、TypeX VIII在昆虫细胞中表达系统中表达、和重组人胶原蛋白 TypeIII在酵母表达系统中表达作了比较详细的介绍。另一篇发表于2002年的美国专利(U. S. I^at. N0. 6，451，557B1)，则通过表达重组人胶原蛋白TypeIII为例，详细描叙了用酵母宿主菌共同表达重组人脯氨酰基_4_羟化酶 (P4H)和重组人胶原蛋白的方法。而最近的一篇发表于今年QOlO年)的美国专利，是由台湾学者Chou，et al.的 (U. S. Pat. NO. 7279329)做出的，描叙了利用与重组人脯氨酰基_4_羟化酶(P4H)在昆虫细胞株中的共表达，来分泌表达XXI型胶原蛋白的NCl区(C-terminal noncollagenous (NCl)
4domain)的方法。以上这些工作，指出了重组人脯氨酰基-4-羟化酶(P4H)在细菌、酵母和昆虫细胞表达系统中，对胶原蛋白家族的蛋白表达时的促进作用。也为我们表达胶原类蛋白，以及其它一些活性与二硫键的形成密切相关的真核重组蛋白质，提供了一条思路。但是，在实际实验工作中我们发现，构建重组人脯氨酰基-4-羟化酶(P4H)两个亚基(α和β)的共表达载体，方法较为繁琐；并且，在工业上使用较多的真核表达系统毕赤酵母宿主菌(Pichia pastoris)中，重组人脯氨酰基_4_羟化酶(P4H)单独的表达量很低， 四聚体蛋白难以被检测(Myllyharju et al. ,EMBO J. 16，1173-1180，1997)。实现四聚体蛋白与目的蛋白在同一宿主细胞中的共同表达也很难达到满意的效果。为了解决这一问题， 我们把研究重点由人脯氨酰基-4-羟化酶(P4H)四聚体蛋白转向了其中的β亚基，也就是重组人蛋白质二键异构Bl (human protein disulphide isomerase) 对于许多蛋白来讲，二硫键的形成通常是蛋白正确折叠的基础(Derman et al. (1993)Science262 :1744。7)。而蛋白正确折叠的过程需要依靠其它蛋白因子或折叠酶的辅助作用，这类蛋白因子或折叠酶被称作分子伴侣(foldase and chaperone)。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)是折叠酶中的一种，它的家族成员广泛存在于哺乳动物中，它们常见于细胞内质网，主要职能是催化内质网中新生肽链的二硫键的形成、异构及还原，进而帮助肽链正确折叠成有活性三级结构。它是目前发现帮助蛋白质折叠活性最高的折叠酶。另外在内质网相关的蛋白质降解途径ERAD蛋白质转运、钙稳态、 抗原提呈及病毒入侵等方面它们也起重要作用(ELLGAARDL，RUDDOCK L W. EMBO Rep, 2005, 6:28-32.)。基于PDI蛋白作为脯氨酰基-4-羟化酶(P4H)四聚体蛋白的β亚基，和作为折叠酶的这些关键特性，我们相信，它应该能够从基因工程的层面，为我们提供一个解决生物工程研发和生产蛋白类药物的过程中广泛存在的包涵体(Inclusion Bodies, IB)问题的方法。毕赤酵母(Pichia pastoris)是工业上使用较多的真核表达系统，由于它培养方便，产量高，成本低等特点，被广泛地用来做表达外源蛋白的真核宿主。虽然，毕赤酵母本身同样带有 PDI 蛋白(TIAN G, XIANG S, NOIVA R, et al. Cell，2006，124 :61-73.)，能够辅助表达蛋白的折叠，但在实际应用中发现，仍旧有大量外源蛋白在毕赤酵母中不表达，或者表达量极低。采用多拷贝或改用酵母偏好密码子等方法仍然不能改变这一状况。经过多次尝试后，我们试着从重组蛋白本身寻找原因。由于我们的重组蛋白多半来源于哺乳动物，例如人源的蛋白就非常广泛，而哺乳动物细胞内广泛存在着自己的蛋白质二硫键异构酶，这些酶与酵母菌的蛋白质二硫键异构酶同源性并不高。由此推测，在毕赤酵母体系表达的重组蛋白，在缺少相对应来源的折叠酶的情况下，无法折叠成它们的天然结构，从而导致了上叙问题。于是我们设想，在酵母宿主中，用融合的方式表达重组人源蛋白质二硫键异构酶(hPDI)和目的蛋白(特别是人源蛋白)，即将人蛋白质二硫键异构酶全长蛋白或者其突变体，以直接或者通过连接肽Linker连接的方式，连接在目的蛋白的N端， 实现融合表达。这样设计的好处，一来是能够利用hPDI蛋白在毕赤酵母中的高表达特性， 详见本人专利(申请号201010567613. 5) JfhPDI蛋白作为引导序列，带出目的蛋白分泌表达；二来，突变后的hPDI蛋白具有-HDEL尾巴，更有利于定位酵母宿主细胞的内质网膜， 使目的蛋白在hPDI的辅助下形成正确的二硫键，进而折叠成正确的构象；再者，融合在目的蛋白N末端的hPDI蛋白，也避免了毕赤酵母表达产物的N端不均一现象(Boehm，Τ.，et al. Yeast 15，563. 572)，保护了目的蛋白的完整性。这一设想，经过我们对来自于人胶原家族的几个蛋白Endostatin、Tumstatin, Canstatin、ArrestiruAngiostatin进行所述方式的融合表达，——得到了验证。
发明内容
本发明的内容是提供一种在真核宿主细胞中表达外源重组蛋白质的方法，特别是活性结构与二硫键(链内和链间)的形成密切相关的真核重组蛋白质。本发明的方法包括1.制备能表达、具有生物活性的hPDI全长基因；2.突变hPDI全长基因，并与连接肽连接，得到hPDI491_L突变基因；3.制备能表达、具有生物活性的人内皮抑制素(Endostatin)全长基因；4.将hPDI491_L突变基因和人内皮抑制素(Endostatin)全长基因与表达载体重组；5.用所述载体转染宿主细胞；6.培养所述宿主细胞；7.纯化融合蛋白，并在酶切后进一步纯化目的蛋白。本发明从人肝脏cDNA文库中用PCR的方法克隆hPDI cDNA全长基因。所述hPDI cDNA全长基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ-I所示。本发明的hPDI cDNA全长基因来源不局限于任何特定的人体细胞、细胞株或组织， 只要它含hPDI mRNA。本发明所述的重组人蛋白质二硫键异构酶的突变体，不限于该酶何种形式的突变体，只要它有利于目的蛋白在真核宿主中的表达和正确折叠。在一优选实施方案中，本发明使用的突变体去掉了重组人蛋白质二硫键异构酶自身的信号序列(l-17aa)，并将蛋白的末端由-KDEL改为-HDEL，突变后的氨基酸序列如序列表SEQ-2所示。本发明的表达产物分泌到胞外，存在于宿主细胞培养液上清内。离心去除宿主细胞，可从培养液上清分离和纯化融合蛋白。融合蛋白经过肠激酶酶切后，可以分离得到纯化的目的蛋白。所述表达产物重组人内皮抑素(Endostatin)蛋白质氨基酸序列如序列表SEQ-4所示。本发明用融合表达的方式对胶原蛋白家族的蛋白重组人内皮抑素 (Endostatin)进行大量生产，所得的蛋白产物为分泌、可溶蛋白。经过简单纯化后，可以得到可溶的、末端均一的、活性很高的目的蛋白。该方法与已知的方法相比，不仅蛋白活性更高，产量更高，而且蛋白均一，安全，更适合用于大规模生产。本发明所述的方法，不限于任何特定的蛋白，只要它能够与重组人蛋白质二硫键异构酶融合，并且在重组人蛋白质二硫键异构酶的辅助下进行正确的折叠。本专利设及到的大肠杆菌已于2010年12月16日提交保藏。保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国、湖北省武汉市、武汉大学；菌种保藏号为CCTCC M 2010353 ；分类命名为大肠埃希氏菌 K-12/pPICZalpha-hPDI 091)-Endostatin E2 ； Escherichia coliK-12/pPICZalpha-hPDI (491)-Endostatin E2。
本发明上述技术方法中分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2002)。
图 1 融合表达质粒ppICh-hPDI-L-Endostatin基因构建过程示意图。图2:2-1 从人肝cDNA Lib中PCR扩增endostatin基因，2号样品扩增出了 600bps左右大小的的条带，与endostatin基因大小相符。2-2,2-3 构建的融合表达质粒ppICh-hPDI-L-Endostatin酶切鉴定3号样品，质粒用》ιο I单酶切。由于hPDI基因带有两个Bio I位点，加上质粒ppIC^i载体部分带有一个》ιο I位点，因此Bio I单酶切质粒能够切下一条500bps和一条900bps的条带，结果符合预期；4号样品，质粒用EcoR I+Not I双酶切。构建的载体上，EcoR I 位于Linker上，Not I是基因的下游插入位点，因此双酶切能够切下Endostatin基因， 也就是600bps左右的条带，结果符合预期。由此图可以从酶切的角度确定构建的质粒 pp I CZa-hPD I -L-Endo statin IE石角。图 3 构建的质粒ppICh-hPDI-L-Endostatin用3，AOX引物的测序报告，测序结果显示，插入的基因Endostatin序列以及位置正确。图 4 构建的质粒ppICh-hPDI-L-Endostatin，通过电转化转入甲醇酵母宿主菌X33 后，筛选出了 PE1、PE2、PE8#三个单克隆样品，甲醇诱导48小时，将三个样品的诱导培养上清液进行浓缩、脱盐，以及EK酶酶切后，分别走浓度为8%的SDS-PAGE还原和非还原电泳， 比较结果。M 蛋白 marker1 样品诱导前样品上清2 :ΡΕ1#样品诱导后上清3 :ΡΕ1#样品诱导后，上清经过浓缩脱盐，用EK酶酶切1小时结果4 :ΡΕ2#样品诱导后上清5 :ΡΕ2#样品诱导后，上清经过浓缩脱盐，用EK酶酶切1小时结果6 :ΡΕ8#样品诱导后上清7 :ΡΕ8#样品诱导后，上清经过浓缩脱盐，用EK酶酶切1小时结果(1-8号样品为还原电泳结果)M 蛋白 marker8 :PE2#样品诱导前样品上清9 :PE2#样品诱导后上清10 :PE2#样品诱导后，上清经过浓缩脱盐，用EK酶酶切1小时结果11 :PE8#样品诱导后上清12 :PE8#样品诱导后，上清经过浓缩脱盐，用EK酶酶切1小时结果(8-12号样品为非还原电泳结果)电泳结果显示，筛选的PE^i样品在甲醇诱导48小时后，上清液里出现了大小在75KDa位置附近的蛋白条带(hPDI-L-Endostatin蛋白大小是78. 3KDa)，经过EK酶酶切1小时后，蛋白条带被切成两段，其中较大的一段略大于52KDa(hPDI-L蛋白大小是58. 2KDa)， 由此，我们可以认为表达的蛋白条带是目的蛋白hPDI-L-Endostatin。
具体实施例方式实施例1 设计、构建重组质粒，表达融合蛋白(1)克隆 hPDI5tl8CDNA 基因参照hPDI基因序列，设计引物，用PCR方法，从商业化人肝脏cDNA文库中扩增全长hPDI基因。扩增产物从限制性内切酶Bio I和NotI位点切出，与毕赤酵母表达质粒 pPICZ α重组，构建表达质粒pPICZ α -hPDI508,转化NovaBlue宿主菌。抽提质粒，再通过相应的限制性内切酶位点酶切分析，以特征片段筛选质粒，然后用核苷酸序列分析，证实基因重组的位置以及序列正确，获得带有hPDI全长基因的阳性克隆。本发明所采用的限制性内切酶来自Takara公司，商业化人肝脏cDNA文库来自 Biochain公司，甲醇营养型毕赤酵母菌株X33、毕赤酵母多拷贝表达载体pPICZ α来自 Invitrogen 公司。(2)突变全长hPDI基因用常规PCR方法，通过合成上下游引物，突变全长基因。反映在氨基酸水平上就是去掉hPDI蛋白的信号序列(l-17aa)，以及突变基因的3’末端-KDEL成为-HDEL，参考本人专利(申请号201010567613. 5)。并用另外合成的引物，同样用常规PCR的方式，在突变后的hPDI491基因的3，端加入连接序列Linker (SEQ-3)，即得到hPDI491_L的PCR产物。 将扩增产物与pGEM-T载体重组，构建新的表达质粒pGEM-T-hPDI491_L，转化 NovaBlue宿主菌。抽提质粒，再通过相应的限制性内切酶位点酶切分析，以特征片段筛选质粒，然后用核苷酸序列分析，证实基因重组的位置以及序列正确，获得带有hPDI491-L基因的阳性克隆。本发明所采用的pGEM-T载体来自Promega公司。(3)克隆人内皮抑制素(endostatin)基因参照网上公布的胶原蛋白家族的的几个蛋白的基因序列，设计引物，用PCR方法， 从商业化人肝脏cDNA文库中扩增胶原蛋白家族的人内皮抑制素(endostatin)基因，将扩增产物与pGEM-T载体重组，构建新的表达质粒pGEM-T-Endostatin，转化NovaBlue宿主菌。 抽提质粒，再通过相应的限制性内切酶位点酶切分析，以特征片段筛选质粒，然后用核苷酸序列分析，证实基因重组的位置以及序列正确，获得带有Endostatin基因的阳性克隆。(4)构建质粒，筛选及表达融合蛋白hPDI491-L-Endostatin将构建成功的质粒pGEM-T-hPDI491-L 和 pGEM-T-Endostatin 分别用 XhoI+BamHI、 BamHI+NotI双酶切，酶切产物与毕赤酵母表达质粒pPICZ α重组，构建表达质粒 pPICZ α -hPDI491-L_Endostatin转化NovaBlue宿主菌。抽提质粒，再通过相应的限制性内切酶位点酶切分析，以特征片段筛选质粒，然后用核苷酸序列分析，证实基因重组的位置以及序列正确，获得带有IiPDI491-L-End0Statin融合基因的阳性克隆。抽提构建好的质粒pPICZ α -hPDI491-L-EndOStatin，用限制性内切酶McI线性化以后，电穿孔法转入毕赤酵母野生型宿主菌X33中。经过kocin抗性平板筛选，获得阳性克隆。将阳性克隆接种至BMGY培养基，其中含酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6. 0),1.34% YNB, 0X 10_5) %生物素和1 %甘油，30°C培养至菌体光密度OD6tltlnm达到 2 6时，离心去除培养液，将菌体沉淀用甲醇复合型培养基BMMY稀释至OD6tltlnm到1，培养基 BMMY含有酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0)，1. 34% YNB, (4X IO"5) % 生物素，0. 5%甲醇。30°C诱导培养72小时，每12小时取样并补加甲醇维持其浓度0. 5%, 保留培养液上清，用上清做8% SDS-PAGE非还原电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，扫描定纯度，分子量。结果显示，甲醇诱导后，上清液在相应的分子量位置有浓集的条带。经扫描大致确定目的蛋白占上清液菌体表达总蛋白的50 %以上。实施例2 融合蛋白的纯化1. CM Sepharose Fast Flow 柱层析用50mM HAc-NaAc (pH 4. 2)平衡柱子，把含有目的蛋白的样液稀释到电导与平衡缓冲液一致，并调节PH至4. 2，开始上样，上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积，再用 50mMHAc-NaAc (pH4. 0) +IM NaCl 洗脱，收集 2 个柱体积。2. Chelating Sepharose Fast Flow 层析CM洗脱液用水稀释1倍，再用氢氧化钠调节pH至7. 4，上已用50mMTris-HCl (pH 7. 4)+0. 5M NaCl 平衡好的 Chelating Sepharose Fast Flow 柱，上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积，再用50mMTris-HCl (pH 7. 4) +20mM咪唑洗去杂质，最后用 50mMTris-HCl (pH7. 4) +200mM咪唑洗脱，收集2个柱体积。3. Chelating Sepharose Fast Flow 洗脱液用 IOKD 超滤膜超滤。4.蛋白用牛源肠激酶(rEK)在37°C酶切1小时。5. SP Sepharose Fast Flow 柱层析用50mMTris-HCl(pH 7. 0)平衡柱子，把酶切后溶液的电导和pH调节到与平衡缓冲液一致，开始上样，上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积，再用50mMTriS-HCl (pH 7. 0) +0. 3MNaCl洗涤杂质，最后用50mMTris_HCl (pH 7. 0) +IMNaCl洗脱，收集3个柱体积。6. Sephadex G-25脱盐后得到可溶的目的蛋白Endostatin。蛋白质分子序列SEQ-I序列说明(1)序列描述人蛋白质二硫键异构酶全长蛋白(2)分子类型蛋白质(3)序列特征a.长度:508aab.分子量57. IKDac.等电点4.761 MLRRALLCLA VAALVRADAP EEEDHVLVLR KSNFAEALAA HKYLLVEFYA51 PffCGHCKALA PEYAKAAGKL KAEGSEIRLA KVDATEESDL AQQYGVRGYP101TIKFFRNGDT ASPKEYTAGR EADDIVNWLK KRTGPAATTL PDGAAAESLV151ESSEVAVIGF FKDVESDSAK QFLQAAEAID DIPFGITSNS DVFSKYQLDK201DGVVLFKKFD EGRNNFEGEV TKENLLDFIK HNQLPLVIEF TEQTAPKIFG251GEIKTHILLF LPKSVSDYDG KLSNFKTAAE SFKGKILFIF IDSDHTDNQR
9
301ILEFFGLKKE ECPAVRLITL EEEMTKYKPE SEELTAERIT EFCHRFLEGK351IKPHLMSQEL PEDffDKQPVK VLVGKNFEDV AFDEKKNVFV EFYAPffCGHC40IKQLAPIffDKL GETYKDHENI VIAKMDSTAN EVEAVKVHSF PTLKFFPASA451DRTVIDYNGE RTLDGFKKFL ESGGQDGAGD DDDLEDLEEA EEPDMEEDDD501QKAVKDELSEQ-2(4)序列描述人蛋白质二硫键异构酶突变体(5)分子类型蛋白质(6)序列特征a.长度491aab.分子量55. 3KDac.等电点4.691 DAPEEEDHVL VLRKSNFAEA LAAHKYLLVE FYAPffCGHCK ALAPEYAKAA51GKLKAEGSEI RLAKVDATEE SDLAQQYGVR GYPTIKFFRN GDTASPKEYT101AGREADDIVN WLKKRTGPAA TTLPDGAAAE SLVESSEVAV IGFFKDVESD151SAKQFLQAAE AIDDIPFGIT SNSDVFSKYQ LDKDGVVLFK KFDEGRNNFE201GEVTKENLLD FIKHNQLPLV IEFTEQTAPK IFGGEIKTHI LLFLPKSVSD251YDGKLSNFKT AAESFKGKIL FIFIDSDHTD NQRILEFFGL KKEECPAVRL301ITLEEEMTKY KPESEELTAE RITEFCHRFL EGKIKPHLMS QELPEDffDKQ351PVKVLVGKNF EDVAFDEKKN VFVEFYAPffC GHCKQLAPIff DKLGETYKDH40IENIVIAKMDS TANEVEAVKV HSFPTLKFFP ASADRTVIDY NGERTLDGFK451KFLESGGQDG A⑶DDDLEDL EEAEEPDMEE DDDQKAVHDE L-SEQ-3(7)序列描述连接肽(8)分子类型多肽(9)序列特征a.长度30aab.分子量2. 8KDac.等电点5.721GTEFGGGGSG GGGSHHHHHH GGGGSDDDDKHSEQ-4(10)序列描述人内皮抑素全长蛋白(Endostatin)(11)分子类型蛋白质(12)序列特征a.长度183aab.分子量20. IKDac.等电点9.301 HSHRDFQPVL HLVALNSPLS GGMRGIRGAD FQCFQQARAV GLAGTFRAFL
51 SSRLQDLYSI VRRADRAAVP IVNLKDELLF PSffEALFSGS EGPLKPGARI101FSFDGKDVLR HPTffPQKSVff HGSDPNGRRL TESYCETffRT EAPSATGQAS151SLLGGRLLGQ SAASCHHAYI VLCIENSFMT ASKSEQ-5(13)序列描述融合蛋白(hPDI-L-Endostatin)(14)分子类型蛋白质(15)序列特征a.长度:705aab.分子量78. 3KDac.等电点5.081 MDAPEEEDHV LVLRKSNFAE ALAAHKYLLV EFYAPffCGHC KALAPEYAKA51 AGKLKAEGSE IRLAKVDATE ESDLAQQYGV RGYPTIKFFR NGDTASPKEY101TAGREADDIV NWLKKRTGPA ATTLPDGAAA ESLVESSEVA VIGFFKDVES151DSAKQFLQAA EAIDDIPFGI TSNSDVFSKY QLDKDGVVLF KKFDEGRNNF201EGEVTKENLL DFIKHNQLPL VIEFTEQTAP KIFGGEIKTH ILLFLPKSVS251DYDGKLSNFK TAAESFKGKI LFIFIDSDHT DNQRILEFFG LKKEECPAVR301LITLEEEMTK YKPESEELTA ERITEFCHRF LEGKIKPHLM SQELPEDffDK351QPVKVLVGKN FEDVAFDEKK NVFVEFYAPff CGHCKQLAPI WDKLGETYKD40IHENIVIAKMD STANEVEAVK VHSFPTLKFF PASADRTVID YNGERTLDGF451KKFLESGGQD GAGDDDDLED LEEAEEPDME EDDDQKAVHD ELGTEFGGGG501SGGGGSHHHH HHGGGGSDDD DKHSHRDFQP VLHLVALNSP LSGGMRGIRG551ADFQCFQQAR AVGLAGTFRA FLSSRLQDLY SIVRRADRAA VPIVNLKDEL60ILFPSffEALFS GSEGPLKPGA RIFSFDGKDV LRHPTffPQKS VffHGSDPNGR65IRLTESYCETff RTEAPSATGQ ASSLLGGRLL GQSAASCHHA YIVLCIENSF70IMTASKH
权利要求
1.一种在真核宿主细胞中融合表达重组蛋白的方法，其特征在于融合表达的重组蛋白具有下列结构之中的一种a)· P-Xb)·P-L-Xc).MP-Xd).MP-L-X其中，P代表重组人蛋白质二硫键异构酶(human protein disulphide isomerase)；MP代表重组人蛋白质二硫键异构酶突变体(mutant of human protein disulphide isomerase)；L 表示连接肽(linker sequence)；X 代表目的蛋白(interest protein)。
2.一种在真核宿主细胞中融合表达重组蛋白的方法，其特征在于融合表达的重组蛋白具有下列结构之中的一种a)· P-Xb)·P-L-Xc).MP-Xd).MP-L-X其中，P代表重组人蛋白质二硫键异构酶(human protein disulphide isomerase)； MP代表重组人蛋白质二硫键异构酶突变体(mutant of human protein disulphide isomerase)；L 表示连接肽(linker sequence)；X 代表目的蛋白(interest protein)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中编码重组人蛋白质二硫键异构酶(即P蛋白)的基因克隆自人体组织细胞总RNA。
4.根据权利要求2所述，其中的人体组织细胞总RNA不限于人体特定的细胞、细胞株或组织，只要它含hPDI mRNA。
5.根据权利要求2和3所述，其中的重组人蛋白质二硫键异构酶(即P蛋白)的氨基酸序列是SEQ-I。
6.根据权利要求1所述的方法，其中的重组人蛋白质二硫键异构酶突变体，即MP蛋白， 不限于该酶何种形式的突变体，只要它有利于目的蛋白在真核宿主中的表达和正确折叠。
7.根据权利要求1和3所述的方法，其中的重组人蛋白质二硫键异构酶突变体(即MP 蛋白)是将全长的人蛋白质二硫键异构酶(hPDI)的编码信号序列的1-17个氨基酸残基截除，并将Lys (505)突变为His (505)，得到一条含有491个氨基酸的多肽链，其N-端前8个氨基酸残基是DAPEEEDH-，C-端末尾6个氨基酸残基是-AVHDEL (即r_hPDI491)，其氨基酸序列是SEQ-2，菌种保藏编号CCTCC M 2010318。
8.根据权利要求1所述的方法，其中的linkersequence (L)序列不限于任何一种连接肽序列，它可以包含有(Gly4Ser)n, (Gly)n, (Ser)n, (His)6、肠激酶(rEK)识别序列DDDDK 1、 烟草蚀纹病毒蛋白酶(rTEV)的识别序列ENLYFQ 1 G、凝血酶(Thrombin)识别序列LVPR 1 GS 或凝血因子fe的识别序列IEGR 1的各种组合，只要它有利于蛋白连接。
9.根据权利要求1和7所述的方法，其中的连接肽linkersequence (L)具有SEQ-3所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其中的目的蛋白，即X蛋白，不限于任何特定的蛋白， 只要它能够与重组人蛋白质二硫键异构酶融合，并且在重组人蛋白质二硫键异构酶的辅助下进行正确的折叠。
11.根据权利要求1和9所述的方法，其中的目的蛋白，即X蛋白，包括胶原蛋白家族的 Endostatin、Tumstatin、Arrestin、Canstatin 禾口 Angiostatin,以及它们的截短型或突变型蛋白。
12.根据权利要求1、9和10所述，其中的目的蛋白，即X蛋白，当它特指Endostatin全长蛋白的时候，其全长蛋白的氨基酸序列是SEQ-4;融合表达时，分泌的融合蛋白的氨基酸序列是SEQ-5，菌种保藏编号CCTCC M 2010353。
13.根据权利要求1所述的方法，其中的真核宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞， 只要它能够表达所述的融合蛋白。
14.根据权利要求1和12所述的方法，其中所述的真核宿主细胞为甲醇营养型毕赤酵母菌株X33。
全文摘要
本发明涉及一种融合表达含有二硫键蛋白质的方法。具体涉及一种在真核宿主细胞中，融合表达重组蛋白质，特别是活性与二硫键的形成(链内和链间)密切相关的真核重组蛋白质的方法。通过一种融合重组人蛋白质二硫键异构酶(human protein disulphide isomerase，hPDI)或者融合其突变体的方法，在巴斯德毕赤酵母表达系统中，表达外源重组蛋白。该方法适合表达蛋白活性或蛋白折叠(包括单体、二聚体或多聚体形式)有耐于二硫键的正确形成的真核外源蛋白质。通过这种方式表达的蛋白质容易被细胞分泌出胞外，产量高，产物不会大量聚集，产物容易被捕获及纯化，而且得到的目的蛋白N末端均一，活性高。该方法表达的重组蛋白质，有利于进行工业化大规模生产。
文档编号C12N15/79GK102533839SQ20101060108
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者余彩霞, 张洁, 王建权 申请人:上海开阳生物科技有限公司