专利名称：二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于产生pIX噬菌体展示文库及使用该文库来制备二聚体抗体片段、完整抗体或其它二硫键连接的多聚构建体的组合物和方法。
_4] 关于本领域的讨论丝状噬菌体展示是一种广泛使用的基于亲和力选择蛋白质的技术，因为在选择过 程中每个噬菌体颗粒将编码多肽的核酸与其外壳蛋白的N端融合连接在一起。M13噬菌体编码五种外壳蛋白，在曬菌体的一端具有大概五个拷贝的次要外壳蛋白pin和pvi,在曬菌体的另一端具有相同数目的PVII和pix。噬菌体DNA由大概3000个拷贝的主要外壳蛋白PVIII包封。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pill和PVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用该技术，已构建了肽、Fab、scFv和其他蛋白结合物(protein binder)的文库并且可用于各种应用，具有极大商业价值。pill外壳蛋白由于其大小、构象和低拷贝数而较pVIII蛋白更受欢迎。pill次要外壳蛋白是负责噬菌体感染进大肠杆菌中的404个氨基酸、42kD的蛋白质，其包括由柔性铰链区段连接的三个结构域。与PlII的N端融合可系住离开噬菌体表面的所展示的蛋白质，从而与融合至小的高拷贝数的PVIII外壳蛋白相比配体更有可能接近进行结合。pill蛋白是感染和融合的初始步骤所必需的，除了小的肽和蛋白质之外所有肽和蛋白质可干扰该过程。该问题例如通过使用含有另一拷贝的野生型PlII蛋白的病毒载体或采用辅助噬菌体的噬菌粒系统来解决。与PlI I和类似的pVI 11形成对比，pVI I和pIX是分别为33个和32个氨基酸的短螺旋蛋白质，在噬菌体表面紧密包装。然而，已在pIX上展示了 scFv(Gao，C.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 99，12612-12616，2002) Fab (Shi, L 等人，J MolBiol 397，385-396，2010 ；Tornetta, M 等人，J Immunol Meth 360，39-46，2010)文库并进行了选择。已通过将不同的多肽与PVII和紧密相邻的pIX 二者融合描述了 Fv和肽的异型二聚体展示(Gao 等人，1999Proc Nat Acad Sci 96 :6025-6030 和 Janda US7078166)。此夕卜，已报道了单一特异性 scFv 的 pVII 展不(Kwasnikowski 等人，2005. J TmmunoI Methods307 :135)。也已描述了一种备选的方法，在该方法中由噬菌体或噬菌粒载体编码的外源蛋白(exoprotein)不与外壳蛋白融合,而是通过二硫键键合共价连接至重新工程改造的外壳蛋白 PlII 和 pIX(US6753136)。在噬菌体颗粒的表面上展示二聚体蛋白质以及异型二聚体蛋白质的能力在以组合文库形式模拟更复杂的蛋白质结构方面是有利的。一直需要推进现有技术来产生筛选复杂蛋白质的变体的高通量方法，复杂蛋白质的变体为例如人IgG的变体，人IgG为通过分子间的二硫键连接的重链和轻链对(异型二聚体)的同型二聚体。至今，还不可能演示完整的抗体重链在丝状噬菌体上的正确装配和展示。本发明的文库和方法通过将全面的设计、装配技术以及噬菌体pix Fab展示相结合来满足这些需要。
发明内容
本发明提供了利用M13外壳蛋白pIX在丝状噬菌体上展示二硫键连接的二聚体蛋白质以及更复杂结构的容易手段。在本发明中，所展示的蛋白质为融合蛋白，其包含PlX外壳蛋白、折叠的结构域如CH2结构域，这两个结构域连接至包含半胱氨酸残基的多聚体化结构域，如铰链结构域。在一个特定的实施例中，该二聚体蛋白质是同型二聚体，其中成员是二硫键连接的，并且该蛋白质包含抗体Fe。在另一个实施例中，该二硫键连接的同型二聚体蛋白质包含人抗体蛋白质，其中至少铰链结构域和恒定结构域存在于包含该同型二聚体的多肽的每一者中，并且任选地，该同型二聚体结构还通过形成二硫键与独立表达的抗体轻链联合(associate)。本发明提供了编码至少一种融合蛋白的可复制载体，其具有融合至编码pIX外壳蛋白的序列的编码外源多肽的序列，其中该外源的非噬菌体蛋白部分是形成同型二聚体的 多肽链。在一个实施例中，该融合的形成同型二聚体的多肽形成Re-融合蛋白。在另一个实施例中，该同型二聚体结构可进一步与异型多肽相连以形成更复杂的结构。在一个方面，抗体重链多肽和轻链多肽二者在单个噬菌体分子中的展示会导致功能性抗体分子在噬菌体颗粒表面装配，例如但不限于完整的IgG分子。包括在本发明中的是含有可复制载体和能够在其表面展示融合多肽为二硫键连接的二聚体蛋白质的噬菌体颗粒的宿主细胞。该载体可任选包含编码分泌信号的多核苷酸，所述分泌信号有效融合至编码所展示的多肽-外壳蛋白融合物的多核苷酸序列。还提供了是用于构建二硫键连接的二聚体蛋白质的PlX噬菌体展示从头文库的方法和载体，所述文库组装、筛选以及诸如本领域实施用于抗体组合物的选择和改善之类的其他讯问性技术。在一个实施例中，提供了含有展示多种不同融合多肽的噬菌体颗粒的宿主细胞的文库，所述融合多肽能够在噬菌体颗粒表面上形成连接至Pix蛋白的二聚体结构。在Iv方面，该文库在嗤囷粒系统中编码。在一个实施例中，本发明的文库可包含重链可变区的文库；其可还包含轻链可变区的文库；并且其还可包含变体Fe区的文库。可对本发明的文库进行淘选、分选或其他选择程序以便从该编码蛋白质的文库中鉴别和分离具有所需的、增强的或减少的性质如与靶配体的结合改变或对效应分子(如Fe Y R和/或Clq)的结合改变的多核苷酸。
图I.用于表达pIX连接的Fab的起始载体的示意图。图2A-B成Fe构建体的pIX曬菌粒载体的示意图(A),该示意图示出了 IacZ启动子、添加在细菌信号肽PelB的上游的核糖体结合位点(RIBS)的相对位置、连接编码Fe多肽、噬菌体次要外壳蛋白pIX或pVII的多核苷酸的柔性连接物(G4S)的位置；以及用于全长IgG结构在pIX上表达的双顺反子噬菌粒载体的示意图(B)。图3A-B为示出了如实例I中所述构建的重组噬菌体颗粒上的ELISA的结果的曲线图，说明了 Fe融合蛋白(A)或EMP-I-Fc(B)的增加，其中重组噬菌体颗粒被捕集于包被有抗Fe单克隆抗体(A)或抗EMPl单克隆抗体CNTO 3443 (B)的板上，捕集的噬菌体用HRP缀合的抗PVIII单克隆抗体检测。辅助噬菌体为阴性对照，在B中Fe噬菌体为阴性对照。实验中使用了两份独立的噬菌体制备物。图4为来自结合测定法的曲线图，示出了在噬菌体上展示的Fe结构域能够与蛋白A结合。图5A-B为来自在最佳结合酸度pH 6.0下(上图)和在非特异性结合条件pH 7.5下(下图)进行的FcRn结合测定法的曲线图。图6示出了使用抗人Fe抗体来检测的蛋白质印记，证实了分离和且在非还原条件下(泳道1，NR)和还原条件下(泳道2，R)跑电泳的蛋白质的二聚体性质，显示在非还原条件下主要的带的分子量大约为还原条件下主要的带的分子量的两倍。图7A-D为示出了 ELISA方法中产生的关于使用多种对噬菌体上表达的抗体结构 域、表达的EMP-I-Fc构建体或噬菌体本身具有特异性的配体，从所指明的在具有或不具有Iac诱导剂IPTG的条件下培养的制备物捕集的噬菌体的信号的柱状图(A)抗Fd(CHl)抗体捕集；(B)抗k抗体；(C)抗CH2抗体；和⑶抗CH3抗体。将在pIX上展示6_2 Fab或非免疫球蛋白的噬菌体包括在内作为阴性对照。图8为柱状图，示出了使用商购的抗IL 13抗体以及在存在或不存在竞争性可溶性抗IL 13单克隆抗体(与抗IL13 IgG pIX具有相同的特异性)的条件下(方格状柱条)，ELISA方法中产生的关于从所指明的制备物捕集的噬菌体的信号。EMP-I-Fc构建体为不结合IL13的阴性对照，将IL13特异性的在噬菌体上展示为pIX融合物的6-2Fab包括在内作为阳性对照。图9A-B为示出了 ELISA方法中产生的关于板中由商购抗IL 13抗体捕集的噬菌体的信号的柱状图，其中在添加IL 13抗体后添加渐增量的噬菌体上的竞争性抗IL13抗体(6-2全长IgG)或对IL13无特异性的对照抗体(抗EMMPRIN) (A)以及板中由商购抗IL13抗体捕集的噬菌体的信号的柱状图，其中在添加商购的抗IL13抗体后，添加噬菌体上的6-2Fab。添加了渐增量的抗IL13单克隆抗体或抗EMMPRIN单克隆抗体(B)。图10示出了在将生物素化IL13或IL17A抗原用于捕集展示IL13或IL17A的全长IgG构建体后以及在存在或不存在竞争性可溶性抗IL13单克隆抗体或抗IL17A单克隆抗体的情况下，来自由结构域特异性抗体抗Fd、抗k、抗CH2和抗CH3任一者捕集的噬菌体的信号。用抗M13抗体(y轴)检测噬菌体。序列表简述
权利要求
1.一种用于在丝状噬菌体颗粒的表面上展示功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的可复制噬菌体载体；包含与编码源于外源蛋白的第一氨基酸序列的多核苷酸序列融合的编码噬菌体Pix或PVII蛋白的核酸序列，其中所述编码的外源蛋白氨基酸序列包含至少一个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基能与表达为与pix或pVII形成的外源蛋白融合物的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。
2.根据权利要求I所述的噬菌体载体，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。
3.根据权利要求I所述的噬菌体载体，其中所述编码的氨基酸序列包含选自SEQIDNO :1-3和4的抗体铰链结构域，以及SEQ ID NO :1_3和4的核心残基。
4.根据权利要求3所述的噬菌体载体，其中所述链间二硫键处于所述抗体铰链结构域氨基酸序列或核心铰链残基内。
5.根据权利要求4所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含选自SEQID NO :5-16和17-22的序列或它其中至少一个残基被置换的变体。
6.根据权利要求I所述的噬菌体载体，其中所述核酸还编码与所述外源蛋白编码序列中的一者有效融合的细菌分泌信号。
7.根据权利要求6所述的噬菌体载体，其中所述细菌分泌信号选自如SEQID N0:14中所示的PelB序列或变体pelB序列，或者为SEQ ID NO : 15中所示的ompA或ompA的变体。
8.根据权利要求I所述的噬菌体载体,所述噬菌体载体还包含诱导型启动子。
9.根据权利要求8所述的噬菌体载体，其中所述诱导型启动子为Iac启动子或Iac的突变体。
10.一种包封有编码融合多肽的载体并且在表面上具有功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的丝状噬菌体颗粒；其中所述蛋白质包含与丝状噬菌体PVII或PlX蛋白的氨基末端融合的具有半胱氨酸残基的第一外源多肽，因此当所述蛋白质在丝状噬菌体蛋白质的表面表达时，所述半胱氨酸残基与融合至Pix或PVII的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。
11.根据权利要求10所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。
12.—种细菌宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求10所述的丝状噬菌体。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述功能性蛋白质能够从所述原核宿主细胞的培养基回收。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述蛋白质在丝状噬菌体颗粒的表面上展 示。
15.一种由根据权利要求12所述的细菌宿主细胞表达的二聚体或多聚体融合蛋白，所述融合蛋白具有可测量的功能蛋白结合活性。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述可测量的蛋白结合活性为蛋白A结合或FcRn受体结合。
17.根据权利要求16所述的多聚体蛋白结构的生物活性外源蛋白变体。
18.—种包含根据权利要求4所述的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库，其中所述载体内编码所述抗体序列内的各个分立残基或结构域的特定位置进行了多样化。
19.根据权利要求18所述的噬菌体文库，其中所述核酸编码具有氨基酸置换的形成Fe的序列。
20.根据权利要求19所述的噬菌体文库，其中所述形成Fe的序列还包含配体结合结构域。
21.根据权利要求20所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域选自受体结合配体、受体胞外结构域、包含可变结构域和恒定结构域的抗体Fab结构域以及单链Fv构建体。
22.根据权利要求21所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域包含在所述结合结构域内各特定残基处相互不同的序列。
23.根据权利要求22所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域在选自CDRUCDR2和⑶R3的种系重链互补决定区中包含多个各异变异。
24.一种在根据权利要求12所述的细菌宿主细胞中产生抗体或Fe片段的文库的方法，所述方法包括 a.用包含根据权利要求I所述的多核苷酸的载体的文库感染宿主细胞群体,所述多核苷酸编码与噬菌体外壳蛋白融合的重组抗体或其片段；以及 b.在使得所述抗体或其含Fe的片段能在所述噬菌体表面上表达的条件下培养所述细胞的群体，以及 c.选择展示具有所需的或增强的特性的抗体或其片段的噬菌体。
25.—种使用根据权利要求20所述的噬菌体文库来选择具有改善的特性的变体的方法。
26.根据权利要求23所述的选择变体的方法，其中所述特性选自改善的靶标结合、与特定靶表位的结合、Fe受体结合亲和力、减少的糖基化位点、增加的糖基化位点和增强的热稳定性。
27.—种使用根据权利要求23所述的噬菌体文库来选择所需的生物活性的方法，其中所述选择包括(a)从根据权利要求13所述的噬菌体文库表达抗体Fe片段，以及(b)选择具有所需生物活性的噬菌体颗粒。
28.—种编码含Fe的抗体或抗体片段的核酸，所述核酸从根据权利要求22所述的方法获得。
29.根据权利要求23所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段选自IgA、IgE、IgM、IgD、IgY 和 IgG0
30.根据权利要求23所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或其片段为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含使用根据权利要求24或25所述的方法选择的含Fe的抗体或抗体片段。
全文摘要
本发明提供了用于复杂同型二聚体蛋白质在噬菌体颗粒的表面上展示的方法，以及展示为与丝状噬菌体pIX外壳蛋白形成的融合多肽的这种蛋白质的组合合成文库。异型二聚体的或更复杂的链间键合结构，如二硫键连接的多聚体蛋白质，可用本发明的方法展示。
文档编号C12N15/00GK102741403SQ201080052711
公开日2012年10月17日 申请日期2010年11月15日 优先权日2009年11月17日
发明者C·黄, J·弗兰松, T·斯平卡-多马 申请人:詹森生物科技公司