专利名称：一种恶性疟原虫pfs25蛋白二聚体衍生物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于传染病防治领域，具体涉及恶性疟疾的防治，尤其涉及用于阻断疟疾传播的疫苗的候选靶抗原。
背景技术：
疟疾是通过按蚊叮咬传播的寄生虫病，其病原体为疟原虫。世界卫生组织2009年年度报告显示，全球每年有2. 43亿疟疾临床病例，死亡86. 3万人(WHO. World MalariaReport 2009[EB/0L],)。鉴于此，针对死亡率甚高的恶性疟疾开发预防用疫苗，已经成为与爱滋病、结核疫苗并列的世界“三大”疫苗项目之一。世界卫生组织、联合国计划开发署已将疟疾疫苗列入优先发展项目。比尔·盖茨基金会也设置了 “疟疾疫苗专题”。
Pfs25蛋白是恶性疟原虫的配子体表面蛋白，并持续存在于合子和动合子期，Pfs25是介导动合子穿越围食膜(peritrophic membrane, PM)和对蚊中肠壁基底膜侵入的关键性蛋白，其抗体能够抑制合子在蚊虫肠道内的发育，因此起到传播阻断的效果，所以pfs25蛋白被认为是恶性疟疾疫苗的重要候选抗原。这种疫苗与其他疟疾疫苗或抗疟药联合应用时，可阻断那些逃避疫苗保护或对药物产生抗性而幸存下来原虫的传播。1988年Kaslow DC等首次报道了 Pfs25蛋白质，结果表明该蛋白质由217个氨基酸组成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四个“EGF样的结构域”(Nature. 1988 May5;333(6168) :74-6. );1991年Barr PJ等报道了重组Pfs25蛋白作为传播阻断疫苗在试验动物上的效果(The Journal of experimental medicine. 1991 Nov I ;174(5) : 1203-8.);以上研究为进一步研制传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。此后，很多研究人员在多种系统中对pfs25进行了表达和评价,Takafumi Tsuboi等人在麦芽无细胞系统(Wheat GermCell-Free System)中表达了 Pfs25蛋白，该重组蛋白可抑制痕原虫的发育(Infection andImmunity, 2008, 76 (4) : 1702-1708. ) ；Godfree Mlambo等在昆虫杆状病毒表达体系中表达了 Pfs25 蛋白(Vaccine 2010, 28:7025 - 7029) ；Christine E.等报道了 pfs25 在植物表达系统中表达，并且验证了对恶性痕疾传播的阻断活性(Human Vaccines, 2011, Volume 7Supplement, DOI: 10. 4161/hv. 7. 0. 14588.)。在各种表达体系中，酵母表达体系被广泛应用，获得的表达产物也被应用于人体临床研究。1993年，Kaslow DC等公开了采用酵母系统表达Pfs25蛋白突变体的方法，该突变体将pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替换成丙氨酸(美国专利US5217898) ；Zou L等报道在毕赤酵母中表达的另一种pfs25蛋白突变体，该突变体将Pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替换成谷氨酰胺(Vaccine. 2003Apr2; 21 (15) :1650-7.)。在以上工作的基础上，Yimin Wu等人分别将酵母重组的Pfs25蛋白突变体(Zou L 等，Vaccine. 2003Apr 2; 21 (15) : 1650-7.)和与 Montanide ISA 51 佐剂混合制作疫苗进行了 I期临床试验，该项目试验的结果表明，pfs25蛋白质在人体内能够激发免疫应答，但是，血清抗体效价较低，维持时间短暂，参见PloS one. 2008; 3 (7) :e2636.的公开。
作为候选疫苗而言，pfs25蛋白质的免疫原性较弱，有待于进一步增强。Feng Qian等通过把pfs25蛋白与绿脓杆菌外毒素A (ExoProtein A)偶联，明显提高了 pfs25蛋白的免疫原性，参见 Vaccine. 2007; 25 (20) :3923 - 3933 的公开。Joanna Kubler-Kielb 等以卵清蛋白(0VA)、环子孢子蛋白(CSP)及pfs25蛋白自身作为载体蛋白，得到系列pfs25蛋白和载体蛋白偶联物，可以提升Pfs25蛋白的免疫原性并维持较长时间的免疫应答，具体参见 PNAS. 2007; 104(1) :293-298 的公开。上述研究工作，都采用化学试剂在蛋白质水平进行偶联，虽然pfs25的免疫原性得到了增强，但是其缺陷在于pfs25蛋白-载体偶联物结构不确定、偶联效率低、生产工艺复杂，从而增加了生产过程中质控的难度。因此，本领域迫切需要研制新类型的Pfs25衍生抗原，用于防治疟疾。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白衍生物，作为传播阻断疫苗的候选抗原，以解决Pfs25蛋白免疫原性弱的问题。本发明的第一方面，提供了一种恶性疟原虫Pfs25蛋白衍生物，具体而言，该衍生物是基因重组的Pfs25蛋白二聚体，具有如下结构pfs25-L-pfs25其中pfs25代表pfs25蛋白突变体，L代表连接臂(linker)。所述的pfs25蛋白突变体包括相当于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突变体，即去除了 Pfs25天然序列N端22个氨基酸的信号肽序列和C端的24个氨基酸的膜结合区域，和/或对相当于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺进行点突变。在一个优选的方案中，所述的pfs25蛋白突变体包含相当于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相当于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替换为丙氨酸。在一个优选的方案中，所述的pfs25蛋白突变体包含相当于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相当于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替换为谷氨酰胺。在一个优选的方案中，所述的pfs25蛋白突变体包含相当于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相当于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替换为谷氨酸。所述的连接臂由甘氨酸、丝氨酸组成，具有如下结构Sa_(GbS)。，其中S代表丝氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4，c=l-4的整数。在一个优选的方案中，连接臂具有SGGGGS的结构。在一个优选的方案中，连接臂具有(GGGGS)3的结构。在一个优选的方案中，连接臂具有(GGGS)4的结构在更优选的方案中，恶性疟原虫Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 5所示的氨基酸序列。在在更优选的方案中，恶性疟原虫Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 7所示的氨基酸序列。本发明的第二方面，提供了恶性疟原虫Pfs25蛋白二聚体衍生物的用途，用于制备预防恶性疟的传播阻断疫苗。本发明的(pfs25)2蛋白衍生物，分子结构上是由多肽连接臂连接的两个pfs25蛋白亚基形成二聚体，多肽连接臂对两个Pfs25蛋白亚基的生物活性没有影响，保持了 pfs25蛋白自身的性质。本研究的数据显示，(pfs25) 2蛋白可以和抗pfs25的标准单抗4B7特异反应，这反映了(pf s25) 2分子保留了 pf s25蛋白的免疫反应性；(pf s25) 2分子接种小鼠后，能够激发比Pfs25蛋白单体更高的免疫应答，证明了(pfs25)2分子具备更强的免疫原性。在本发明一个优选的实施例中，本发明表达了(pfs25-3E)2 二聚体，该二聚体能够与抗pfs25标准单抗4B7特异反应，说明该衍生物保持了 pfs25蛋白质的免疫原性。在小鼠体内试验中，该二聚体激发的抗体水平，与二聚体的免疫剂量成正相关。在与pfs25-3E单体的对比试验中，在相同剂量下，二聚体激发的抗体水平比单体提高了 10倍以上。
本发明的(pfs25)2蛋白衍生物，利用基因重组手段，在宿主体内直接表达成为Pfs25的二聚体蛋白，通过纯化操作可以获得纯度很高的(pfs25)2 二聚体蛋白质，其生产工艺简单、可控性高、疫苗成分均一。在本发明一个优选的实施例中，(pfs25-3E)2 二聚体在酵母表达系统中高表达，其表达产物占酵母发酵上清中总蛋白含量的65%以上，通过离子交换层析、凝胶过滤层析两步纯化，即可得到纯度达95%以上的目标蛋白，适合大规模生产。相对而言，已有技术中采用的体外化学偶联方法，虽然增大了免疫原的分子量，提高了免疫原性，但由于偶联反应的随机性和不可控性，使得产物不均一。以Pfs25蛋白自身偶联为例，最终可以获得Pfs25 二聚体、pfs25三聚体、pfs25四聚体甚至到十聚体。仅就偶联得到的二聚体而言，由于发生偶联的部位不同，事实上包括了各种不同构象的异构体。这种偶联产物的复杂性，造成产品质控的不确定性。此外，由于偶联工艺的复杂性和偶联反应的不充分，造成偶联反应不易控制、生产成本高，不利于产业化放大。总体而言，本发明(pfs25)2蛋白衍生物免疫原性强，产品结构均一，生产工艺简单可控，有望成为针对恶性疟疾的传播阻断型疫苗的候选抗原。
图I:重组表达质粒pf s25_3E/pGAPZ a A酶切鉴定泳道1:DL2000 DNA marker, 2000，1000，750，500，250，100泳道2: Xho I 和 Xba I 双切 pf s25_3E/pGAPZ a A 重组质粒图2:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS11572 小时表达上清 SDS-PAGE 分析泳道I:protein marker(kd) :96, 67, 43, 31, 21, 14泳道2: pfs25标准蛋白泳道3-8:pfs25/pGAPZ a A/GS115阳性克隆表达产物泳道9: pGAPZ a A/GS115酵母菌(阴性对照)图3: pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115 重组菌表达产物 Western-blot 鉴定泳道l:pGAPZa A/GS115 Pcihia pastoris (阴性对照)泳道2:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重组菌 24 小时表达泳道3:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重组菌 48 小时表达
泳道4:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重组菌 72 小时表达泳道5: pfs25标准蛋白图4:pfs25_3Q/pGAPZ a A/GS115 重组菌表达分析泳道I :pfs25标准品；泳道2-10 Q2-Q10克隆重组菌表达产物图5:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115重组菌表达上清离子交换层析 泳道I: I. OM NaCl 洗脱峰；泳道2:0. 3Μ NaCl 洗脱峰泳道3:流穿峰； 泳道4:柱前样图6:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115重组菌表达上清凝胶过滤层析泳道1-6:分部收集的第I至6管管样品图I:重叠 PCR 获得(pf S25-3E) 2 基因泳道I:DNA Marker DL2000 ；泳道2:引物a与引物b的PCR结果泳道3:引物c与引物d的PCR结果；泳道4:弓丨物a与引物d的PCR结果图8:重组表达质粒(pf s25-3E) 2/pPICZ a A酶切鉴定泳道I:DNA Marker DL2000 ；泳道2:弓丨物a与引物d的PCR结果泳道3: Xba I 和 Xho I 双酶切(pfs25_3E) 2/pPICZ a A泳道4: Xba I 单酶切(pf s25_3E) 2/pPICZ a A泳道5:DNA Marker D507A: 11849，10085，8023，6133，5026，3997，3049，2087图9: SDS-PAGE 分析(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重组酵母菌 72 小时表达上清泳道1、2:两个不同的(pfs25_3E)2/pPICZa A/GS115重组菌克隆；泳道3:pPICZaA/GS115 ;泳道4:标准蛋白质分子量(Kd)图10: Western-blot 鉴定(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重组酵母菌表达上清泳道l:pPICZa A/GS115酵母菌表达上清泳道2: (pfs25_3E)2/pPICZa A/GS115重组酵母菌72小时表达上清图11:离子交换层析纯化(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115重组菌表达上清泳道l:pPICZa A/GS115酵母菌表达上清；泳道2:标准蛋白质分子量(Kd) :96, 67，45，30，20，14泳道3: (pfs25_3E)2/pPICZaA/GS115重组酵母菌表达上清泳道4:0. lmol/L NaCl 洗脱峰；泳道5:0. 3mol/L NaCl 洗脱峰泳道6:1. OmoI/L NaCl 洗脱峰图12:凝胶过滤层析纯化(pf S25-3E) 2蛋白泳道I:标准蛋白质分子量(Kd)；泳道2: (pfs25-3E) 2 蛋白质
具体实施例方式传播阻断型恶性疟疾疫苗针对疟原虫有性阶段的配子期和无性阶段的细胞前期及红细胞内期的不同抗原，痕疾疫苗分三大类肝内期疫苗、红内期疫苗以及传播阻断型疫苗(transmissionblocking vaccines, TBVs)。传播阻断型疫苗是以蚊阶段痕原虫特异表达的虫体表面蛋白作为抗原免疫人体，使之产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。蚊吸入被免疫的人血后，蚊中肠内发育的疟原虫与人的抗体产生抗原抗体反应，从而导致蚊体内疟原虫有性生殖及孢子增殖受到阻断。目前研究较多的传播阻断疫苗候选抗原有恶性疟原虫相关蛋白Pfs25、Pfs28、Pfs48/45 和 Pfs230,间日疟相关蛋白 Pvs25、Pvs28、Pvs48 等。虽然传播阻断型疫苗不能预防免疫个体感染疟疾，亦不能减轻疟疾症状，但能阻 断按蚊将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主。当这种疫苗与疟疾保护性疫苗或抗疟药联合应用时，TBVs可阻断那些对药物产生抗性而幸存下来的疟原虫的传播。TBVs的另一个用途是对旅游者进行免疫，以防止他们将疟原虫带入非流行区，造成流行。由于肝内期疫苗、红内期疫苗候选抗原分子暴露于人体免疫系统，受到人体免疫压力等因素的影响，候选抗原存在广泛的基因多态性。TBVs候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面，此类抗原并不在脊椎动物免疫系统选择压力之下，所以这些蛋白显示出非常低的多态水平，不会出现抗原变异，有利于疫苗免疫效果，被认为可以有效地阻断疟疾从蚊媒向人的传播，是当前疟疾疫苗研究的热点之一。天然Pf s25抗原及其突变体Pfs25 (Plasmodium falciparum s25)是恶性痕原虫合子或动合子主要表面蛋白，是介导动合子穿越围食膜和对蚊中肠壁基底膜侵入的关键性蛋白。天然的pfs25蛋白质，存在于恶性疟原虫子孢子囊膜表面，由217个氨基酸组成，分子量25Kd，富含半胱氨酸。在结构上，Pfs25天然蛋白的N端22个氨基酸是信号肽序列，C端的24个氨基酸是膜结合区域，该蛋白存在四个“EGF样的结构域”，23个半胱氨酸形成了九对二硫键。Pfs25是糖蛋白，一共有四个糖基化位点，其中，112、165、187和202位的天冬酰胺(Asn，N)上形成了 N型糖链，196位的丝氨酸(Ser, S)上形成了糖基化磷脂酰肌醇锚定的糖链(GPI_anchor)。具体参见 Kaslow DC 等在 Nature. 1988 May 5; 333 (6168) :74-6.的公开。Pfs25蛋白采用酵母表达，常常出现过度的糖基化修饰以及表达产物的不均一的问题。在已有的研究中，Kaslow DC设计了一种非糖基化突变体pfs25-B，该突变体相当于pfs25天然序列的第22-188位氨基酸，并将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为丙氨酸(Ala，A)，使其丧失糖基化功能。pfs25-B在酵母表达，得到较均一的表达产物，参见Nature. 1988 May 5; 333 (6168) :74-6.以及US5217898。用该突变体制备的单抗4B7,目前已经成为pfs25蛋白的标准化单抗供全球研究人员使用，参见The Journalof experimental medicine. 1991 Novl; 174(5) : 1203-8。2003 年，Zou L 设计了另一种非糖基化突变体，该突变体相当于Pfs25天然序列的第23-193位氨基酸，并将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(Gln，Q)。该突变体在酿酒酵母和毕赤酵母中成功表达，美国NIH基于该突变体进行了 I期临床研究，结果参见Zou L等在Vaccine. 2003Apr2; 21 (15) :1650-7.的公开以及 Wu Y 等在 PloS one. 2008; 3 (7) :e2636.的公开。
本发明人在前期工作中，设计了另一种非糖基化突变体，相当于pfs25天然序列的第23-193位氨基酸，并将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为谷氨酸(Glu，E)，在毕赤酵母中成功表达，得到的Pfs25蛋白突变体能够和4B7特异性反应，且在接种小鼠后可以激发免疫应答。上述突变体均为本发明所用，分别简称为pfs25_3A突变体、pfs25_3Q突变体和pfs25-3E突变体。 化学交联方法获得的Pfs25蛋白衍生物pfs25蛋白质在人体内能够激发免疫应答，但是，血清抗体效价较低，维持时间短暂。作为候选疫苗而言，Pfs25蛋白质的免疫原性较弱，有待于进一步的增强。Feng Qian等将pfs25蛋白与重组绿脓杆菌外毒素A (rEPA)在体外进行化学交联，得到的交联物pfs25-rEPA的免疫原性明显高于pfs25蛋白本身，具体参见Vaccine. 2007; 25 (20) : 3923 - 3933。Joanna Kubler-Kielb 等研究了一 系列的 pfs25 蛋白交联物，包括Pfs25与自身交联、pfs25与卵清蛋白(OVA)交联、pfs25与重组绿脓杆菌外毒素A (rEPA)交联，可以采用不同的连接集团，使得pfs25与载体蛋白或自身之间以酰胺键、腙键、硫醚键等不同方式连接，得到多种连接产物。交联物对NIH小鼠进行2-3次注射免疫，末次免疫后3月、7月的抗体水平高于末次免疫后一周的抗体水平，具体参见PNAS. 2007;104(1):293 - 298。基因重组方法获得的Pfs25蛋白衍生物运用DNA重组技术，可将具有不同功能的蛋白结构域片段重组成为融合蛋白，例如，将具有不同抗原结合特性的抗体可变区序列进行重组得到双特异性抗体，以及将某些受体的胞外可溶性片段与抗体Fe片段融合得到新的融合蛋白等等。具有不同功能的蛋白结构域片段之间进行重组操作时，通常需要在两个功能片段之间增加一个连接臂(linker), 一般情况下该连接臂对于两个被连接的蛋白功能片段仅仅起到物理连接的作用，而不赋予融合蛋白新的功能，也不影响两个被连接蛋白片段的功能。连接臂的设计，多选择分子量小、性质不活泼的甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)和丝氨酸(Ser, S)构成linker,例如,悅剑锋等在设计“抗-GD2/抗-⑶16”双特异性单链抗体时，采用“SGGGGS”作为linker (《生物医学工程学杂志》，2007; 24 (3) :659-663. )；TrinhR等在构建抗HER2/neu单链抗体时，在VH和VL之间采用了(GGGGS) 3作为linker (MolImmunol. 2004 Jan; 40 (10) :717-22. ) ；Xi Y等在构建人白细胞抗原B7_2胞外区和假单胞菌外毒素A突变体(PE40KDEL)融合蛋白时，选用(GGGGS)4作为linker (J Immunother. 2006Nov-Dec; 29 (6) : 586-95.);在极个别情况下，也有研究人员使用天冬酰胺(Asn，N)、脯氨酸(Pro, P)、赖氨酸(Lys, K)和缴氨酸(Val, V)等其他氨基酸构成连接臂(linker)的。例如，Lu P等在设计β -葡聚糖酶和木聚糖酶融合蛋白时，采用了(GGGGS) η (η < 3)、(EAAAK)η (η ^ 3)两种类型的 linker (Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Jun; 79 (4) : 579-87.)；Xu J等构建AnsB-C与GnRH3-hinge-MVP杂合多肽的融合蛋白，两者之间插入Asp-Pro酸不稳定的二肽linker。在以上研究中，甘氨酸和丝氨酸构成的linker形成一段柔性的多肽链，没有固定的空间结构；而包含谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸的linker如(EAAAK) η (η ( 3)则形成相对刚性的α螺旋二级结构；包含脯氨酸的linker，具有强烈的中断多肽二级结构的作用，用于分隔紧密相邻的多肽。后两种linker可能赋予融合蛋白新的功能或者影响两个pfs25亚基的功能。本发明旨在将两个pfs25串联成为二聚体，以期增加pfs25的免疫原性。本发明的连接臂仅仅起到物理连接作用，并不赋予融合蛋白新的功能，也不影响两个Pfs25亚基的功能。因此，甘氨酸、丝氨酸构成的，可形成柔性结构的linker适应于本发明。甘氨酸和丝氨酸的不同组合及linker长度不是固定的，只要满足本发明目的即可。酵母表达质粒pPICZ a A、pGAPZ α A、抗生素Zeocin和菌株GSl 15均购自Invitrogen公司；限制性内切酶Xho I、Xba I、BstX I和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶购自Roche公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司；PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；标准蛋白质分子量购自GE公司。抗pfs25单克隆抗体 4B7 和 pfs25 标准蛋白由美国 MR4 (Malaria Research and Reference ReagentResource Center, NIH)提供；HRP标记兔抗鼠IgG购自Sigma公司；其他试剂为进口或国产·分析纯。实施例I、Pfs25蛋白突变体基因的合成与酵母表达载体构建( I)突变体基因设计与合成根据GenBank中公布的pfs25基因信息(GenBank locus X07802),其编码的天然Pfs25蛋白第23位至第193位氨基酸序列如下KVTVDTVCKRGFLIQMSGHLECKCENDLVLVNEETCEEKVLKCDEKTVNKPCGDFSKCIKIDGNPVSYACKCNLGYDMVNNVCIPNECK g VTCGNGKCILDTSNPVKTGVCSCNIGKVPNVQDQNKCSKDGETKCSLKCLKE g ETCKAVDGIYKCDCKDGFIID 画 ESSICT其中相当于天然pfs25蛋白第112，165，187位为天冬酰胺(N)，是pfs25蛋白的糖基化位点。本发明设计的pfs25蛋白非糖基化突变体，简称为pfs25_3E，该突变体相当于天然Pfs25蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112，165，187的天冬酰胺突变为谷氨酸，具体见序列表SEQ. NO. I。按照毕赤酵母喜好密码子设计编码本发明突变体(SEQ. NO. I)的核苷酸序列，见序列表SEQ. NO. 2。按照Zou L 等在 Vaccine. 2003Apr 2; 21 (15) :1650-7.公开的 pfs25 蛋白突变体序列，简称为pfs25-3Q，具体见序列表SEQ. NO. 3。本发明设计了符合毕赤酵母喜好密码子的核苷酸序列，见序列表SEQ. NO. 4。上述SEQ. NO. 2、SEQ. NO. 4核苷酸序列委托上海生工生物工程有限公司合成，上海生工生物工程有限公司合成的SEQ. NO. 2、SEQ. NO. 4核苷酸序列分别克隆到pUC57载体，称为pfS25-3E/pUC57、pfS25-3Q/pUC57，测序正确；合成引物以冻干形式提供。(2)酵母表达载体构建包含目的基因的克隆载体pfs25_3E/pUC57和包含三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的酵母表达载体pGAPZ α Α,分别用限制性内切酶Xho I和Xba I进行双酶切操作。利用T4DNA连接酶将目的基因亚克隆到pGAPZ a A得到重组质粒pfs25_3E/pGAPZ α Α,转化E. coli ToplOF’，提取质粒，酶切和测序鉴定阳性克隆，pfs25-3E/pGAPZa A质粒的Xho I和Xba I双酶切电泳见图I。采用相同方法，将pfs25_3Q基因克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的酵母表达载体pGAPZ a A上，得到重组质粒pfs25_3Q/pGAPZ a A0上述两种表达载体Pfs25_3E/pGAPZ a A、pfs25_3Q/pGAPZ a A经测序鉴定，结果正确。Pfs25-3E 突变体 DNA 序列见 SEQ. NO. 2，pfs25_3Q 突变体 DNA 序列见 SEQ. NO. 4。实施例2、Pfs25-3E突变体的表达及表达产物的鉴定阳性重组表达质粒Pfs25_3E/pGAPZ a A经BstX I酶切线化后，电转染法转化感受态毕赤酵母GS115 ;以空白质粒pGAPZ a A转染酵母菌，制备阴性对照菌株。电转条件
I.5kV，250yF，200Q。电击结束后，立即加入800 μ I IM山梨醇，混勻，30°C放置2小时，取
适量转化物涂布于含有100 μ g/ml Zeocin的YPD固体筛选培养基上，30°C湿盒静置，3-5天后可见单克隆菌落出现。挑取阳性克隆，即为酵母重组菌Pfs25-3E/pGAPZaA/GS 115。挑取Pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115阳性克隆转接到3mlYPD液体培养基的20ml三角瓶中，30°C>250r/min摇床培养、表达，每隔24h取样，8000r/min离心3min，取上清_20°C保存。阴性对照菌株pGAPZ aA/GSl 15同步培养并留样。将所有重组菌及阴性菌不同时间的表达上清留样进行电泳操作，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为5%，采用考马斯亮蓝作为蛋白染色剂。以pfs25标准品作为阳性对照，阴性菌表达上清作为阴性对照，pfs25-3E/pGAPZ a A/GS 115重组酵母菌培养72小时的表达上清电泳结果见图2。所有重组菌在21kd的位置有目的蛋白条带，这说明pfs25蛋白质被重组酵母菌分泌表达到培养基中。将pfs25-3E/pGAPZ aA/GSl 15 培养 24、48、72 小时的表达上清进行 SDS-PAGE，以pfs25标准蛋白、pGAPZ a A/GS115阴性菌表达上清作对照。SDS-PAGE电转移到PVDF膜上，逐次与4B7单克隆抗体和HRP标记兔抗鼠IgG反应，化学发光法显色观察结果。结果见图3，可见不同培养时间的表达产物与pfs25标准蛋白有相同的特异性反应，随着培养时间延长，表达量增加。实施例3、Pfs25-3Q突变体的表达采用实施例2的转化方法制备pfs25_3Q/pGAPZaA/GS115重组菌，共挑选9个克隆，分别表示为克隆Q2-10。挑取Q2-10阳性酵母重组菌转接到3mlYPD液体培养基的20ml三角瓶中，30°C、250r/min摇床培养、表达，72小时取样，8000r/min离心3min，取上清进行SDS-PAGE检测。所有重组菌在标准蛋白的相应位置有目的蛋白条带，但表达量较低，具体结果见图4。实施例4、发酵罐表达的重组pfs25_3E蛋白纯化采用10升发酵罐对Pfs25_3E/pGAPZ a A/GS115重组菌进行发酵培养。挑选单克隆菌落在IOOmLYPD中进行培养，29. 0°C，pH6. (Γ4. 0,250rpm的转速培养18小时后，镜检合格的种子接种到发酵罐中，以1:15的比例接种。发酵参数为29.0°C，ρΗ6·(Γ4·0，溶氧>20%，转速约 350rpm，通气速度 350L/h，Antifoam 204作为消泡剂(SIGMA)。发酵表达时，发酵罐自动补加50% (V/V)的葡萄糖，使发酵液中的葡萄糖终浓度维持在O. 5-lg/L，表达24小时后，以4000rpm、15min离心，收集上清作为表达产物。收集表达上清6. 5升，用O. 45um的中空纤维超滤膜进行初步过滤后，用5kD的超滤膜浓缩，得到滤过液200毫升。滤过液上样离子交换层析，层析介质为SP Sepharose BigBeadsCGE healthcare),以NaCl溶液梯度洗脱，先用O. 3M NaCl进行洗脱，收集洗脱液；再用I. OM NaCl进行洗脱，收集洗脱液；取部分洗脱液电泳检查，可见I. OM NaCl洗脱峰为目标蛋白，纯度达到95%以上；0. 3M NaCl洗脱峰则含有较多杂蛋白，具体见图5。将O. 3M NaCl洗脱液进行第二步凝胶过滤层析,介质为superdex 200,洗脱液为O. lmol/L的NaCl，分部收集洗脱液；取凝胶过滤洗脱液电泳检查，可见在第4_6管为目标蛋白，纯度达到95%以上；第1-3管为杂蛋白，具体见图6。将I. OM NaCl进行离子交换层析洗脱液与凝胶过滤层析4_6管的洗脱液合并，常规方法透析、冻干，得到280mg的pfs25纯品蛋白。实施例5、采用(GGGGS)3十五肽连接臂的pfs25 二聚体基因的合成和表达载体的构建 (I)、(pfs25_3E)2 二聚体基因的构建以pfs25_3E/pUC57载体质粒为模板进行重叠PCR (overlapping PCR)操作,两个拷贝的Pfs25基因通过(GGGGS)3的十五肽“连接臂(linker)串联成为二聚体基因，连接臂的G代表甘氨酸，S代表丝氨酸。利用引物设计软件Primer premier5. O设计四条引物,委托上海生工生物工程有限公司合成。引物a:GGACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGAAAGTAACAGTCGATACT (下划线为 Xho I 识别位点)；引物b:AGATCCACCGCCTCCGGAACCACCACCCCCAGAACCGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATGATAAATC ；引物c:GGAGGTGGCGGTTCTGGGGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTAAAGTAACAGTCGATACTGTGTGTAAGAGAGGCTT ；引物d GGTCTGATTAAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATG (下划线为 Xha I 识别位点)目的基因的重叠PCR分四步进行第一次PCR :用“引物a”和“引物b”，模板是pfs25_3E/pUC57载体质粒；第二次PCR :用“引物c”和“引物d”，模板是pfs25-3E/pUC57载体质粒；第三次PCR :不添加引物，将第一次PCR和第二次PCR的产物混合，10个循环；第四次PCR :用“引物a ”和“引物d ”，模板是第三次PCR产物。PCR 反应条件95°C、4min ;95°C、60 秒，55°C、60 秒，72°C、70 秒，30 个循环；72°C、7min。通过四次PCR操作获得的双拷贝pfs25_3E基因，简称为pfs(25_3E)2，电泳结果见图7。将overlapping PCR产物纯化后，按照试剂盒说明书与pMD18_T Simple Vector进行连接反应。连接产物转化T0P10F’感受态细菌，涂布Amp抗性的LB固体培养基，对所获得的克隆进行PCR、Xho I和Xba I双酶切鉴定及测序分析，结果均为阳性的克隆就是(pfs25-3E) 2/pMD18-T 重组质粒。用限制性内切酶Xho I和Xba I分别对pf s (25-3E) 2/pMD18_T质粒和pPICZ a A载体质粒进行双酶切操作，利用T4DNA连接酶将(pfs25-3E) 2基因与pPICZ a A载体片段连接，过夜，得到的(pf s25-3E) 2/pPICZ a A重组表达质粒转化T0P10F’感受态细菌，涂布zeocin抗性选择的LB固体培养基，提取质粒，PCR、酶切和测序鉴定阳性克隆。重组表达质粒(pfs25-3E)2/pPICZαA经引物a和引物d进行PCR、Xho I和Xba I双酶切，电泳后，在IOOObp的位置有目的基因条带，结果见图8。(pfs25-3E)2DNA测序结果见SEQ. NO. 6，推测的蛋白质序列见SEQ. NO. 5。(2)、Pfs25_3Q 二聚体基因的构建以Pfs25_3Q/pUC57 质粒为模板，重叠 PCR(overlapping PCR)构建 &€825_30)2基因。四条重叠PCR引物，其中引物a和引物c与Pfs25-3E相同，引物b和引物d与Pfs25-3E不同，具体为引物b: AGATCCACCGCCTCCGGAACCACCACCCCCAGAACCGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTGGTCGATGATAAATC ；引物d GGTCTAGATTAAGTACATATTGATGATTCCTGGTCGATG引物b和引物d中下划线标示的三联体密码，与Pfs25_3E的引物不同，具体对应于Pfs25-3Q蛋白突变体187位的谷氨酰胺。参照(pfs25-3E)2:聚体基因的构建和克隆步骤，得到(pfs25_3Q) 2/pMD18_T质粒和(pfs25-3Q)2/pPICZ a A重组表达质粒，经测序鉴定结果正确。(pfs25_3Q) 2DNA测序结果见序列表SEQ. NO. 8，推测的蛋白质序列见SEQ. NO. 7。实施例6、采用(GGGS) 4十六肽连接臂的pfs25 二聚体基因的合成和表达载体的构建以pfs25_3E/pUC57载体质粒为模板进行重叠PCR (overlapping PCR)操作，两个拷贝的Pfs25基因通过(GGGS) 4的十六肽“连接臂(linker)串联成为二聚体基因，连接臂的G代表甘氨酸，S代表丝氨酸。利用引物设计软件Primer premier5. O设计四条引物,委托上海生工生物工程有限公司合成。引物a:GGACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGAAAGTAACAGTCGATACT (下划线为 xho I 识别位点)引物b:AGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATGATAAATC引物c:GGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTAAAGTAACAGTCGATACTGTGTGTAAGAGAGGCTT引物d:GGTCTAGATTAAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATG (下划线为 xba I 识别位点)参照实施例5的克隆操作步骤，构建了包含(GGGS) 4作为linker的pfs25_3E 二聚体的重组表达质粒(pfs25-3E) ’ 2/pPICZ α Α,经测序鉴定结果正确，(pfs25_3E) ’ 2的DNA测序结果见SEQ. NO. 10，推测的蛋白质序列见SEQ. NO. 9。实施例7、重组酵母菌(pfs25-3E)2/pPICZ aA/GSl 15的构建及鉴定阳性重组表达质粒(pfs25_3E)2/pPICZ a A经BstX I酶切线化后，电转染法转化感受态毕赤酵母GS115。电击结束后，立即加入800 μ I IM山梨醇，混匀，30°C放置2小时，取适量转化物涂布于含有100 μ g/ml Zeocin的YPD固体筛选培养基上，30°C湿盒静置，3-5天后可见单克隆菌落出现。随机挑取若干菌落接种于3πι1ΥΗ)培养基中，30°C生长过夜，收集菌体，用引物a、引物d进行PCR鉴定，阳性酵母重组菌为(pfs25-3E)2/pPICZ a A/GS115。挑取(pfS25-3E)2/pPICZαA/GS115重组酵母菌菌落，于2mlYB)培养液中，30°C，250r/min培养过夜，次日离心收集菌体，转接于3ml YI3D培养液中继续培养。每隔24h补加 甲醇至终浓度为2%，并留样。培养及诱导表达至72h，收集上清。pPICZ aA/GSl 15菌作为阴性对照同步诱导表达。将所有重组菌及阴性菌不同时间的表达上清留样进行电泳操作，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为5%，采用考马斯亮蓝作为蛋白染色剂，结果见图9。结果显示在45kd的位置有目的蛋白质，这说明(pfs25-3E)2蛋白质被重组酵母菌分泌表达到培养基中。利用专业的凝胶电泳条带分析软件ImageQuant TL (GE Healthcare公司)对图9的结果中(pfs25-3E)2蛋白的含量进行了分析，结果见表I。可以看到(pfs25-3E)2蛋白(条带4)占重组酵母表达上清总蛋白的68%，该表达量完全可以用于未来的大规模工业化生产。表I : ImageQuant TL 软件分析(pf s25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重组酵母菌表达上
清
权利要求
1.一种恶性疟原虫Pfs25蛋白的二聚体衍生物，具有如下结构pfs25_L_pfs25 其中pfs25代表pfs25蛋白突变体，L代表连接臂(linker)； 所述的pfs25蛋白突变体包括相当于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突变体； 所述的连接臂具有如下结构Sa_(GbS)。，其中S代表丝氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4, c=l-4的整数。
2.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突变体相当于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替换为丙氨酸。
3.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突变体相当于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替换为谷氨酰胺。
4.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突变体相当于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替换为谷氨酸。
5.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的连接臂具有SGGGGS的结构。
6.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的连接臂具有(GGGGS)3的结构。
7.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，所述的连接臂具有(GGGS)4的结构。
8.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，Pfs25蛋白的二聚体衍生物具有序列表Seq. No. 5所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求I的Pfs25蛋白的二聚体衍生物，其特征在于，Pfs25蛋白的二聚体衍生物具有序列表Seq. No. 7所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的Pfs25蛋白的二聚体衍生物的用途，用于制备预防恶性疟疾的疫苗。
全文摘要
本发明属于传染病防治领域，具体涉及用于阻断恶性疟疾传播的疫苗的候选靶抗原。本发明采用基因重组手段，构建成恶性疟原虫pfs25蛋白二聚体衍生物，该二聚体衍生物包括被连接臂连接的两个pfs25蛋白质单元。获得的二聚体衍生物增强了pfs25蛋白的免疫原性，在动物体内能够激发更高的抗体应答。该二聚体可被重组酵母细胞高表达产生，并分泌到培养基中。经纯化，得到成分均一的表达产物，适合大规模生产。该恶性疟原虫pfs25蛋白二聚体衍生物有望成为恶性疟传播阻断型疫苗的候选抗原。
文档编号A61P33/06GK102838668SQ20121033867
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者陈勇, 蒋琳, 高雪峰, 雷清, 杨军, 李刚 申请人:兰州生物制品研究所有限责任公司