异二聚体蛋白的生成的制作方法

异二聚体蛋白的生成的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法。
【专利说明】异二聚体蛋白的生成 发明领域
[0001] 本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括在还原性条件下温育第一 和第二同二聚体蛋白的第一步和使从第一步获得的组合物经受氧化条件的第二步。本发明 的方法特别适合于包含抗体的异二聚体蛋白的大规模生产。
[0002] 发明背景
[0003] 近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。双特异性抗体 可进一步能够提高单克隆抗体疗法的效力和功效，例如它们可以用于将药物或毒性化合物 引导至靶细胞，用于将效应器机制再引导至疾病相关部位或提高对肿瘤细胞的特异性，例 如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。此外，通过在一种双特异性抗体中组合两 种单克隆抗体的特异性可以潜在连结较大的一批作用机制，即其组合的作用机制。
[0004] 最近Chames and Baty (2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12:276 已经综述了关于 双特异性抗体的不同形式和用途。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以 制备足够质量和数量的材料，所述传统技术诸如杂交杂交瘤和化学缀合方法（Marvin and Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞 中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。
[0005] 已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的（即双特异性） 产物。
[0006] Lindhofer 等（1995J Immunol 155:219)公开 了大鼠 / 小鼠四源杂交瘤 (quadroma)中优先的物种限制性重/轻链配对。
[0007] 用于形成双特异性抗性的技术是所谓的"隆突-入-空穴（knob-into-hole) "策 略（美国专利5,731，168)。EP1870459(Chugai)和TO2009089004(Amgen)描述了有利于 在不同抗体域在宿主细胞中共表达后形成异二聚体的其它策略。在这些方法中，构成重链 恒定域3 (CH3)，即两个CH3域中的CH3-CH3界面的一个或更多个残基被荷电氨基酸置换，使 得在静电上不利于形成同二聚体且在静电上利于异二聚体化。W02007110205 (Merck)描述 了又一种策略，其中利用IgA与IgG CH3域之间的差异促使异二聚体化。
[0008] Dali'Acqua 等（1998Biochemistry 37:9266)已鉴定五个参与 CH3 同二聚体界面 处的CH3-CH3接触的在能量上关键的氨基酸残基（366、368、405、407和409)。
[0009] W0 2008119353 (Genmab)描述了用于抗体生成的离体方法。
[0010] W0 11/131746 (Genmab)公开了含有抗体Fc的异二聚体蛋白及其生成方法。
[0011] 本发明涉及用于生成异二聚体蛋白，诸如稳定的IgGl双特异性抗体的方法，其中 所述方法特别适合于稳定的异二聚体蛋白的大规模生产，其中将二硫键再氧化。通过在同 二聚体的CH3域中引入不对称的突变，可以迫使Fab臂交换反应由于CH3域的互补性而变 为方向性的，且由此产生高度稳定的异二聚体蛋白。
[0012] 发明概述
[0013] 在一个方面，本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
[0014] a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原 性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
[0015] 其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一 CH3区， 且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，且其中所述 第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互 作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
[0016] b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚 体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
[0017] 在另一个方面，本发明步骤a)用下列步骤替换：
[0018] X)提供编码包含第一免疫球蛋白的Fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第 一 Fc区包含第一 CH3区，
[0019] y)提供编码包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第 二Fc区包含第一 CH3区，
[0020] 其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之 间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且
[0021] 其中所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有除了 Lys、Leu或Met外的氨基酸， 且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和 407,
[0022] 和 / 或
[0023] 其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个 所述CH3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0.01和10微摩尔，诸如介于0.05和10 微摩尔之间，更优选介于0. 01和5之间，诸如介于0. 05和5微摩尔之间，甚至更优选介于 0. 01和1微摩尔之间，诸如介于0. 05和1微摩尔之间，介于0. 01和0. 5之间或介于0. 01 和0. 1之间，
[0024] z)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体。
[0025] 附图简述
[0026] 图1 :通过种间Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过ELISA测定GSH诱导的指定 的抗EGFR(2F8)和CD20 (7D8) IgG4抗体之间的体外Fab-臂交换后双特异性抗体的生成。 在ELISA中分析0-1 μ g/mL的浓度系列（总抗体）。双特异性结合在Fab-臂交换后在猕猴 (Rh)和人（Hu) IgG4抗体之间比在同一物种的两种抗体之间高。
[0027] 图2 :人和猕猴抗体同种型的核心铰链（即人IgGl中的CPPC序列，其包含潜在形 成重链间二硫键的两个半胱氨酸残基和其它人和猕猴同种型中的相应残基）和CH3-CH3界 面的氨基酸序列的比对。
[0028] 图3 :使用参与进行Fab-臂交换的突变体人IgGl生成双特异性抗体。通过 ELISA测定通过GSH诱导的人CD20(7D8) IgG4抗体和指定的人EGFR(2F8) IgGl抗体之间 的体外Fab-臂交换进行的双特异性抗体生成。呈现的图显示了三次独立Fab-臂交换实 验的平均数，其中使用总抗体浓度1 μ g/mL进行ELISA。双特异性结合在Fab-臂交换后 在IgGl-2F8-CPSC-ITL和IgG4-7D8之间比在两种IgG4抗体之间高。组合IgG4-7D8与 IgGl-2F8、IgGl-2F8-CPSC或IgGl-2F8-ITL在使用的条件下不生成双特异性抗体。
[0029] 图4 :通过人IgG4和突变体IgGl抗体的体内Fab-臂交换生成双特异性抗体。通 过ELISA测定通过在免疫缺陷小鼠中人CD20(7D8) IgG4和指定的人EGFR(2F8) IgGl和IgG4 突变体抗体之间的体内Fab-臂交换进行的双特异性抗体生成。呈现的图显示了平均数（η = 4)。双特异性反应性以相对于总IgG浓度的双特异性抗体浓度（百分比）呈现。具有 稳定化铰链（CPPC)或CH3域中的R409K突变的人IgG4不能参与Fab-臂交换。具有铰链 中的CPSC序列和CH3域中的K409R突变两者的的IgGl参与进行Fab-臂交换。（*)含有 IgGl-2F8、IgG4-2F8-CPPC或IgG4-2F8-R409K的混合物的双特异性结合低于检测线，因此 任意设置为0。
[0030] 图5 :使用2-巯基-乙胺· HC1- (2-MEA-)诱导的人IgGl和IgG4抗体之间 的Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过ELISA测定2-MEA诱导的指定人EGFR(2F8)和 ⑶20 (7D8)抗体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。测试0-40mM2-MEA的浓度 系列。呈现的图显示了 ELISA的结果，其中使用20 μ g/mL的总抗体浓度。2-MEA也在含有 稳定化铰链（CPPC)的抗体之间有效诱导Fab-臂交换。关于CH3域，与两种野生型IgG4抗 体相比，人IgG4 X具有三重突变T350I-K370T-F405L的人IgGl的组合产生更高水平的双 特异性反应性。
[0031] 图6 :使用2-MEA诱导的人IgGl和IgG4抗体之间的Fab-臂交换生成双特异性抗 体。
[0032] 对0_40mM 2-MEA的浓度系列的所有样品通过质谱术测定2-MEA诱导的指定人 EGFR(2F8)和⑶20(7D8)抗体之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。（A)显示了 用 0mM、7mM 和 40mM2-MEA 进行 IgGl-2F8-ITL xIgG4-7D8-CPPC 之间的 Fab-臂交换反应的 样品的质谱图的代表性例子。（B)在量化质谱数据后，计算百分比双特异性抗体，并相对于 Fab-臂交换反应中的2-MEA浓度绘图。IgG4-2F8x IgG4-7D8生成最大约50%的双特异性 抗体。IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC生成最大约95%的双特异性抗体。
[0033] 图7 :通过2-MEA诱导的Fab-臂交换获得的异二聚体双特异性抗体的稳定性分 析。通过在存在指定浓度的无关IgG4的情况中在GSH诱导的Fab-臂交换反应后在ELISA 中测量EGFR/CD20双特异性结合测试通过组合IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC(A)或 IgG4-2F8 X IgG4-7D8(B)通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性样品的稳定性。相 对于起始材料（对照）的双特异性结合（其设置为100% )呈现双特异性结合。（A)2-MEA 诱导的源自IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC的双特异性产物的双特异性结合是保留的， 指示不参与在GSH条件下的Fab-臂交换的稳定产物。（B) 2-MEA诱导的源自I gG4-2F8x IgG4-7D8的双特异性产物的双特异性EGFR/CD20结合是减少的，指示参与在GSH条件下与 无关IgG4的Fab-臂交换的产物。
[0034] 图8 :通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的异二聚体双特异性抗体的血浆清除 率。给三组小鼠（每组3只小鼠）注射指定的抗体：（1)100 μ g双特异性抗体，其通过体外 2-MEA 诱导的 IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC 之间的 Fab-臂交换生成；（2)100yg 双特异 性抗体 +1，〇〇〇 μ g 无关 IgG4 ; (3) 50 μ gIgGl-2F8-ITL+50 μ g IgG4-7D8-CPPC。（A)随时间 的总抗体浓度，其通过ELISA测定。总抗体血浆浓度的曲线对于所有抗体是相同的。（B)双 特异性抗体浓度，如通过ELISA测定的。注射抗体的双特异性在添加和不添加过量的无关 IgG4的情况中是相同的。（*) IgGl-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC混合物的双特异性结合低于检 测限，因此相应的符号不能在此图中绘制。显示了两次ELISA实验的平均值。
[0035] 图9 :通过人IgGl-2F8and IgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换生成的双特异性抗 体的纯度。（A)还原性SDS-PAGE(a)显示了双特异性样品和IgGl对照样品两者的重链和 轻链的条带。非还原性SDS-PAGE(b)显示了完整的IgG。（B)来自ΗΡ-SEC的峰结果显示了 >98%的双特异性样品是均质的，且实际上没有检测到抗体聚集物。（C)质谱显示了 Fab-臂 交换生成约100 %双特异性产物。
[0036] 图10 :在通过与人IgG4_7D8的Fab-臂交换生成双特异性抗体中三重突变体 (ITL)、双重突变体（IT、IL、TL)和单突变体（L)人IgGl-2F8之间的比较。通过ELISA测定 在2-MEA诱导的人IgGl-2F8三重和双重突变体和具有CPSC铰链的野生型IgG4-7D8 (A)或 具有稳定化铰链的突变体IgG4-7D8-CPPC(B)，或单突变体IgGl-2F8-F405L和具有野生型 CPSC或稳定化CPPC铰链的IgG4-7D8 (C)之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。 对于包括双重和单突变体的实验，在ELISA中分别分析0-20 μ g/mL或0-10 μ g/mL的浓度 系列（总抗体）。IgG4与双重突变体IgGl-2F8-IL和-TL的组合与三重突变体IgGl-ITL 产生相似的双特异性EGFR/⑶20结合。与IgGl-2F8-IT的组合不生成双特异性产物。IgG4 野生型和具有稳定化铰链的IgG4两者与单突变体IgGl-2F8-F405L的组合产生双特异性 EGFR/CD20 结合。
[0037] 图11 :在不同温度使用2-MEA诱导的Fab-臂交换生成双特异性抗体。通过于0°C、 20°C和37°C在2-MEA诱导的体外Fab-臂交换反应中组合指定的人EGFR(2F8)和CD20 (7D8) 抗体进行的双特异性抗体生成在时间上继之以ELISA。双特异性结合的诱导于37°C最有 效，并且于20°C较慢。于0°C，没有测量到双特异性结合的产生。
[0038] 图12 :通过由不同还原剂诱导的体外Fab-臂交换生成双特异性抗体。使用ELISA 测量通过用浓度系列的指定还原剂的还原反应中组合人IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC 进行的双特异性抗体生成。在用DTT (在2. 5mM DTT获得最大值）和2-MEA (在25mM2-MEA 获得最大值），但不用GSH的反应后测量双特异性结合。（*)由于形成抗体聚集体而排除 GSH浓度>10mM的数据。
[0039] 图 13 :2-MEA 诱导的 IgGl-2F8-ITL 和 IgGl-7D8-K409X 突变体之间的 Fab-臂交 换。通过ELISA测定2-MEA诱导的IgGl-2F8-ITL和指定的IgGl-7D8-K409X突变体之间的 体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。⑷分析0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）。阳 性对照是纯化的一批源自IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC的双特异性抗体。（B)交换以 20 μ g/mL时相对于阳性对照（黑色柱形）的双特异性结合呈现。暗灰色柱形表示IgG4对 照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)、阴性对照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之间和 IgGl-2F8-ITL 与IgG4-7D8-CPPC之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-7D8-K409X突变 体和IgGl-2F8-ITL之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0040] 图14 :抗体去糖基化不影响通过2-MEA诱导的Fab-臂交换进行的双特异性抗体 生成。通过ELISA测定2-MEA诱导的指定EGFR(2F8)和CD20(7D8)抗体之间的体外Fab-臂 交换后的双特异性抗体生成。与其酶促去糖基化的变体比较与7D8抗体的交换。在ELISA 中分析0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）。牵涉去糖基化（deglyc)抗体的Fab-臂交换反 应与源自其的糖基化变体显示了相同的双特异性结合曲线。
[0041] 图15 :参与Fab-臂交换的能力与CH3-CH3相互作用强度相关联。（A)、⑶和（C) 通过具有指定突变的IgGl-2F8和IgGl-7D8 (A)或IgG4-2F8和IgG4-7D8 (B和C)构建体之 间的GSH诱导的Fab-臂交换生成双特异性抗体，其在ELISA中随时间以双特异性结合呈 现。相对于24小时后IgG4-2F8 xIgG4-7D8对照呈现双特异性。（D)和（E)基于IgGl的 (D)或基于IgG4的（E)分子的表观KD(表2)和24小时后的双特异性抗体生成（图15A/ B/C)之间的关系。
[0042] 图16 :IgGl、IgG4和（部分）IgG3主链中抗EGFr抗体2F8的序列比对。描绘了依 照Kabat和依照EU索引的氨基酸编号方式（两者记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。SEQ ID N0:10 中给出 2F8-G1，SEQ ID N0:11 中给出 2F8-G3 (部分），而 SEQ ID NO: 12 中给出 2F8-G4。
[0043] 图17 :通过由不同还原剂诱导的体外Fab-臂交换生成双特异性抗体。使 用ELISA测量通过在用浓度系列的指定还原剂的还原反应中组合人IgGl-2F8-F405L 和IgGl-7D8-K409R的双特异性抗体生成。相对于源自2-MEA诱导的IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之间的Fab-臂交换的双特异性对照样品的信号（其设置为100% )标准 化测量的0D值。在用浓度范围0. 5-50mM的DTT、浓度范围25-50mM的2-MEA和浓度范围 0. 5-5. OmM的三（2-羧乙基）膦（TCEP)，但不用GSH的反应后测量最大双特异性结合。（*) 由于形成抗体聚集体而排除GSH浓度彡25mM的数据。
[0044] 图 18 :使用 2-MEA 诱导的人 IgGl-2F8-F405L 和 IgGl-7D8-K409R 之间的 Fab-臂 交换生成双特异性抗体。
[0045] ㈧通过ELISA测定2-MEA诱导的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。 呈现的图显示了 ELISA的结果，其中使用20μ8/ιΛ的总抗体浓度。2-MEA有效诱导人 IgGl-2F8-F405L 和 IgGl-7D8-K409R 之间的 Fab-臂交换。（Β)对于浓度系列 0-40mM2-MEA 的所有样品，通过质谱术测定2-MEA诱导的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。在量 化质谱数据后，计算双特异性抗体的百分比，并且相对于Fab-臂交换反应中的2-MEA浓度 绘图。IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换在测试的最高2-MEA浓度产 生约100 %双特异性抗体，这确认ELISA数据。
[0046] 图19 :通过人IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双 特异性抗体的纯度。质谱法显示了 Fab-臂交换生成约100%双特异性产物。
[0047] 图20 :通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性抗体的血浆清除。给两组 小鼠（每组3只小鼠）注射指定的抗体：（1) 100 μ g双特异性抗体，其通过体外2-MEA诱导 的1861-2?844051^11861-708-1(4091?之间的？ &13-臂交换生成；（2)10(^8双特异性抗体 +l，000μg无关IgG4(10xIgG4)。（A)随时间的总抗体浓度，其通过ELISA测定。对于所有 抗体，总抗体血浆浓度的曲线是相同的。（B)双特异性抗体浓度，如通过ELISA测定的。注 射抗体的双特异性在添加和不添加过量的无关IgG4的情况中是相同的。
[0048] 图21 :双特异性抗体对CD20表达细胞的CDC介导的细胞杀伤，所述双特异性抗体 通过2-MEA诱导的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成。使用浓 度系列的指定抗体测试其介导对Daudi (A)和Raji (B)细胞的CDC的能力。这两种细胞系 都表达⑶20,而非EGFR。在IgGl-7D8中引入K409R不影响其诱导⑶C的能力。源自2-MEA 诱导的IgGl-2F8-F405Lx IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换的双特异性抗体仍然能够诱 导 CDC。
[0049] 图22 :双特异性抗体对EGFR表达细胞的ADCC介导的细胞杀伤，所述双特异性抗 体通过2-MEA诱导的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成。使用 浓度系列的指定抗体测试其介导对A431细胞的ADCC的能力。IgGl-7D8不能结合⑶20阴 性A431细胞，因此不诱导ADCC。EGFR抗体IgGl-2F8在CH3域中引入F405L突变后也诱导 ADCC。IgGl-2F8-F405L 的 ADCC 效应器功能在通过 IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R 之 间的Fab-臂交换获得的双特异性形式中得到保留。
[0050] 图 23 :2-MEA 诱导的 IgGl-2F8-F405X 突变体和 IgGl-7D8-K409R 之间的 Fab-臂交 换。通过ELISA测定在2-MEA诱导的指定IgGl-2F8-F405X突变体和IgGl-7D8-K409R之间 的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。（A)在ELISA中分析0-20 μ g/mL的浓度系列 (总抗体）。阳性对照是纯化的一批源自IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R的双特异性 抗体。（B)交换以20 μ g/mL时相对于阳性对照（黑色柱形）的双特异性结合呈现。暗灰色 柱形表示 IgG4 对照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)和阴性对照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-2F8-F405X突变体和IgGl-7D8-K409R 或对照之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0051] 图 24 :2-MEA 诱导的 IgGl-2F8-Y407X mutants and IgGl-7D8-K409R 之间 的Fab-臂交换。通过ELISA测定在2-MEA诱导的指定IgGl-2F8-Y407X突变体和 IgGl-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成。（A)在ELISA中分 析0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）。阳性对照是纯化的一批源自IgGl-2F8-F405L X I gG 1-7D8-K409R的双特异性抗体。（B)交换以20 μ g/mL时相对于阳性对照（黑色柱 形）的双特异性结合呈现。暗灰色柱形表示IgG4对照（IgG4-7D8x IgG4-2F8)和阴性 对照（IgGl_2F8x IgGl-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定 IgGl-2F8-Y407X突变体和IgGl-7D8-K409R或对照之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结 果。
[0052] 图25 :通过非还原性（图25 (A))和还原性（图25 (B))条件下的SDS-PAGE分析 通过2-MEA诱导的Fab-臂交换生成的双特异性抗体
[0053] 图26 :同二聚体起始材料IgGl-2F8-F405L (图26⑶）、同二聚体起始材料 IgGl-7D8-K409R (图26(A))、这两种同二聚体的混合物（1:1)(图26(C))、和通过2-MEA诱 导的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物（图 26(D))的 ΗΡ-SEC 谱。
[0054] 图27 :同二聚体起始材料IgGl-2F8-F405L (图27⑶）、同二聚体起始材料 IgGl-7D8-K409R (图27(A))、这两种同二聚体的混合物（1:1)(图27(C))、和通过2-MEA诱 导的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物（图 27(D))的质谱法（ESI-MS)。
[0055] 图28 :同二聚体起始材料IgGl-2F8-F405L (图28 (A))、同二聚体起始材料 IgGl-7D8-K409R (图28(B))、这两种同二聚体的混合物（1:1)(图28(C))、和通过2-MEA诱 导的IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物（图 28(D))的毛细管等电聚焦（cIEF)图。
[0056] 图29 :同二聚体起始材料IgGl-2F8-F405L (图29 (A))、同二聚体起始材料 IgGl-7D8-K409R (图29(B))、这两种同二聚体的混合物（1:1)(图29(C))、和通过2-MEA诱 导的IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8-K409R之间的Fab-臂交换生成的双特异性产物（图 29 (D))的 HPLC-CIEX 图。
[0057] 图30 :同二聚体IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R的交换反应，如在不同时间 点注射后通过高压液相层析阳离子交换（HPLC-CIEX)监测的。
[0058] 图31 :交换反应后残留的同二聚体，如用CIEX方法检测的（以箭头标示）。
[0059] 图32 :IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和温育时间对双特异性抗体生成的影响，如 ELISA测定的。
[0060] 图33 :多个IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和时间的双特异性抗体生成，如通过 ELISA测定且与任意设置为100%的对照相比。
[0061] 图34 :多个IgG浓度、2-MEA浓度、温育温度和时间的双特异性抗体生成，如通过 HPLC-CIEX 分析的。
[0062] 图35 :使用0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）通过ELISA测定2-MEA诱导的指定 IgGl-2F8-L368X突变体和IgGl-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成 (图35 (A))。阳性对照是纯化的一批源自IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R的双特异性抗 体。图35(B)显示了在20 μ g/mL时相对于阳性对照（黑色柱形）的双特异性结合。暗灰 色柱形表示 IgG4 对照（IgG4-7D8xIgG4-2F8)和阴性对照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-2F8-L368X突变体和IgGl-7D8-K409R 之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0063] 图36 :使用0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）通过ELISA测定2-MEA诱导的指定 IgGl-2F8-K370X突变体和IgGl-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成 (图36(A))。阳性对照是纯化的一批源自IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R的双特异性 抗体。图36 (B)显示了在20 μ g/mL时相对于阳性对照（黑色柱形）的双特异性结合。暗灰色 柱形表示 IgG4 对照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和阴性对照（IgGl-2F8x IgGl-7D8-K409R)之 间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-2F8-D370X突变体和IgGl-7D8-K409R 之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0064] 图37 :使用0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）通过ELISA测定2-MEA诱导的指定 IgGl-2F8-D399X突变体和IgGl-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成 (图37(A))。图37(B)显示了在20 μ g/mL抗体浓度时相对于阳性对照（黑色柱形）的双 特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和阴性对照（IgGl-2F8 X IgGl-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-2F8-D399X突变体 和IgGl-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0065] 图38 :使用0-20 μ g/mL的浓度系列（总抗体）通过ELISA测定2-MEA诱导的指定 IgGl-2F8-T366X突变体和IgGl-7D8-K409R之间的体外Fab-臂交换后的双特异性抗体生成 (图38(A))。图38(B)显示了在20 μ g/mL抗体浓度时相对于阳性对照（黑色柱形）的双 特异性结合。暗灰色柱形表示IgG4对照（IgG4-7D8 X IgG4-2F8)和阴性对照（IgGl-2F8 X IgGl-7D8-K409R)之间的双特异性结合。亮灰色柱形表示来自指定IgGl-2F8-T366X突变体 和IgGl-7D8-K409R之间同时实施的Fab-臂-交换反应的结果。
[0066] 图39 :于15°C在0、30、60、105和200分钟温育后四种不同IgGl突变体组合（如 指定）之间的2-MEA诱导的Fab-臂交换，如通过三明治式ELISA测定的。
[0067] 图40:于15°C抗体温育90分钟后不同IgGl突变体组合之间的2-MEA诱导的 Fab-臂交换，如通过三明治式ELISA测定的。
[0068] 图41:通过分析CIEX分析双特异性抗体，并且如下计算不同缓冲液（如图 注中指定）中随时间形成的异二聚体的百分比：异二聚体（％)= 100% -[峰面积％ IgGl-2F8-F405L+ 峰面积％ IgGl-7D8-K409R]。
[0069] 图42 :在于0°C、0/N(A，B)或于4°C贮存6天（C，D)后通过非还原性（A，C)和还原 性（B，D)条件下的SDS-PAGE分析用含有10mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL双特异性 抗体批次。每块凝胶的第1道含有丽标志物，第2道含有IgGl内部测定对照。A，B :第3 道：用含有l〇mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL双特异性抗体批次；C，D :第4道：用含 有10mg/mL每种抗体的混合物生成的40mL批次。
[0070] 对于非还原性条件，指定重链（H)和轻链（L)的不同组合：148kDa(LHHL)，125kDa (HHL)，99kDa (HH)，67kDa(HL)，51kDa(Η)和 25kDa (L)。
[0071] 图43 :在IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和。使用氧 化还原探头和溶解氧（DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧 y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中 测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0072] 图44 :抗CD38抗体的还原和氧化期间的ΗΡ-SEC分析。通过ΗΡ-SEC分析抗CD38 抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品2(S0002):在从配制缓冲液进行缓冲液更换为 PBS后的抗CD38抗体；样品3至8 :还原阶段（温育时间：1、2、3、4、472、5小时）期间的抗 CD38抗体；样品9至12 :渗滤过程期间的抗CD38抗体（1、2、3、4小时时的样品）；样品13 ; 0/N温育后的抗⑶38抗体；样品14 :将CuS04添加至溶液后的抗⑶38抗体。为了比较，单 独的2-MEA和与2-碘乙酰胺（IAA) -起的2-MEA的ΗΡ-SEC谱以粗线显示。7. 715和9. 193 的峰代表二聚体和单体IgGl。11. 073的峰的性质是未知的。
[0073] 图45 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38 抗体；第2道：缓冲液更换为PBS后的抗⑶38抗体；第3道到第8道：还原阶段期间（图上 方指定的温育时间）的抗CD38抗体；第9道到第12道：渗滤过程期间的抗CD38抗体；第 13道：0/N温育后的抗CD38抗体；第14道：将CuS0 4添加到溶液后的抗CD38抗体。
[0074] 图46 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的ESI-MS分析。将抗⑶38抗体的还原和 再氧化期间采集的样品淬灭，并通过ESI-MS分析来分析。样品l(SOOOl):配制缓冲液中的 抗⑶38抗体；样品2 :缓冲液更换为PBS后的抗⑶38抗体；第3道到第8道：还原阶段期间 (温育时间：l、2、3、4、472、5h)的抗CD38抗体；第9道到第12道：渗滤过程期间（l、2、3、4h 时的样品）的抗⑶38抗体；第13道：0/N温育后的抗⑶38抗体；第14道：将CuS04添加到 溶液后的抗CD38抗体。应当注意到，LC-MS通过LC系统中的还原剂除去或者在电喷射过 程期间将样品暴露于空气（即氧气）而促进再氧化过程。样品可能损失在淬灭步骤过程中 尚未被IAA加帽的共价附接的还原剂分子。因此，与SDS-PAGE相比，ESI-MS过高评估共价 再氧化的完整1@6。标示重链〇1)和轻链仏）的不同组合丄冊1^冊1^冊，1，!1和1^在图 中仅对轻链（L)给出质量详情；+2-MEA = +7?a ;+2_碘乙酰胺=+57Da。
[0075] 图47 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和第二渗滤步骤。使用氧化还原探头和溶解氧（DO)探头追踪还原和氧化阶段期间的 氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示了如 通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0076] 图48 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的ΗΡ-SEC分析-更快速的渗滤和第二渗 滤步骤。通过ΗΡ-SEC分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品1(S0001):配 制缓冲液中的抗CD38抗体；样品2 :缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体；第 3道到第9道：还原阶段期间（温育时间5、10、15、30和60分钟和2和3小时）的抗⑶38 抗体；第10道到第15道：渗滤过程期间（10、20、30、40、50和60分钟后的样品）的抗CD38 抗体；第16道到第18道：渗滤后1、2和25小时的抗⑶38抗体；第19道：第二次渗滤后1 小时的抗⑶38抗体。
[0077] 图49 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和第二渗 滤步骤。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采集的样品。 第1道：配制缓冲液中的抗⑶38抗体；第2道：缓冲液更换为PBS后的抗⑶38抗体；第3 道到第9道：还原阶段期间（温育时间5、10、15、30和60分钟和2和3小时）的抗⑶38抗 体；第10道到第15道：渗滤过程期间（10、20、30、40、50和60分钟后的样品）的抗CD38抗 体；第16道到第18道：渗滤后1、2和25小时的抗⑶38抗体；第19道：第二次渗滤后1小 时的抗⑶38抗体。
[0078] 图50 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和较低的2-MEA浓度。使用氧化还原探头和溶解氧（D0)探头追踪还原和氧化阶段期 间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显示 了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0079] 图51 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的ΗΡ-SEC分析-更快速的渗滤和较低的 2-MEA浓度。通过ΗΡ-SEC分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采集的样品。样品1(S0001): 配制缓冲液中的抗CD38抗体；样品2 :缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的抗CD38抗体； 第3道到第6道：还原阶段期间（温育时间：20和60分钟和3和4小时）的抗⑶38抗体； 第7道到第10道：渗滤过程期间（10、20、40和60分钟后的样品）的抗⑶38抗体；第11道 到第14道：渗滤停止后1、2、3和24小时的抗⑶38抗体。
[0080] 图52 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和较低的 2-MEA浓度。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采集的样 品。第1道：配制缓冲液中的抗⑶38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS后的 抗⑶38抗体；第3道到第6道：还原阶段期间（温育时间：20和60分钟和3和4小时）的 抗⑶38抗体；第7道到第10道：渗滤过程期间（10、20、40和60分钟后的样品）的抗⑶38 抗体；第11道到第14道：渗滤停止后1、2、3和24小时的抗⑶38抗体。
[0081] 图53 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和还原阶段期间的EDTA存在。（A)使用氧化还原探头和溶解氧（D0)探头追踪还原和 氧化阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴 和虚线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0082] (B)在存在和缺乏EDTA (从实施例46 [没有EDTA]和47 [具有EDTA]采集）的情 况中D0下降的比较。
[0083] 图54 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和还原 阶段期间的EDTA存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗⑶38抗体的还原和氧化期 间采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗⑶38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换 为PBS后的抗⑶38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间（温育时间：10分钟和1、2、3和 4小时）的抗⑶38抗体；第8道到第11道：渗滤过程期间（开始渗滤后10、30、40和60分 钟的样品）的抗⑶38抗体；第12道到第14道：渗滤停止后1和24小时和6天的抗⑶38 抗体。
[0084] 图55 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和还原阶段后的N2存在。使用氧化还原探头和溶解氧（D0)探头追踪还原和氧化阶段 期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线显 示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0085] 图56 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和还原 阶段后的N2存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采 集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗⑶38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS 后的抗⑶38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间（温育时间：10分钟和1、2、3和4小时） 的抗⑶38抗体；第8道到10道：渗滤过程期间（开始渗滤后10、30、和60分钟的样品）的 抗⑶38抗体；第11道：停止渗滤后24小时的抗⑶38抗体；第12道和第13道：在停止用 氮气通风并开始用氧气通风后1和24小时的抗⑶38抗体。
[0086] 图57 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和还原阶段后的EDTA存在。使用氧化还原探头和溶解氧（D0)探头追踪还原和氧化阶 段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚线 显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0087] 图58 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和还原阶 段后的EDTA存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗⑶38抗体的还原和氧化期间采 集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗⑶38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为PBS 后的抗⑶38抗体；第3道到第6道：还原阶段期间（温育时间：10分钟和2、3和4小时） 的抗⑶38抗体；第7道到9道：渗滤过程期间（开始渗滤后10、30、和60分钟的样品）的 抗⑶38抗体；第10道：停止渗滤后24小时的抗⑶38抗体；第11道：添加硫酸铜后30分 钟的抗⑶38抗体。
[0088] 图59 :IgGl抗⑶38抗体的还原和氧化期间的氧化还原电势和氧饱和-更快速的 渗滤和还原阶段后的硫酸铜存在。使用氧化还原探头和溶解氧（D0)探头追踪还原和氧化 阶段期间的氧化还原电势和氧饱和。左侧y轴和实线显示了氧化还原电势；右侧y轴和虚 线显示了如通过不同过程阶段期间溶液中测量的氧饱和，如以箭头标示的。
[0089] 图60 :抗⑶38抗体的还原和氧化期间的SDS-PAGE分析-更快速的渗滤和还原 阶段后的硫酸铜存在。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析抗CD38抗体的还原和氧化期间 采集的样品。第1道：配制缓冲液中的抗CD38抗体；第2道：缓冲液从配制缓冲液更换为 PBS后的抗⑶38抗体；第3道到第7道：还原阶段期间（温育时间：10分钟和1、2、3和4小 时）的抗CD38抗体；第8道到9道：渗滤过程期间（开始渗滤后10和60分钟的样品）的 抗⑶38抗体；第10道：停止渗滤后24小时的抗⑶38抗体；第Μ道：丽标志物。
[0090] 图61 :再氧化过程期间的SDS-PAGE分析。在含有EDTA或Cu2+的PBS中在不同温 育时间后采集样品，并通过非还原性（A，C)和还原性（B，D)条件下的SDS-PAGE分析。第1 道：IgGl，内部测定对照，第2道：Oh样品；第3道：lh样品，第4道：2h样品，第5道：3h样 品，第6道：4h样品，第7道：24h样品，第8道：MW标志物。
[0091] 图62 :在存在Cu2+的情况中在不同温育时间后的重链-轻链组合的相对量。通 过自SDS-PAGE凝胶的密度测定法量化个别的分子种类。所有扫描条带的总强度设置为 100%。
[0092] 图63 :反应器流径、材料清单和方法。使用0. 2N NaOH对流径消毒，并用WFI漂洗。 更换反应的早晨，从缓冲剂袋将合适量的PBS添加至系统。通过重力补料添加同二聚体，并 且以7LPM循环系统以混合内容物。通过重力添加2-MEA储备溶液启动反应。将渗透阀关 闭，并且补料泵设置为30RPM(7LPM)，以进行还原过程。在5小时后，将渗透阀打开，并将泵 速提高以满足渗滤的目标补料压力70kPa。对于lg/L条件，泵设置为165RPM(31LPM)。对 于20g/L条件，泵设置为140RPM(26LPM)。将PBS添加路径打开，并且控制渗滤泵速以保持 反应器袋中的恒定重量。此程序产生250L/h (对于lg/L条件）和125L/h (对于20g/L条 件）的渗滤速率。在500L废物袋中收集目标渗滤体积后，将渗透阀关闭，并停止渗滤泵。在 氧化时间期间将补料泵返回到30RPM(7LPM)循环。在0/N温育后，实施第二次渗滤（对于 lg/L条件为3个渗滤体积（diavolume)，且对于20g/L条件为4个渗滤体积）。在周围温度 (22-25°C )实施所有过程。直接从袋中或从阀1中取出样品（图1)。
[0093] 材料清单
[0094] 1) 1/2，'零静态三通隔膜阀（zero-static tee diaphragm valve)，SED, 316L SS
[0095] 2)50L 袋，Sartoruis Stedim，FFB207004 型，在 50L Wave 混合器上，EHT rev A 型
[0096] 3) Twin 杠杆f平，Intercomp，TB83〇 型
[0097] 4) 1/2" ID 管道，钼固化娃酮（platinum cured silicone)，Masterflex96410_82
[0098] 5) 3/8" ID 管道，钼固化硅酮，Tygon 3350
[0099] 6)管道弹簧夹（Tubing pinch clamp)
[0100] 7) 1〃ID 高压软管，强化钼固化硅酮，316L SS TC 末端，Page International，SWPV 型
[0101] 8)0-30psig 压强表，Anderson，EM066010041025A 型
[0102] 9) 1"三通器（gauge tee)，316L SS
[0103] 10) 1/2' 三通器，316L SS
[0104] 11) 1/2" xl"TC 减速器（reducer)，316L SS
[0105] 12)补料懦动泵（Feed peristaltic pump)，Watson Marlow，720DUN/RE 型， Stapure 管道元件，960. 0254. PFT 型，0-33LPM
[0106] 13)溶解氧传感器和发送器，Metter-Toledo,4100e 和 Inpro 6800/12/120(传感 器）型
[0107] 14)氧化还原传感器和发送器，Mettler Toledo,2100e和3250SG (传感器）型
[0108] 15) l"Wedgewood 流动池，316L SS
[0109] 16) 1/2，，三通管，Kynar，Cole-Parmer EW-30703-78 型
[0110] 17)l/2"隔膜阀，SED，316LSS
[0111] 18)具有Pall -次性聚丙烯插入物的Millipore UF膜固定器（holder)，和Pall 0mega30kD PES 膜，0S030F26 型
[0112] 19)Male Kleenpak HT 连接器，Pall，KPCHT02M6 型
[0113] 20)Female Kleenpak HT 连接器，Pall，KPCHT02F6 型
[0114] 21)渗滤滤器（Diafilter)懦动泵，Watson Marlow, 620 型 Di/R，Stapure 管道兀 件，960. 0170. PFT 型，0-9LPM
[0115] 22)0. 2micron 滤器，Pall，KA3NFP1 型
[0116] 23)500L 袋，Sartoruis Stedim，FXB211905 型
[0117] 24) 200L 袋，Sartoruis Stedim，PDL200LWS 型
[0118] 25) 20L 袋，Sartoruis Stedim，FFB208721 型
[0119] 26) 5L 袋，Sartoruis Stedim，FFB208723 型
[0120] *所有TC垫圈均为钼固化硅酮。
[0121] *所有5/20/50L Sartorius Stedim袋使用具有EVA (乙烯乙酸乙烯酯）产物接触 和EV0H(乙烯乙烯醇）气体屏障层的多层膜。
[0122] *所有200/500L Sartorius Stedim袋使用具有ULDPE (超低密度聚乙烯）产物接 触接触和EV0H气体屏障层的多层膜。
[0123] 图64 :来自三种不同条件的初始和最终产物的CIEX谱。
[0124] 图65 :初始和最终产物的还原性（左侧）和非还原性（右侧）SDS-PAGE分析。第 1 道：IgGl-bl2 测定对照。第 2 道：初始 IgGl-F405L-2F8。第 3 道：初始 IgGl-K409R-7D8。 第4道：以lg/L运行的最终25-L。第5道：以20g/L运行的最终25-L。
[0125] 图66 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和D0探 头追踪IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的氧饱和和 氧化还原电势。水平虚线显示了 D0和氧化还原两者的初始数值。2-MEA的添加（以箭头标 示）在运行开始时与D0和氧化还原的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0126] 图67 :还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头测量IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始的pH值。 2-MEA的添加（以箭头标示）与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始 和停止。
[0127] 图68 :还原阶段期间的氧消耗率（OCR[mM/h])、消耗的总02 (mM)和D0 (% )。计算 氧消耗率和消耗的总〇2，测量D0。垂直点线代表还原的开始和结束。
[0128] 图69 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE (非还原性）分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的 样品。Μ :丽标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和0/N温育。在 左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及 其组合标示。
[0129] 图70 :还原和再氧化期间的CIEX谱。在指定的时间点时在IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间将样品采集并快速冷冻，并通过分析 CIEX分析。
[0130] 图71 :0/N温育后终样品的HP-SEC分析。通过HP-SEC分析渗滤后在0/N温育后 采集的样品。7. 599和10. 792的峰分别标示二聚体和单体IgG。
[0131] 图72 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和DO探 头追踪在存在2mM EDTA的情况中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还 原和再氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。水平虚线显示了 D0和氧化还原两者的初始数 值。2-MEA的添加在运行开始时与D0和氧化还原的大幅下降一致（以箭头标示）。垂直虚 线显示渗滤的开始和停止。运行晚期（t = 24h)的氧化还原增加和D0下降与CuS04的添 加一致。
[0132] 图73 :还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪在存在2mM EDTA的情况中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显 示初始的pH值。2-MEA的添加（以箭头标示）与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚 线显示渗滤的开始和停止。
[0133] 图74 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE分析。通过非还原性SDS-PAGE分析来分析 在存在2mM EDTA的情况中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再 氧化期间采集的样品。Μ :丽标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3 道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9 道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时 和0/N温育；第13道：添加 CuS04后10分钟。在左侧标不分子量标志物的质量。还原/再 氧化的IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及其组合标示。
[0134] 图75 :还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析在存在2mMEDTA的情况 中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间采集的样品。在 指定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
[0135] 图76 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和D0探 头追踪IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的氧饱和和 氧化还原电势。2-MEA的添加（以箭头标示）在运行开始时与D0和氧化还原的大幅下降一 致。水平虚线显示氧化还原和D0两者的初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0136] 图77 :还原和再氧化期间的搅动速率。2-MEA的添加（以箭头标示）与接近运行 开始的搅动速率的大幅升高一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0137] 图78 :还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的pH。2-MEA的添加（以箭头标示）与 运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0138] 图79 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE (非还原性）分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的 样品。Μ :丽标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和0/N温育。在 左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及 其组合标示。
[0139] 图80 :还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样 品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
[0140] 图81 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和D0探头 追踪IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间的氧饱和和氧 化还原电势。水平虚线显示了 redox和D0两者的初始数值。2-MEA的添加（以箭头标示） 在运行开始时与D0和氧化还原的大幅下降一致。水平虚线显示氧化还原和D0两者的初始 数值。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0141] 图82 :还原和再氧化期间的搅动速率。2-MEA的添加（以箭头标示）与接近运行 开始的搅动速率的大幅升高一致。垂直虚线显示渗滤的开始和停止。
[0142] 图83:还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始数值。2-MEA 的添加（以箭头标示）与运行开始时pH的大幅下降一致。水平虚线显示初始pH值。垂直 虚线显示渗滤的开始和停止。
[0143] 图84 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE (非还原性）分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的 样品。Μ :丽标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和0/N温育。在 左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及 其组合标示。
[0144] 图85 :还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样 品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
[0145] 图86 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和D0探 头追踪在存在氮气的情况中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再 氧化期间的氧饱和和氧化还原电势。时间〇时的2-MEA添加与运行开始时氧化还原的大幅 下降一致。垂直虚线显示渗滤的开始、渗滤的结束、渗滤后1小时样品点、和渗滤后3小时 样品点。在渗滤结束时用空气冲刷顶部空间。
[0146] 图87 :还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头追踪在存在氮气的情况中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和氧化期间的pH。水平虚线显示 初始pH值。时间0时的2-MEA的添加与运行开始时pH的大幅下降一致。垂直虚线显示渗 滤的开始和停止。
[0147] 图88 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE (非还原性）分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析在存在氮气的情况中IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原 和再氧化期间采集的样品。M :MW标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、 第3道、第4道和第5道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、 第9道和第10道：1、2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1 和3小时；第13道：渗滤后0/N温育。在左侧标示分子量标志物的质量。还原/再氧化的 IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及其组合标示。
[0148] 图89 :还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析在存在氮气的情况中 IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间采集的样品。在指 定的时间点时采集样品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
[0149] 图90:引入空气后的氧消耗。图显示了在添加空气后更好在渗滤后的数值。实际 D0是系统测量的DO。D0 (无消耗）是假设没有氧消耗的计算值。消耗的02是使用先前测 定的kla并假设系统中的氧饱和是0. 2mM计算的消耗氧量。
[0150] 图91 :还原和再氧化期间的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和D0探 头追踪IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的氧饱和和 氧化还原电势。水平虚线显示了氧化还原和D0的初始数值。垂直虚线显示渗滤的开始和 停止。2-MEA的添加与运行开始时D0和氧化还原的大幅下降一致。刚好在渗前，将pH调节 至5.0。在0/N温育后，将pH调回到7. 4。
[0151] 图92 :还原和再氧化期间的pH谱。通过pH探头测量IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l:l混合物）的还原和再氧化期间的pH。水平虚线显示初始数值。垂直虚 线显示渗滤的开始和停止。2-MEA的添加与运行开始时pH下降一致。刚好在针对pH 5.0 缓冲液渗滤前，将pH调节至5. 0。在0/N温育后将pH再调节至7. 4。
[0152] 图93 :还原和再氧化期间的SDS-PAGE (非还原性）分析。通过非还原性SDS-PAGE 分析来分析IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的 样品。Μ :丽标志物；C :IgGl对照；第1道：在2-MEA添加前；第2道、第3道、第4道和第5 道：还原后30分钟、1小时、2小时和3小时，第6道、第7道、第8道、第9道和第10道：1、 2、3、5、和7L渗滤缓冲液后的渗滤结果，第11道和第12道：渗滤后1小时和0/N温育；第 13道、第14道和第15道：Tris添加后立即和1和2小时。在左侧标不分子量标志物的质 量。还原/再氧化的IgG种类以Η(重链）和/或L(轻链）及其组合标示。
[0153] 图94 :还原和再氧化期间的CIEX谱。通过分析CIEX分析IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R(l: 1混合物）的还原和再氧化期间采集的样品。在指定的时间点时采集样 品，并将其快速冷冻，直到CIEX分析。
[0154] 图95 :胱胺（cystamine)添加后的溶解氧和氧化还原电势。使用氧化还原探头和 D0探头追踪对IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409Rl:l混合物添加胱胺后的氧饱和和氧化 还原电势。
[0155] 图96 :胱胺添加后的CIEX谱。通过分析CIEX分析对IgGl-2F8-F405L和 IgGl-7D8-K409R添加胱胺后采集的样品。在指定的时间点时采集样品。
[0156] 图97 :使用10mM半胱氨酸的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通 过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
[0157] 图98 :在25mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通 过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
[0158] 图99 :在50mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并通 过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
[0159] 图100 :在75mM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并 通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
[0160] 图101 :在lOOmM半胱氨酸时的还原的CIEX谱。将样品每55分钟在柱上加载，并 通过分析CIEX分析。显示了选择的谱，标示温育时间。
[0161] 图102 :使用半胱氨酸还原，除去半胱氨酸，并温育后的CIEX谱。显示了在50mM半 胱氨酸中于30°C还原385分钟，接着使用脱盐柱除去半胱氨酸，随后温育2小时和18小时 后的CIEX谱。
[0162] 图103 :从固定化的还原剂柱洗脱后剩余的同二聚体和新形成的双特异性抗体的 CIEX谱。将同二聚体IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R的混合物添加至固定化的还原剂 柱，温育并洗脱。通过分析CIEX分析双特异性抗体的形成。
[0163] 图104 :用于检测双特异性抗体的同种异型ELISA。将IgGlm(f)-K409R-CD20 和IgGlm(za)-F405L-EGFR的混合物与25mM2-MEA于37°C -起温育90分钟。在三明治 式ELISA中测量双特异性抗体的形成。将405nm的光密度在Y轴上绘制，作为双特异性 IgGlm(f，za)-CD20xEGFR抗体形成的测量。包括IgGlm(fa)抗体作为阳性对照。
[0164] 图105 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中过量添加 IgGl-7D8-AAA-K409R。量化显示了交换反应后存在 11.4% IgGl-7D8-AAA-K409R(*)、 88.5%双特异性抗体和仅0.1%1861-2?844051^(+)同二聚体。
[0165] 图106 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中过量添加 IgGl-2F8-F405R。量化显示了交换反应后存在0. 4%
[0166] IgGl-7D8-K409R(*)、88· 4%双特异性抗体、和 11. 2% IgGl-2F8-F405L(+)。
[0167] 图107 :SNEEP后的CIEX分析。在SNEEP后实施CIEX分析，其中使用过量的 IgGl-7D8-AAA-K409R。量化指示交换反应后存在 25. 5% IgGl-7D8-AAA-K409R(*)、73· 3% 双特异性抗体和1. 2% of IgGl-2F8-F405L(+)。注意到IgGl-2F8-F405L同二聚体的百分 比在最佳的交换条件下是进一步降低的（图105)。
[0168] 图108 :蛋白A快速蛋白液相层析（FPLC)谱。使用50 %过量的 IgGl-7D8-AAA-K409R同二聚体在交换后产生双特异性抗体的蛋白A FPLC谱。在左轴上，显 示了以mAU计的A28(l信号（黑色迹线迹线），在右轴上显示了 pH(灰色迹线）。两个明显峰 之间的尖峰代表分级开始时的气泡。
[0169] 图109 :流过级分（在图108中用*标示的峰）的CIEX分析。既没有检测到双特 异性抗体（保留时间约16. 4分钟）也没有检测到IgGl-2F8-F405L(保留时间约19. 2分 钟）；13· 6分钟的峰对应于（非结合）IgGl-7D8-AAA-K409R同二聚体。
[0170] 图110 :洗脱产物（在图108中用+标示的峰）的CIEX分析。16. 4分钟的峰对应 于双特异性抗体，在13. 6分钟（IgGl-7D8-AAA-K409R)没有检出峰，并且检出（1. 4% ) 19. 2 分钟（IgGl-2F8-F405L)的小峰。这证明了与蛋白A抛光（polishing)组合的SNEEP可以 用于除去残留的同二聚体。
[0171] 图 111 :蛋白 A 共同纯化的 IgGl-bl2-F405L 和 IgGl-058-K409R 的 FPLC 层析谱。 迹线显示了 A280信号。以约5mL后A280信号升高观察到加载。清洗和洗脱步骤的开始用 箭头标记。在第一低pH再生步骤期间观察到100mL的洗脱后峰。此峰没有进行分析，但是 指示次要蛋白杂质。
[0172] 图 112 :蛋白 A共同纯化的 IgGl-058-K409R⑷和 IgGl-bl2-F405L(+)的 CIEX谱。
[0173] 图113 :从蛋白A共同纯化的IgGl-bl2-F405L和IgGl-058-K409R生成的双特异 性抗体的HP-SEC谱。7. 5分钟的峰（*)对应于二聚体种类，9. 0分钟的峰对应于单体种类 (+)。
[0174] 图114 :从蛋白Α共同纯化的IgGl-bl2-F405L和IgGl-058-K409R生成的双特异性 抗体的CIEX谱。26分钟的峰（*)对应于双特异性抗体；36分钟的峰对应于IgG-bl2-F405L 同二聚体（+)。没有检出IgGl-058-K409R。
[0175] 图115 :双特异性抗体和同二聚体的1:1:1混合物的FPLC谱。在近等度条件下在 WCIEX 柱上分开的 IgGl-7D8-K409R(*)、双特异性抗体（+)、和 IgGl-2F8-F405L(#)的 1:1:1 混合物的FPLC谱（较浅的梯度仅略微加速IgGl-2F8-F405L的洗脱）。
[0176] 图116 :计算的解析。对柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液显示了计算的解析（R，使用等式 5计算）。对20mM柠檬酸盐pH 6. 4发现最佳的解析。认为1. 75-2. 00的解析对于满意的分 离是可接受的（John W. Dolan, Peak Tailing and Resolution, LC Resources Inc.，Walnut Creek, California, USA)〇
[0177] 图 117 :FPLC 谱。在 pH 6.4,20mM 柠檬酸时掺有 10% IgGl-2F8-F405L 同二聚体 (+)的 IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8-K409R(*)双特异性抗体的 FPLC 谱。加载是 4.4mg/mL 树脂。
[0178] 图 118 :IgGl-2F8-F405L X IgG17D8-K409R双特异性抗体的 CIEX谱。显示了在图 117 中以星号（*)标示的 IgGl-2F8-F405L X IgGl-7D8-K409R 的 CIEX 谱。IgGl-7D8-K409R 同二聚体（*)、双特异性抗体、和IgGl-2F8-F405L同二聚体（+)的百分比是4. 3、94. 8、和 0. 9。IgGl-7D8-K409R同二聚体是来自掺有IgGl-2F8-F405L的初始批次的残留同二聚体。
[0179] 图119 :FPLC层析图。A)在具有75mM2-MEA的PBS中20mg双特异性抗体的蛋白 A洗脱谱（总体积3mL)。实线是A254信号（左轴），虚线是A28Q (左轴）信号，长虚点线是 pH(数值未显示，pH在约65mL时从7. 4下降至3.0,并且指示仅用于参照）。B)蛋白A上 加载的具有75mM2-MEA的PBS (总体积3mL)。实线是A254信号（左轴），虚线是A28Q (左轴） 信号，长虚点线是pH(数值未显示，pH在约65mL时从7. 4下降至3. 0,并且指示仅用于参 照）。
[0180] 图120 :穿透（breakthrough)测定的点。A)在蛋白A柱暴露于2-MEA之前（左侧 小图）和之后（右侧小图）测定穿透点（在图中用箭头标示）。使用停留时间1分钟加载 IgGl-7D8-K409R(5mg/mL)。在对75mM2-MEA暴露之前和之后，穿透点是约15mL，指示柱性能 不受2-MEA的存在强烈影响。显示的数据是A280数值（mAU)。B)A)的图象放大，两条迹线 重叠。
[0181] 图121 :2-MEA除去后洗脱蛋白质的还原性SDS-PAGE分析。泳道含有标志物、对照 抗体（IgGl-bl2)、在存在2-MEA的情况中在柱加载前的双特异性反应混合物、和2-MEA除去 后的终产物。没有检出蛋白A，指示柱保持完整。重链和轻链以箭头标示，蛋白A的预期分 子量（45kDa)以星号（*)标示。
[0182] 图122 :双特异性lambda-kappa抗体的CIEX谱。预期含有λ轻链的BMA031-K409R 抗体的地方以加号（+)标示，并且没有检出峰，具有κ轻链的IgG12F8-F405L抗体用星号 (*)标示。双特异性抗体在中间。BMA031-K409R、双特异性抗体、和IgG12F8-F405L的百分 比分别为11. 2、88. 8和0。
[0183] 图123 :于不同温育贮存不同时间段的双特异性抗体（黑色）、IgGl-7D8_K409R(灰 色）和IgGl-2F8-F405L (白色）的A280数据。在Nanodrop上实施A280测量，并且结果在 1mm径长以A280(AU)给出。
[0184] 图124 :于2-8 °C和于25 °C在t = 0和t = 12个月时双特异性抗体（D)、 IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的非还原性 SDS-PAGE。C =内部 IgGl 测定对 照。
[0185] 图125 :于2-8 °C和于25 °C在t = 0和t = 12个月时双特异性抗体（D)、 IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的还原性 SDS-PAGE。C =内部 IgGl 测定对照。
[0186] 图 126 :于 40°C在 t = 0 和 t = 3 个月时双特异性（D)、IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的非还原性SDS-PAGE。C=内部IgGl测定对照。
[0187] 图 127 :于 40°C在 t = 0 和 t = 3 个月时双特异性（D)、IgGl-7D8-K409R(l)和 IgGl-2F8-F405L(2)的还原性 SDS-PAGE。C=内部 IgGl 测定对照·
[0188] 图 128 :双特异性抗体（实心）、IgGl-7D8-K409R (有条纹）和 IgGl-2F8-F405L (有 点）的ΗΡ-SEC层析图。贮存条件是A:t = 0;B:于2-8°Ct = 12个月；C:于25°C，t= 12 个月，和于40°C，D:t = 3个月。
[0189] 图 129 :双特异性抗体（实心）、IgGl-7D8-K409R (有条纹）和 IgGl-2F8-F405L (有 点）的CIEX层析图。贮存条件是A:t = 0 ;B :于2-8°C t = 12个月；C :于25°C，t = 12个 月，和于40°C，D:t = 3个月。（注意：与t = 12个月相比t = 0时材料的保留时间的差异 可以是由于缓冲液组成的小变化和/或使用不同柱批次所致。在每次运行中内部IgGl对 照的分析也显示了与t = 0相比t = 12个月时+1. 64分钟的转变，数据未显示）。
[0190] 发明详述
[0191] 定义
[0192] 术语"免疫球蛋白"指一类结构上相关的糖蛋白，由两对多肽链，即一对轻（L)的 低分子量链和一对重（H)链构成，所有四条链都通过二硫键互联。已充分表征免疫球蛋 白的结构。见例如 Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.编，2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区（本文缩写为VH)和重链恒定区构成。 重链恒定区通常由三个域CHI、CH2和CH3构成。重链在所谓"铰链区"中经由二硫键互 联。每条轻链通常由轻链可变区（本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常 由一个域CL构成。通常，根据EU索引对恒定区的氨基酸残基编号，所述EU索引如描述于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。图 16 给出 了抗体 2F8 的不同同种型形式的EU和Kabat编号（W002/100348)。可将VH和VL区进一步细分为高可 变性的区（或者在结构上限定的环的序列和/或形式上高变的高变区），也称为互补决定区 (CDR)，其散布在称为框架区（FR)的更保守的区中。每个VH和VL通常由以下列顺序从氨 基端排列至羧基端的三个CDR和四个FR构成：FR1，CDR1，FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (还可见 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901917(1987))〇
[0193] 当用于本文时，术语"Fab臂"指抗体的一个重链-轻链对。
[0194] 当用于本文时，术语"Fc区"或"Fc域"指至少包含铰链区、CH2域和CH3域的 抗体区（参见例如 Kabat EA,于 US Department of Health and Human Services, NIH publication n。91-3242,Edn.第 5版 662,680,689 (1991)。可以如下生成 Fc 区，即用木 瓜蛋白酶消化抗体，其中Fc区是由此获得的片段，其包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和 铰链区。抗体重链的恒定域限定抗体同种型，例如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl，IgA2, IgE。 Fc域与称作Fc受体的细胞表面受体和补体系统的蛋白质一起介导抗体的效应器功能。
[0195] 如本文中使用的，术语"CH2区"或"CH2域"意图指免疫球蛋白的CH2区。如此， 例如人IgGl抗体的CH2区对应于依照EU编号系统的氨基酸228-340。然而，CH2区也可以 是如本文中描述的任何其它抗体同种型。
[0196] 如本文中使用的，术语"CH3区"或"CH3域"意图指免疫球蛋白的CH3区。如此， 例如人IgGl抗体的CH3区对应于依照EU编号系统的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以 是如本文中描述的任何其它抗体同种型。
[0197] 术语"抗体"（Ab)在本发明上下文中指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或 其任一种的衍生物，它们具有在典型生理条件下与抗原特异性结合的能力，具有显著时间 段的半衰期，诸如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4 小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更久，约48小时或更久，约3、4、5、6、7 或更多天等，或者任何其它相关功能限定的时间段（诸如足以诱导、促进、增强和/或调节 与抗体结合抗原关联的生理反应的时间和/或抗体足以募集效应器活性的时间）。免疫球 蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体（Ab)的恒定区可介 导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（比如效应细胞）和补体 系统的组分比如Clq，补体活化经典途径的第一组分。抗体也可以是双特异性抗体、双抗体 (diabody)或类似分子。术语"双特异性抗体"指对至少两种不同表位、通常是非重叠表位 具有特异性的抗体或含有两种独特抗原结合位点的抗体。如上所示，除非另外声明或者与 上下文明确矛盾，否则本文的术语抗体包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。此 类片段可通过任何已知的技术提供，比如酶促切割、肽合成和重组表达技术。已显示抗体的 抗原结合功能可通过全长抗体的片段例如Fab或F (ab'）2片段实施。还应理解除非另外指 定，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体（mAb)、抗体样多肽，比如嵌合抗体和人源 化抗体。如此产生的抗体可具备任何同种型。
[0198] 术语"全长抗体"当用于本文时，指含有正常见于该同种型抗体的所有重链和轻链 恒定域和可变域的抗体。
[0199] 如本文中使用的，"同种型"指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或 IgM)。
[0200] 如本文使用的，术语"人抗体"旨在包括具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变 区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 (例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变）。但是， 如本文使用的，术语"人抗体"并不旨在包括其中从另一哺乳动物物种比如小鼠种系衍生的 CDR序列已移植在人框架序列上的抗体。
[0201] 当用于本文时，术语"重链抗体"指只由重链组成且缺乏通常见于抗体的轻链的抗 体。重链抗体，自然存在于例如骆驼（camelid)，可结合抗原，尽管只具有VH域。
[0202] 术语"表位"意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由表面集合 的分子（例如氨基酸或糖侧链）组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特 性。构象性和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在时，与前者的结合而非与后者的结 合丧失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸 如被抗原结合肽有效封闭的氨基酸残基（换句话说，氨基酸残基位于抗原结合肽的覆盖区 (footprint)内）。
[0203] 在抗体与预定抗原结合的情况下，本文所用术语"结合"通常是这样的结合， 即在使用抗原作为配体，抗体作为分析物，通过例如表面等离振子共振（SPR)技术在 BIAcore3000仪器中测定时，其亲和力相当于约10_6M或更小，例如10_7M或更小，诸如约 1(Γ 8Μ或更小，诸如约1(Γ9Μ或更小，约或更小，或约1(ΓηΜ或甚至更小的K D，且其中抗 体以对应于如下KD的亲和力结合所述预定抗原，所述KD比其对与预定抗原或紧密相关抗原 不同的非特异性抗原（例如BSA、酪蛋白）结合的亲和力低至少10倍，诸如低至少100倍， 例如低至少1，〇〇〇倍，诸如低至少10, 〇〇〇倍，例如低至少100, 〇〇〇倍。亲和力较低的量取 决于抗体的KD，使得在抗体的KD非常低（即抗体是高特异性的）时，则对抗原的亲和力低 于对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,〇〇〇倍。如本文中使用的，术语"k d"(m)是 指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0204] 当用于本文时，术语"第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用"指第一 CH3/第 二CH3异二聚体蛋白中第一 CH3区与第二CH3区之间的相互作用。
[0205] 当用于本文时，术语"第一和第二CH3区的同二聚体相互作用"指第一 CH3/第一 CH3同二聚体蛋白中第一 CH3区与另一个第一 CH3区之间的相互作用和第二CH3/第二CH3 同二聚体蛋白中第二CH3区与另一个第二CH3区之间的相互作用。
[0206] 如本文中使用的，"分离的抗体"表示材料已脱离其原来环境（例如如果它是自然 存在的则是自然环境或者如果它是重组表达的则是宿主细胞）。还有利的是，抗体呈纯化形 式。术语"纯化的"并不需要绝对纯度；相反，它旨在作为相对定义，表示与起始材料相比相 对于组合物中污染物的浓度的抗体浓度增加。
[0207] 如本文中使用的，术语"宿主细胞"旨在指其中已引入表达载体如编码本发明抗体 的表达载体的细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，比如CH0细胞、HEK293细胞、NS/0细胞 和淋巴细胞。
[0208] 当用于本文时，术语两种或更多种核酸构建体的"共表达"，指两种构建体在单个 宿主细胞中表达。
[0209] 如本文中使用的，术语"肿瘤细胞蛋白"指位于肿瘤细胞的细胞表面上的蛋白。
[0210] 如本文中使用的，术语"效应细胞"指参与与免疫应答的识别期和活化期相对的 免疫应答效应期的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞 (比如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞（CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单 核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞比如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。 一些效应细胞表达特异性Fc受体和执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能 够诱导抗体依赖性细胞性细胞毒性（ADCC)，比如自然杀伤细胞。在一些实施方案中，效应细 胞可吞噬靶抗原或靶细胞。
[0211] 术语"还原性条件"或"还原性环境"指足以容许抗体铰链区中的链间二硫键还原 的条件。
[0212] 除非上下文矛盾，本发明中提及氨基酸位置依照EU索引，如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991)中描述的。
[0213] 术语"rpm"或"RPM"指每分钟的旋转，并且在本发明的上下文中可以以rpm或RPM 指示。
[0214] 本发明的方法
[0215] 本发明涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
[0216] a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原 性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
[0217] 其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一 CH3区， 且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，且其中所述 第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互 作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
[0218] b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚 体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
[0219] 或者，本发明的步骤a)可以包括下列步骤：
[0220] z)提供编码包含第一免疫球蛋白的Fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第 一 Fc区包含第一 CH3区，
[0221] y)提供编码包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第 二Fc区包含第一 CH3区，
[0222] 其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之 间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且
[0223] 其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处除了 Lys、Leu或Met外的氨基酸， 且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和 407,
[0224] 和 / 或
[0225] 其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个 所述CH3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0.01和10微摩尔，诸如介于0.05和10 微摩尔之间，更优选介于0. 01和5之间，诸如介于0. 05和5微摩尔之间，甚至更优选介于 0. 01和1微摩尔之间，诸如介于0. 05和1微摩尔之间，介于0. 01和0. 5之间或介于0. 01 和0. 1之间，
[0226] z)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体。
[0227] 在又一个实施方案中，步骤z)进一步包括在所述宿主细胞中共表达一种或多种 编码轻链的核酸构建体。
[0228] 本发明的方法在生产较大体积的异二聚体蛋白时是特别合适的。
[0229] 因此，在一个具体的实施方案中，步骤b)可以包括：
[0230] b)使至少10mL从步骤a)中获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许 所述异二聚体蛋白中半胱氨酸氧化成链间二硫键。
[0231] 在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括获得异二聚体蛋白的步骤，例如本 发明的方法可以包括步骤c):
[0232] c)获得异二聚体蛋白。
[0233] 在又一个实施方案中，本发明的步骤a)可以包括下列步骤：
[0234] i)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一 CH3区，
[0235] ii)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3 区，
[0236] 其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之 间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，
[0237] iii)在还原性条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起温育，所述还原性条件 足以容许所述铰链区中链间二硫键的还原。
[0238] 可以一起或分开生成和/或纯化第一和第二同二聚体蛋白。例如，若通过在宿主 细胞中表达生成第一和第二同二聚体蛋白，则第一和第二同二聚体蛋白可以在同一反应容 器，例如同一生物反应器中生产。若在同一反应容器中生产第一和第二同二聚体蛋白，则 所述第一和第二同二聚体蛋白可以在相同宿主细胞中或者由不同宿主细胞生成。或者，第 一和第二同二聚体蛋白可以在两个分开的反应容器中，例如在两个分开的生物反应器中生 产。若第一和第二同二聚体蛋白由不同宿主细胞生成，则此类宿主细胞可以源自相同或不 同细胞类型。同一反应容器中的生产对于成本或时机考虑或者利用氧化还原酶诸如胞质溶 胶硫氧还蛋白1和2(TXN1和TXN2)可以是有利的，所述氧化还原酶由表达第一和/或第二 同二聚体蛋白的宿主细胞释放，其可以在某些条件下例如通过裂解大量活细胞，使得释放 还原需要的酶和辅因子，这与非常低的氧浓度组合，从而催化第一和第二同二聚体蛋白的 铰链区中的链间二硫键还原，由此促进在生物反应器中或在随后的收获步骤中发生重链交 换（Kao等，2010，Biotechnol.Bioeng 107;622-632)。如此，在又一个实施方案中，本发明 的步骤a)可以与第一和/或第二同二聚体蛋白的生产在同一反应容器中实施。在又一个 实施方案中，步骤b)也可以与步骤a)在同一反应容器中实施，或者与步骤a)和第一和/ 或第二同二聚体蛋白的生产两者在同一反应容器中实施。在此情况中，已经存在于反应中 的氧和二价金属离子也可以刺激步骤b)的再氧化过程。
[0239] 用于生产第一和/或第二同二聚体蛋白的其它条件包括关于步骤a)描述的那些 条件中的任一种。以不同批次生产第一和第二同二聚体蛋白从控制的观点（更容易再现和 /或测定每种同二聚体的品质）看或者在使用同二聚体中的一种通过将其与多种不同其它 同二聚体组合创建多种不同双特异性抗体时可能是有利的。
[0240] 在又一个实施方案中，可以在步骤a)中的温育前纯化第一和/或第二同二聚体蛋 白。用于纯化同二聚体的方法包括但不限于蛋白A和蛋白G层析（或亲和层析的其它方 式）、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用、kappa或 lambda选择、硫亲和力（thioaffinity)、和轻磷灰石层析和其它混合模式树脂。其它纯化方 法包括但不限于用例如盐或聚乙二醇沉淀以获得纯化的蛋白质。还涵盖不同纯化方法的组 合。
[0241] 若分开生产第一和第二同二聚体蛋白，则也可以分开纯化第一和第二同二聚体蛋 白。
[0242] 在备选实施方案中，若分开生产第一和第二同二聚体蛋白，它们可以通过例如蛋 白A纯化一起纯化。将第一和第二同二聚体蛋白一起纯化可以提供一些操作和/或经济效 M〇
[0243] 若将第一和第二同二聚体蛋白一起生产，则也可以通过例如蛋白A纯化将第一和 第二同二聚体蛋白一起纯化。
[0244] 通过在步骤a)前纯化第一和/或第二同二聚体蛋白，有可能除去如下的组分，所 述组分可以影响方法的一个或多个步骤的速率或程度；诸如步骤a)的还原和/或交换过程 和/或步骤b)的氧化过程，或者其可以进一步或备选影响异二聚体蛋白的品质。如上文描 述的，可以将第一和第二同二聚体蛋白分开或一起生产。如此，若将第一和第二同二聚体蛋 白一起生产，则特别地，可以将所述第一和第二同二聚体蛋白一起纯化。若将第一和第二同 二聚体蛋白分开生产，则可以将第一和/或第二同二聚体蛋白分开或一起纯化，例如通过 组合第一和第二同二聚体蛋白，随后将它们纯化。
[0245] 在又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白可以存在于溶液或缓冲液 中。若例如此缓冲液对于步骤a)中发生的还原和交换过程的实施不是最佳的，则可以用另 一种溶液或缓冲剂替换缓冲液。如此，在又一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括 在步骤a)前将其中有第一和/或第二同二聚体蛋白的溶液或缓冲液替换为另一种溶液或 缓冲液的步骤。
[0246] 在又一个实施方案中，可以纯化异二聚体蛋白。用于纯化异二聚体蛋白的方法可 以包括但不限于本文中描述的那些方法中的任一种。用于纯化异二聚体蛋白的相关方法包 括但不限于蛋白A和蛋白G层析（或亲和层析的其它方式）、基于例如抗原结合或抗独特型 抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用、kappa或lambda选择、硫亲和力、和轻磷灰石 层析和其它混合模式树脂。其它纯化方法使用用例如盐或聚乙二醇沉淀而不是层析来获得 纯化的蛋白质。
[0247] 因此，本发明的方法可以进一步包括纯化异二聚体蛋白的步骤。通过纯化异二聚 体蛋白，有可能除去过量的试剂，诸如还原剂，和杂质。纯化异二聚体蛋白还可以包括除去 残留的第一和/或第二同二聚体蛋白。如下文描述的，可以在步骤a)中使用过量的第一或 第二同二聚体蛋白以促进残留第一和/或第二同二聚体蛋白的除去。
[0248] 纯化异二聚体蛋白的步骤可以介于步骤a)和b)之间，但是就大多数目的而言，它 通常可以在步骤b)后。
[0249] 若第一或第二同二聚体蛋白已经经过修饰，例如第一或第二CH3区已经经过修 饰，以降低或消除蛋白A或蛋白G结合，则特别地，可以通过蛋白A或蛋白G层析纯化本发明 的异二聚体蛋白。也可以例如与蛋白A和/或蛋白G层析组合使用其它纯化方法，此类其 它方法包括但不限于，或者亲和层析的其它方式、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲 和层析、kappa或lambda选择、硫亲和力、离子交换、疏水性相互作用、轻磷灰石层析和其它 混合模式树脂。其它方法使用用例如盐或聚乙二醇沉淀而不是层析来获得纯化的蛋白质。
[0250] 在纯化时或在纯化后，可以将异二聚体蛋白配制为适合于贮存异二聚体蛋白，例 如确保异二聚体蛋白稳定性的条件。对异二聚体抗体，此类配制剂通常可以是溶液或缓冲 液。或者，可以将异二聚体蛋白冷冻干燥。
[0251] 适合于本发明方法的过程的设备是本领域技术人员公知的。宿主细胞表达同二聚 体抗体可以例如通常在反应容器，诸如生物反应器中实施。如上文描述的，还原和氧化步骤 a)和b)可以与第一和/或第二同二聚体蛋白的表达在同一生物反应器中发生或者它可以 在分开的生物反应器容器中发生。类似地，还原和氧化步骤a)和b)也可以在同一反应容器 中发生，或者它们可以在分开的反应器容器中实施。若还原和氧化步骤a)和b)在同一反 应容器中发生，则可以将条件从步骤a)改变为步骤b)，如本文中描述的。反应容器和支持 过程管道可以是一次性的或者可再用的，并且由标准材料（塑料、玻璃、不锈钢，等等制成。 可以给反应容器装备混合、喷射、顶部空间除气、温度控制和/或用用于测量温度、重量/体 积、pH、溶解氧（DO)、和氧化还原电势的探头监测。所有此类技术在制造厂的标准单元操作 内是常见的并且是本领域技术人员公知的。
[0252] 可以如本文中描述的那样实施本发明的方法的单个步骤。
[0253] 在一个实施方案中，本发明的方法是胞外方法。如上文描述的，可以通过在宿主细 胞中表达适当地实施第一和第二同二聚体蛋白的生产。因此，在一个具体的实施方案中，可 以在胞外实施步骤a)、b)和c)。在又一个实施方案中，步骤a)、步骤b)、步骤c)、和步骤 a)、b)和c)中任一之间的任何步骤及任何随后步骤可以在胞外实施。
[0254] 第一和第二同二聚体蛋白
[0255] 可以以多种方式使用本发明的方法以生成异二聚体蛋白的期望组合，并且其特别 适合于大规模生产双特异性抗体。除了能够组合靶向不同抗原的抗体以获得选择性结合 夕卜，它可用于通过组合两种靶向相同抗原的不同抗体来改变期望的性质，例如增加 CDC。另 夕卜，它可用于通过用无关（无活性）抗体制备其双非对称抗体来除去拮抗性抗体的部分激 动活性或者将激动性抗体转化为拮抗性抗体。
[0256] 在一个实施方案中，同二聚体蛋白选自（i)Fc区，（ii)抗体，（iii)包含Fc区的融 合蛋白，诸如与受体、细胞因子或激素融合的Fc区区，和（iv)与前药、肽、药物或毒素缀合 的Fc区。
[0257] 在一些实施方案中，除了 Fc区外，所述第一和/或第二同二聚体蛋白还包含抗体 的一个或多个或所有其它区，即CH1区、VH区、CL区和/或VL区。因此，在一个实施方案 中，所述第一同二聚体蛋白是全长抗体。在另一个实施方案中，所述第二同二聚体蛋白是全 长抗体。
[0258] 在一个重要的实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白都是抗体，优选全长抗 体，并结合不同的表位。在此类实施方案中，产生的异二聚体蛋白是双特异性抗体。所述表 位可位于不同抗原或相同抗原上。
[0259] 然而，在其它实施方案中，只有一种同二聚体蛋白是全长抗体，另一种同二聚体蛋 白不是全长抗体，而是例如Fc区，其连同另一种蛋白质或肽序列如受体、细胞因子或激素 一起表达，或者与前药、肽、药物或毒素缀合。若第一和/或第二同二聚体蛋白是抗体，例如 全长抗体，则在一个实施方案中，它可以与前药、肽、药物或毒素缀合或者含有其接受基团。 在又一个实施方案中，同二聚体蛋白都不是全长抗体。例如，两种同二聚体蛋白可以是与 另一种蛋白质或肽序列如受体、细胞因子或激素融合或者与前药、肽、药物或毒素缀合的Fc 区。例如，这可以用于生成与两种不同化合物，例如前药、肽、药物或毒素缀合的异二聚体蛋 白，其通过在本发明的方法中使用与两种不同化合物，例如前药、肽、药物或毒素缀合的第 一和第二同二聚体蛋白进行。这在添加药物的过程或化学与添加另一种药物不相容的情况 中也可以是相关的，那样对第一和第二同二聚体蛋白分别添加两种药物中每种的过程可以 分开且在本发明的方法前实施。
[0260] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白的Fc区与源自选自下组的同种型或选自 下组的同种型的Fc区相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突变 例外），且第二同二聚体蛋白的Fc区与源自选自下组的同种型或选自下组的同种型的Fc区 相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(至少具有本文中指示的突变例外）。在一个优选的 实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者的Fc区与源自IgGl同种型（至少具 有本文中指示的突变例外）或该IgGl同种型的Fc区相似或相同。在另一个优选的实施方 案中，所述同二聚体蛋白的Fc区之一与源自IgGl同种型或该IgGl同种型的Fc区相似或 相同，而另一个与源自IgG4同种型（至少具有本文中指示的突变例外）或该IgG4同种型 的Fc区相似或相同。在后一种实施方案中，所得的异二聚体蛋白包含IgGl的Fc区和IgG4 的Fc区，并且如此就效应器功能的活化而言可以具有令人感兴趣的中间特性。若所述第一 和/或所述第二同二聚体蛋白包含消除Asn连接的糖基化的接受位点的突变或者以其它方 式操作为改变糖基化特性，则可以获得相似的产物。
[0261] 在又一个实施方案中，通过例如按US2009317869所述或按van Berkel等（2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350所述，在同二聚体蛋白，例如抗体产生期间向培养基中加入化 合物，或者例如按 Yamane-Ohnuki 等（2004)Biotechnol. Bioeng87:614 所述，使用 FUT8 敲 除细胞，对同二聚体蛋白中的一种或两种进行糖改造以减少岩藻糖，因此提高ADCC。可采用 Umafta等（1999) Nature Biotechnol 17:176所述方法，备选地使ADCC最优化。或者，可以 在不添加岩藻糖的宿主细胞例如Biowa/KHK中表达第一和/或第二同二聚体蛋白。
[0262] 在又一个实施方案中，例如按照Natsume等（2009)Cancer Sci. 100:2411所述工 程化改造或修饰同二聚体蛋白中的一种或两种以增强补体活化。
[0263] 在又一个实施方案中，已工程化改造同二聚体蛋白中的一种或两种以减少或增加 对新生儿Fc受体（FcRn)的结合以便操纵异二聚体蛋白的血清半衰期。
[0264] 在又一个实施方案中，已将同二聚体起始蛋白中的一种工程化改造或修饰为不 结合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的组合，从而允许通过使产物穿过蛋白A或蛋白 G柱让异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。对于其中相对于作为原料的另一同 二聚体蛋白使用过量的一种同二聚体蛋白的实施方案这可能特别有用。在此类实施方案 中，可能有用的是，工程化改造或修饰会过量使用的同二聚体蛋白的蛋白A或蛋白G结合 位点，从而破坏其结合此类树脂的能力。此类修饰包括但不限于CH3域中的修饰，其在W0 2010/151792(通过提及将其收入本文）中披露。如此，本发明的第一或第二同二聚体蛋白 可以包含W0 2010/151792中描述的CH3域中的一处或多处修饰，其降低或消除IgG对蛋白 A的结合。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含但 不限于选自下组的修饰：a)435R和b)435R和436F。在另一个实施方案中，第一或第二同 二聚体蛋白可以包含下列突变：I253A、H310A、和H435A(AAA)，其还消除对蛋白A的结合。 在异二聚体化反应后，异二聚体蛋白然后可通过在蛋白A柱上通过与过剩的未互换同二聚 体蛋白分离。若使用蛋白G纯化异二聚体蛋白，则本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以 包含但不限于选自下组的修饰：1253、S254、H433和N434(Sloan，D.，等，Prot. Sci. 1999 ; 8:1643-1648 ;Sauer_Eriksson，Ε·，等，Structurel995 ;3:265-278)。在异二聚体化反应 后，异二聚体蛋白然后可通过在蛋白G柱上通过与过剩的未互换同二聚体蛋白分离。其它 纯化方法包括本文中描述的那些方法中的任一种。因此，在一个实施方案中，第一和第二同 二聚体蛋白可以包含不同轻链，诸如kappa和lambda轻链，或者第一和第二同二聚体蛋白 可以是不同同种异型的，诸如本文中描述的。
[0265] 在又一个实施方案中，同二聚体蛋白之一是（l)Fc区或（2)识别无关表位的全长 抗体。
[0266] 待用作本发明同二聚体起始材料的可变区可以例如通过由Kohler 等，Nature256,495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备。可 变区也可从噬菌体抗体文库用描述于例如Clackson等，Nature352, 624628 (1991)和Marks 等，J. Mol. Biol. 222, 581597 (1991)的技术分离。可变区可从任何合适来源获得。因此，例 如，可变区可以自杂交瘤的单克隆抗体获得，所述杂交瘤从自用目标抗原（其例如呈在表 面上表达该抗原的细胞或者编码目标抗原的核酸形式）免疫的小鼠获得的鼠脾脏B细胞制 备。可变区还可以自杂交瘤的单克隆抗体获得，所述杂交瘤从自经免疫的人或非人哺乳动 物诸如大鼠、犬、灵长类等的抗体表达细胞衍生。
[0267] 第一和/或第二同二聚体蛋白可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一个实施 方案中，同二聚体起始蛋白中的一种或两种除了任何指定突变以外是人抗体。人单克隆 抗体可用转基因或转染色体小鼠如HuMAb小鼠或TC小鼠（其携带编码人重链和轻链 全集的全部或部分的微型染色体）产生。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座 (minilocus)，其编码非重排人重链（μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列以及灭活内源 性μ和κ链基因座的靶定突变（Lonberg，N.等，Nature368,856859(1994))。因此，小 鼠展现出降低的小鼠 IgM或κ轻链表达，且在响应免疫时，所引入的人重链和轻链转基 因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG，κ单克隆抗体（(Lonberg，N.等 (1994)，见上文；综述见 Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)，Lonberg，N. and Huszar，D·，Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93(1995)及 Harding, F. and Lonberg, N. Ann. Ν· Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995))。HuMAb 小鼠的制 备详细记载于 Taylor，L.等，Nucleic Acids Research20, 6287 6295 (1992)，Chen, J. 等,International Immunology 5, 647656 (1993), Tuaillon 等,J. Immunol.152,29122 920 (1994), Taylor, L.等，International Immunology 6,579 591 (1994), Fishwild，D. 等，Nature Biotechnology 14,845 851(1996)。还可见 US 5, 545, 806, US 5, 569, 825, US 5,625，126，US 5, 633, 425, US 5, 789, 650, US 5, 877, 397, US 5, 661，016, US 5, 814, 318, US 5, 874, 299, US 5, 770, 429, US 5, 545, 807, W0 98/24884, W0 94/25585, W0 93/1227, W0 92/22645, W0 92/03918和W0 01/09187。这些转基因小鼠的脾细胞可用于按照熟知的技术 产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
[0268] 此外，可使用本领域公知的技术通过直接克隆或展示型技术，包括但不限于噬菌 体克隆或展示、逆转录病毒展示、核糖体展示、哺乳动物展示及其它技术鉴定本发明的人抗 体或者来自其它物种的本发明抗体，并且所得分子可进行另外的成熟，诸如亲和力成熟，因 为此类技术在本领域众所周知。
[0269] 在本发明又一个实施方案中，抗体或其部分如一个更多个CDR源自骆驼科 (Camelidae)物种（见W02010001251)，或者源自软骨鱼物种诸如铰口鲨，或者是重链抗体 或域抗体。
[0270] 在本发明方法的一个实施方案中，步骤a)中的或步骤a)中提供的所述第一和第 二同二聚体蛋白是纯化的。用于纯化同二聚体的方法可以是本文中描述的那些方法中的任 一种，例如下文描述的那些方法中的任一种。
[0271] 在一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白与药物、前药或毒素缀合或者 含有药物、前药或毒素的接受基团。此类接受基团可以是例如非天然氨基酸。在一个具体 的实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白可以与不同化合物缀合，或者含有不同修饰，由此 导致生成包含两种化合物或修饰的异二聚体蛋白。
[0272] 如上所述，同二聚体起始蛋白的第一 CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述 第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相 互作用。
[0273] 在一个实施方案中，与各种同二聚体相互作用相比异二聚体相互作用的强度增 力口，是因为CH3修饰，而非因为引入共价键、半胱氨酸残基或荷电残基。
[0274] 在大多数实施方案中，本发明的产物异二聚体蛋白是高度稳定的，在体外的温和 还原条件下或者重要地对人或动物施用后在体内，不经历Fab臂互换。因此，在一个实施方 案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在描述于实 施例13的条件下在0. 5mM GSH下不能发生Fab臂互换。
[0275] 在另一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体 相互作用使得在描述于实施例14的条件下在小鼠体内不发生Fab臂互换。
[0276] 在另一个实施方案中，例如在按实施例30所述确定时，所得异二聚体蛋白中所述 第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用强度为两种同二聚体相互作用中的最强相互作 用强度的大于2倍，诸如大于3倍，如大于5倍。
[0277] 在又一个实施方案中，所述所述第一和第二CH3区的序列使得所得异二聚体蛋白 中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用的解离常数低于〇. 05微摩尔（μ M)，如按 实施例30描述测定时。
[0278] 在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列使得如按实施例21描述测定 时，两种同二聚体相互作用的解离常数高于0. 01 μ Μ，诸如高于0. 05 μ Μ，优选0. 01-10 μ Μ， 诸如0. 05-10 μ Μ，更优选0. 01-5 μ Μ，诸如0. 05-5 μ Μ，甚至更优选0. 01-1 μ Μ，诸如 0. 05-1 μ Μ，0. 01-0. 5 μ Μ或者0. 01-0. 1 μ Μ。其中同二聚体起始蛋白相对稳定的实施方案 可具有更容易制备大量起始蛋白和例如避免聚集或错折叠的优点。
[0279] 在一些实施方案中，可基于两种在CH3区只含有少数相当保守的不对称突变的同 二聚体起始蛋白，利用本发明的方法以高收率获得稳定的异二聚体蛋白。
[0280] 因此，在一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨 基酸取代。
[0281] 氨基酸取代基可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子例如公开 于Xie J and Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology(2005), 9:548 - 554, 及 Wang Q.等，Chemistry & Biology (2009) ,16:323-336。
[0282] 在一个实施方案中，氨基酸是天然氨基酸。
[0283] 在一个实施方案中，相对于野生型（例如人IgG，诸如人IgGl)CH3区，所述第一同 二聚体蛋白在CH3区具有不超过1个氨基酸取代，而第二同二聚体蛋白在CH3区具有不超 过1个氨基酸取代。
[0284] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代： 366, 368, 370, 399,405,407和409,而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨 基酸取代：366, 368, 370, 399,405,407和409,且其中不在相同位置取代所述第一同二聚体 蛋白和所述第二同二聚体蛋白。
[0285] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：368,370,399,405,407和409。在一 个实施方案中，位置366处的氨基酸选自Arg，Lys，Asn，Gin, Tyr，Glu和Gly。
[0286] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置368处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 370, 399,405,407和409。
[0287] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置370处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 399,405,407和409。
[0288] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置399处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 370,405,407和409。
[0289] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置405处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,407和409。
[0290] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置407处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和409。
[0291] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有氨基酸取代，而所述第 二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和407。
[0292] 因而，在一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列含有不对称突变，即在两 个CH3区的不同位置的突变，如在一个CH3区的405位的突变而另一个CH3区的409位的 突变。
[0293] 在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置409处具有与Lys、Leu或 Met不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有选 自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Phe，Gly，His，lie，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和 Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨 基酸：4找，617，把 8，￥&1和116。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位 置409处具有选自下组的氨基酸：Arg，His，lie和Val。在甚至又一个实施方案中，第一或 第二同二聚体蛋白在位置409处具有Arg。
[0294] 在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置405处具有与Phe不同的 氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe，Arg或 Gly不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有 选自下组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr， Val，Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置405处具有 Leu〇
[0295] 在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置366处具有与Lys，Arg， Ser，Thr或Trp不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置366 处具有与 Phe, Gly, lie, Lys，Leu, Met, Arg, Ser，Thr，Trp 或 Tyr 不同的氨基酸。在甚至 又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置366处具有选自下组的氨基酸：Ile和 Val。
[0296] 在一个实施方案中，所述第一或第二同二聚体蛋在位置368处具有与Phe，Leu或 Met不同的氨基酸。在又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置368处具有与 Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在 位置 368 处具有选自下组的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly，His, lie, Asn，Gin, Arg，Ser，Thr， Val和Trp。在甚至又一个实施方案中，第一或第二同二聚体蛋白在位置368处具有选自下 组的氨基酸：Asp和Glu。
[0297] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或Met不同 的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366, 368, 370， 399,405 和 407。
[0298] 在一个此类实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或 Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe不同的氨基酸。在 本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有与Lys，Leu或Met不 同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。 在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有选自下组的氨基酸:Ala， Asp，Glu，Phe，Gly，His，lie，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和 Tyr，而所述第二同二聚 体蛋白在位置405处具有选自下组的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly, His, lie, Lys，Leu, Met, Asn，Gin, Arg，Ser，Thr，Val, Trp和Tyr。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在 位置409处具有选自下组的氨基酸4找，617，把8，￥&1和116，而所述第二同二聚体蛋白在 位置405处具有Leu。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置409处具有选自 下组的氨基酸：Arg，His，lie和Val，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。在 甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有Arg，而所述第二同二聚 体蛋白在位置405处具有Leu。
[0299] 在另一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有与Lys，Arg，Ser，Thr 或Trp不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与Phe不同的氨基酸。在 又一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在位置366处具有与Phe，Gly，lie，Lys，Leu，Met， Arg，Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白在位置405处具有与 Phe，Arg或Gly不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置 366处具有选自下组的氨基酸：Ile和Val，而第二同二聚体蛋白在位置405处具有选自下 组的氨基酸：Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp 和Tyr。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在位置366处具有选自下组的氨 基酸：Ile和Val，而第二同二聚体蛋白在位置405处具有Leu。
[0300] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409 处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处与Phe不同 的氨基酸和位置409处的Lys。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位 置405处的Phe和位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白 包含位置405处与Phe，Arg或Gly不同的氨基酸和位置409处的Lys。
[0301] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409 处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处的Leu和位 置409处的Lys。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的 Phe和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处与Phe，Arg或Gly不同 的氨基酸和位置409处的Lys。
[0302] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置405处的Phe和位置409 处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
[0303] 在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置 405 处的 Leu。
[0304] 在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处的Arg，而所述第二 同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。
[0305] 在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置370处的Lys、位置 405处的Phe和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys、位置 370处的Thr和位置405处的Leu。
[0306] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处的Lys和：a)位置350处的lie和 位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
[0307] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置409处的Arg，而所述第二 同二聚体蛋白包含位置409处的Lys和：a)位置350处的lie和位置405处的Leu，或b) 位置370处的Thr和位置405处的Leu。
[0308] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置350处的Thr、位置370处 的Lys、位置405处的Phe、和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置409处 的Lys和：a)位置350处的lie和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405 处的Leu。
[0309] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含位置350处的Thr、位置370处 的Lys、位置405处的Phe、和位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白包含位置350处 的lie、位置370处的Thr、位置405处的Leu和位置409处的Lys。
[0310] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr，Asp, Glu，Phe, Lys, Gin, Arg, Ser或Thr不同的氨基酸。
[0311] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala，Gly，His，lie，Leu，Met， Asn, Val 或 Trp〇
[0312] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
[0313] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr，Asp， Glu，Phe, Lys, Gin, Arg, Ser或Thr不同的氨基酸和位置409处的Lys。
[0314] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala，Gly， His，lie，Leu，Met，Asn，Val 或 Trp 和位置 409 处的 Lys。
[0315] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu， Met, Asn或Trp和位置409处的Lys。
[0316] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处与Tyr, Asp, Glu，Phe，Lys，Gin, Arg， Ser或Thr不同的氨基酸和位置409处的Lys。
[0317] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Ala, Gly，His, lie, Leu, Met, Asn, Val或Trp和位置409处的Lys。
[0318] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置407处的Tyr和位置409 处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409 处的Lys。
[0319] 在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而所述第二同二聚体蛋白具有位置366处与Lys，Arg，Ser, Thr或Trp不同 的氨基酸。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met 不同的氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有位置366处与Phe，Gly，lie, Lys，Leu, Met, Arg， Ser，Thr，Trp或Tyr不同的氨基酸。
[0320] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的 氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有位置368处与Phe，Leu或Met不同的氨基酸。在又一个实 施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的氨基酸，而第二同二 聚体蛋白具有位置368处与Phe，Leu，Lys或Met不同的氨基酸。在甚至又一个实施方案中， 第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下组的氨基酸：Ala，Asp, Glu，Phe，Gly，His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val, Trp和Tyr,而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下 组的氨基酸：Ala, Asp, Glu，Gly，His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val 和 Trp。在甚至又 一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下组的氨基酸：Arg，Gly，His, Val 和lie,而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸：Ala，Asp, Glu，Gly， His, lie, Asn, Gin, Arg，Ser, Thr, Val和Trp。在甚至又一个实施方案中，第一同二聚体蛋 白具有位置409处选自下组的氨基酸：Arg，His，Val和lie，而所述第二同二聚体蛋白具有 位置368处选自下组的氨基酸：Asp和Glu。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体 蛋白具有位置409处的Arg，而所述第二同二聚体蛋白具有位置368处选自下组的氨基酸： Asp 和 Glu。
[0321] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys，Leu或Met不同的 氨基酸，而第二同二聚体蛋白具有
[0322] ⑴位置368处与Phe，Leu和Met不同的氨基酸，或
[0323] (ii)位置 370 处的 Trp，或
[0324] (iii)位置399处与Asp，Cys，Pro, Glu或Gin不同的氨基酸。
[0325] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg，Ala，His或Gly，而 第二同二聚体蛋白具有
[0326] (i)位置 368 处的 Lys，Gln，Ala，Asp，Glu，Gly，His，lie，Asn，Arg，Ser，Thr，Val 或Trp,或
[0327] (ii)位置 370 处的 Trp，或
[0328] (iii)位置 399 处的 Ala，Gly，lie，Leu，Met，Asn，Ser，Thr，Trp，Phe，His，Lys， Arg 或 Tyr〇
[0329] 在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg，而第二同二聚体蛋 白具有
[0330] (i)位置 368 处的 Asp, Glu，Gly，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或 Trp，或
[0331] (ii)位置 370 处的 Trp，或
[0332] (iii)位置 399 处的 Phe，His, Lys，Arg 或 Tyr。
[0333] 除了上文规定的氨基酸取代以外，所述第一和第二同二聚体蛋白可含有相对于野 生型（例如人IgG)Fc序列的其它氨基酸取代、缺失或插入。
[0334] 在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含 在 SEQ ID N0:l(IgGlm(a))列出的序列：
[0335] SEQ ID N0:1:
[0336] GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0337] 在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含 在 SEQ ID N0:2(IgGlm(f))列出的序列：
[0338] SEQ ID NO:2:
[0339] GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0340] 在又一个实施方案中，所述第一和第二CH3区除了包含规定的突变以外，还包含 在 SEQ ID N0:3(IgGlm(ax))列出的序列：
[0341] SEQ ID NO:3:
[0342] GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
[0343] 通过本发明生产异二聚体蛋白包括使得第一和第二同二聚体蛋白的CH3区之间 的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区之间各自的同二聚体相互作用。如上文描 述的，此效应特别可以用第一和/或第二同二聚体蛋白的CH3修饰的上文提及的例子获得。 然而，预见到包含与本文中描述的突变不同的突变的第一和/或第二同二聚体蛋白也可以 在本发明的方法中使用。例如，第一和第二同二聚体蛋白可以是大鼠抗体和小鼠抗体（如 Lindhofer等（1995)J Immunoll55:219(见上文）描述的），或者所谓进入隆突-进入-空 穴（knob-in-hole)变体抗体（如描述于美国专利5, 731，168 (见上文））。如此，在本发明 的一个实施方案中，本发明的第一和第二同二聚体蛋白可以包含US 5, 731，168中描述的 隆突-进入-空穴单一或双重修饰。
[0344] 本发明的方法也可以用于生成如W02011/143545中描述的双特异性抗体。
[0345] 可用于本发明的第一和第二同二聚体蛋白的另一个合适的例子包括那些基于第 一和第二同二聚体蛋白的CH3区之间的静电相互作用的，如那些披露于W0 2009/089004 的。此技术又可以称为静电操纵。
[0346] 然而，在一些情况中，后一种同二聚体起始蛋白可能更难生成，因为同二聚体 CH3-CH3相互作用太弱。因此，可以优选本文中描述的在位置366, 368, 370, 399,405,407和 409中的一个或多个具有突变的变体。可以优选本文中描述的在位置350, 370,405和409 中的一个或多个具有突变的变体。
[0347] 同二聚体起始蛋白铰链区的序列可变化。但是，如果铰链区不是IgG4样的，优选 为IgGl样的，所得异二聚体蛋白在一些情况下可能更稳定。
[0348] 如此，在一个实施方案中，所述第一或所述第二同二聚体蛋白在（核心）铰链区都 不包含 Cys-Pro-Ser-Cys 序列。
[0349] 在又一个实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者在（核心）铰链区 都包含 Cys-Pro-Pro-Cys 序列。
[0350] 在其中第一和所述第二同二聚体蛋白是抗体的许多实施方案中，所述抗体还包含 轻链。如上文所解释的，所述轻链可能不同，即序列不同且各自只与一条重链形成功能性抗 原结合域。但是，在另一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是重链抗体，其不需 要轻链用于抗原结合，见例如 Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446。
[0351] 步骤 a)
[0352] 如上文描述的，本发明的方法的步骤a)包括在还原性条件下将所述第一同二聚 体蛋白与所述第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中链间二硫键 的还原。术语"足以"在"足以容许铰链区中链间二硫键的还原的还原性条件"的上下文中 可以特别是根据容许发生Fab-臂交换反应。如此，在一个具体的实施方案中，"足以容许 铰链区中链间二硫键的还原的还原性条件"是导致生成超过50%异二聚体蛋白，诸如超过 60%异二聚体蛋白，或超过70%异二聚体蛋白，或超过80%异二聚体蛋白，或超过90%异 二聚体蛋白，或超过95%异二聚体蛋白，或超过99%异二聚体蛋白，或超过99. 5%异二聚 体蛋白，诸如100%异二聚体蛋白的条件。异二聚体蛋白的百分比在此上下文中相对于第一 同二聚体蛋白、第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白的总量而言。例如，可以通过CIEX测量 异二聚体蛋白的量或百分比，如本文中例子中描述的。
[0353] 在本发明的上下文中，提及"步骤a)的还原性条件"意图指"足以容许铰链区中链 间二硫键的还原的还原性条件"。本文中给出了合适条件的例子。铰链区中链间二硫键还 原的最低需要可以随同二聚体起始蛋白，特别随铰链区的精确序列而不同。不限于任何理 论，铰链区中的半胱氨酸残基可以在还原二硫键后例如与还原剂，诸如2-MEA结合，或者形 成链内二硫键或者与未结合的半胱氨酸残基起反应。
[0354] 步骤a)中的异二聚体蛋白形成基于第一和第二同二聚体蛋白铰链区中二硫键的 还原和所述第一和第二同二聚体蛋白Fc区中的交换。
[0355] 因此，此外，步骤a)的还原性条件可以实现第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交 换，由此生成异二聚体蛋白。也可以在步骤a)中发生两个第一或两个第二同二聚体蛋白的 Fc区的交换，这会导致第一或第二同二聚体蛋白的形成。第一和第二同二聚体蛋白的CH3 区之间的异二聚体相互作用强于所述CH3区各自的同二聚体相互作用。不限于任何理论， 与第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换相比，异二聚体蛋白的Fc区的交换由此可以是 不利的。如此，步骤a) -般可以导致比第一和第二同二聚体蛋白之任一更多的异二聚体蛋 白的生成。因此，一般地，本发明的方法导致获得产物，即第一和第二同二聚体蛋白和异二 聚体蛋白的总量的超过50%,诸如超过60%,或超过70%,或超过80%,或超过90%,或超 过95 %，或超过99 %是异二聚体蛋白。
[0356] 可以将第一和第二同二聚体蛋白一起或分开生成，如也在上文描述的。若将第一 和第二同二聚体蛋白一起生成，步骤a)与第一和第二同二聚体蛋白的生成可以在同一容 器，例如生物反应器中发生。用于生成第一和第二同二聚体蛋白，诸如抗体的方法是本领域 技术人员公知的。
[0357] 步骤a)中的第一同二聚体和第二同二聚体蛋白的浓度不必须是相同的。原则上， 就第一和第二同二聚体蛋白的浓度而言没有限制，但是出于大多数实际目的，步骤a)中第 一和第二同二聚体蛋白各自的浓度通常可以在〇. lmg/mL至100mg/mL的范围中，诸如在 0. 5-100mg/mL的范围中，或在l-75mg/mL的范围中，或在l-50mg/mL的范围中。步骤a)中的 第一和第二同二聚体蛋白的终浓度可以是至少〇.25mg/mL。所述上限主要是因为，浓度高于 200mg/mL的蛋白质会是如此粘滞，以致于它们难以处理，可以达到溶解度的限度，或者蛋白 质聚集率太高。因此，步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的总浓度通常可以在0.2mg/mL 至200mg/mL的范围中，诸如在0· 5-100mg/mL的范围中，或在l-50mg/mL的范围中。
[0358] 在本发明的一个实施方案中，可以在方法的步骤a)中使用过量的第一或第二同 二聚体蛋白。若例如第一同二聚体蛋白对产物安全性或功效具有较强的影响或者比第二同 二聚体蛋白更难以与异二聚体蛋白分开，或者反之亦然或者为了简化或易于纯化通过方法 生成的异二聚体蛋白，则这可以特别相关。使用过量的一种同二聚体蛋白；即第一或第二同 二聚体蛋白可以易于如本文中描述的异二聚体蛋白的后续纯化，因为就不够丰富的蛋白质 而言，它会驱动步骤a)中的交换过程更接近完成。如此，随着第一或第二同二聚体蛋白成 为限制，其大部分会在步骤a)中使用，并且随后的纯化然后主要会在于将异二聚体蛋白与 过量使用的同二聚体蛋白，而不是第一和第二同二聚体蛋白两者分开。因此，在步骤a)中 使用过量的第一或第二同二聚体蛋白特别地可以与使用包含促进纯化的差异的第一和第 二同二聚体蛋白组合。此类差异包括本文中描述的差异，例如不结合蛋白A或蛋白G、不同 的轻链和/或不同的同种异型。使用非等摩尔量的第一和第二同二聚体蛋白可以称为操纵 的非等摩尔交换方法（steered non-equimolar exchange process，SNEEP)，并且可以例如 如本文中实施例64中描述的那样实施。
[0359] 如此，在一个实施方案中，步骤a)中的第一与第二同二聚体蛋白的比率可以不同 于1:1，例如第一与第二同二聚体蛋白的比率可以具有范围为1:1. 03至1:2 ;诸如范围为 1:1. 05至1:1. 5,或范围为1:1. 1至1:1. 5,或范围为1:1. 1至1:1. 4 ;或范围为1:1. 15至 1:1. 35,或范围为1:1. 2至1:1. 3的比率。
[0360] 因此，在一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白在步骤a)中可以以过量 5% -60%的第一或第二同二聚体蛋白，诸如过量15% -55%的第一或第二同二聚体蛋白， 例如过量20% -55%的第一或第二同二聚体蛋白，或过量30-50%的第一或第二同二聚体 蛋白，或特别是过量15 % -35 %的第一或第二同二聚体蛋白，诸如过量20 % -30 %的第一或 第二同二聚体蛋白使用。
[0361] 特别地，步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白可以存在于溶液中，诸如在缓冲液 中。如此，在一个实施方案中，在溶液中，诸如在缓冲液中实施步骤a)。特别地，溶液可以是 水溶液。合适的缓冲液可以是支持还原和交换过程，并且未不利影响第一和第二同二聚体 蛋白或异二聚体的缓冲液，例如第一和第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白在其中稳定的缓 冲液。步骤a)中使用的缓冲液可以与由于先前的加工步骤而存在第一和/或第二同二聚 体蛋白的缓冲液相同，以使方法操作最少化。或者，它可以是不同缓冲液以实现标准化条件 或最佳的还原。例如，可以已经在步骤a)前纯化第一和/或第二同二聚体蛋白，并且可以 已经在纯化过程中改变缓冲液或溶液。
[0362] 用于步骤a)的合适缓冲液的例子包括但不限于PBS (磷酸盐缓冲盐水）、 DPBS (Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水）、PBS Braun (实施例44)、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲 液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。此类缓冲液的具体例子包括那些在本发 明的例子中描述的。如实施例43中也显示的，缓冲液的选择可以影响异二聚体蛋白形成的 动力学。如此，在一个具体的实施方案中，可以在本发明的步骤a)中使用Tris或磷酸盐缓 冲液。步骤a)中使用的缓冲液可以例如是本文中实施例43中描述的磷酸盐或Tris缓冲 液，或者它可以是本文中实施例53中描述的PBS缓冲液。
[0363] 在一个实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以包含范围为Ι-lOOmM的缓冲液，诸如 l-50mM缓冲液或范围为1-25禮，或范围为5-20mM。
[0364] 在一个实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以包含范围为1-lOOmM的磷酸盐，诸如 l-50mM磷酸盐或范围为1-25禮，或范围为5-20mM。
[0365] 步骤a)的还原性条件的pH可以在pH 3-10,诸如pH 4-9的范围中，或者在pH 4. 5-8. 5的范围中。如从实施例43看出的，pH值可以影响异二聚体蛋白形成的动力学。如 此，在一个具体的实施方案中，步骤a)中的还原性条件的pH可以在pH 5-8的范围中，诸如 pH 6-8,或pH 6. 5-7. 5,例如pH特别可以为大约5. 5,或6,或6. 5,或7,或L 5,或L 8或8。
[0366] 合适缓冲液的例子包括实施例43的那些缓冲液，特别是选自下组的缓冲液：1) lx Dulbecco 氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS) :8. ImM 磷酸钠（Na2HP04-7H20)、1. 5mM 磷酸钾（ΚΗ2Ρ04)、 138mM氯化钠（NaCl)、2· 7mM氯化钾（KCl)pH 5· 0 ;2) lx DPBS pH 7· 0 ;3)20mM Tris-HCl, pH 7. 8。
[0367] 在一个备选实施方案中，步骤a)中的缓冲液可以选自下组，但不限于：a) lOmM磷 酸钠、2mM 磷酸钾、137mM NaCl，pH 5.0;b)10mM 磷酸钠、2mM 磷酸钾、137mM NaCl，pH 7.0; c)20mM 柠檬酸钠 ，pH 4.9;d)20mM 柠檬酸钠 ，pH 6.0;和 e)20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH 7· 8。
[0368] 在一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包括还原剂，例如硫氢基还原剂。术 语"还原剂"和"还原试剂"在本发明的上下文中可互换使用。通常，步骤a)中的还原性条 件包括添加还原剂，例如硫氢基还原剂。还原剂可以例如选自下组，但不限于：2_巯基乙 胺（2-MEA)、二硫苏糖醇（DTT)、二硫赤藓糖醇（DTE)、谷胱甘肽、三（2-羧乙基）膦（TCEP)、 L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和β -巯基-乙醇及其化学衍生物，优选选自下组的还原剂：2-巯 基乙胺、二硫苏糖醇、L-半胱氨酸，D-半胱氨酸和二（2-羧乙基）膦。如此，在一个实施 方案中，还原剂可以选自下组：2_巯基乙胺（2-ΜΕΑ)、2-巯基乙胺的化学衍生物（2-ΜΕΑ)、 L-半胱氨酸、和D-半胱氨酸。更特别地，还原剂是2-巯基乙胺（2-ΜΕΑ)、或L-半胱氨酸、 或D-半胱氨酸。还原剂2-巯基乙胺具有其它化学名称，诸如2-ΜΕΑ，和半胱胺，并且此类术 语在本发明的上下文中可互换使用。术语2-ΜΕΑ也用于描述2-巯基乙胺-HC1，其例如在本 发明的实施例中使用。
[0369] 步骤a)的还原剂、其浓度和温育时间的选择应当使得铰链区中的链间二硫键被 还原，并且第一和第二同二聚体蛋白的Fc区的交换是可能的。然而，同时避免使用太严格 的条件，诸如太高的还原剂浓度或太长的温育时间可能是有利的，例如因为它可能是不必 要的且太严格的条件，可能损害第一和/或第二同二聚体蛋白或异二聚体蛋白。最佳条件 可以受到不同参数，诸如温度、pH、溶解氧浓度、同二聚体浓度、缓冲液的选择、痕量金属和 螯合剂、和还原剂的选择和浓度影响。
[0370] 还原剂的合适浓度可以在0. ImM至1M的范围中。若还原剂是2-MEA，则浓度可 以通常在10-500mM的范围中，诸如在25-500mM的范围中，或在40-350mM的范围中，或在 10-100mM的范围中，例如在25-100mM的范围中，或在10-75mM的范围中，例如在25-75mM 的范围中，或在10_60mM的范围中，例如在25-60mM的范围中，或在10-50mM的范围中，例如 在25-50mM的范围中，诸如10mM左右，或25mM左右，或30mM左右，或40mM左右，或50mM左 右。若还原剂是L-半胱氨酸或D-半胱氨酸，则浓度通常可以在10-500mM的范围中，诸如 在10-400mM的范围中，或在10-300mM的范围中，或在10-200mM的范围中，或在20-150mM的 范围中，或在20-125mM的范围中，或在25-100mM的范围中，诸如25mM左右，或50mM左右， 或75mM左右或100mM左右。
[0371] 在又一个实施方案中，步骤a)包括温育至少15分钟，诸如至少20分钟或至少30 分钟，或至少60分钟或至少90分钟，诸如15分钟至10小时，或15分钟至6小时，或15分 钟至5小时，或15分钟至4. 5小时，或15分钟至4小时，或30分钟至10小时，或30分钟 至6小时，或30分钟至5小时，或30分钟至4. 5小时，或320分钟至4小时，或90分钟至 10小时，或90分钟至6小时，或90分钟至5小时，或90分钟至4. 5小时，或90分钟至4小 时，诸如2-5小时，或2-4. 5小时，或2-4小时，或3-5小时，或3-4. 5小时，或3-4小时，或 3. 5-5小时，或3. 5-4. 5小时，例如约2小时，3小时，4小时或5小时。如实施例45和实施 例53中显示的，铰链区中链间二硫键的还原，和第一和第二同二聚体蛋白的Fc区交换以生 成异二聚体蛋白在给定条件下在4小时内完成。
[0372] 步骤a)的最佳温度可以取决于还原剂的选择。通常，温度可以在2_45°C的范围 中，诸如在2-KTC的范围中，或在15-45°C的范围中，或在20-40°C的范围中，或在20-30°C 的范围中，或在30-40°C的范围中，或在22-39°C的范围中，诸如在21-26°C的范围中，或在 22-25°C的范围中，诸如25°C左右或37°C左右。在一个实施方案中，步骤a)包括在存在至少 25mM选自下组的还原剂的情况中于至少20°C的温度温育至少30分钟：2_巯基乙胺、L-半 胱氨酸和D-半胱氨酸。在一个实施方案中，实现受控的Fab-臂交换的还原性条件，即第一 和第二同二聚体蛋白的铰链区中的链间二硫键还原及随后第一和第二同二聚体蛋白的Fc 区交换就需要的氧化还原电势而言进行描述。三肽谷胱甘肽（GSH)是在细胞中的主要低 分子量硫醇，并控制硫醇-二硫化物氧化还原状态，其为体内正常氧化还原信号传导必需。 通过维持还原型GSH及其氧化形式GSSG的硫醇-至-二硫化物状态来实现细胞氧化还原 平衡的动力学。可测量还原电位的数值，如Rost and Rapoport，Nature201:185(1964)及 Aslund 等，J. Biol. Chem. 272:30780-30786 (1997)中的。将每个 GSSG 氧化两个 GSH 的化 学计量加以考虑的氧化还原电势Eh为对氧化还原状态的定量衡量。通过能斯特方程式计 算 Eh :(方程 1) : Eh = EQ+ (RT/nF) In ([GSSG (氧化型）]/ [GSH (还原型）]2)。E。是在限定 pH 下氧化还原对的标准电位，R是气体常数，T是绝对温度，F是法拉第常数，η是转移的电子 数。GSH/GSSG对的Eh的体内估测值在-260至-200mV的范围中（Aw, T.，News Physiol. Sci. 18:201-204 (2003))。因此终末分化的细胞维持-200mV等级的Eh，而活跃增殖的细胞 维持约_260mV的更为还原的Eh。
[0373] DTT 的标准氧化还原电势是 _330mV(Cleland 等 Biochemistry 3:480-482(1964))。TCEP已显示在溶液中还原DTT，因此具有比DTT更负的氧化还原电位。 然而，精确数值尚未报道。因此可以根据需要的氧化还原电势E h描述适合于本发明的步骤 a)的还原条件，所述需要的氧化还原电势Eh最好低于在体内在正常血浆条件下获得的数 值，并且高于还原位于铰链区中且参与链间二硫键形成或参与轻链和重链之间的二硫键的 抗体二硫键外部的抗体二硫键的氧化还原电势。
[0374] 因此，在一个或又一个实施方案中，步骤a)在具有范围低于-50mV，诸如低 于-150mV，优选-150和-600mV之间，诸如-200和-500mV之间，更优选-250和-450mV之 间，诸如-250和-400mV之间，甚至更优选-350至-450mV之间的氧化还原电势的还原条件 下进行。
[0375] 在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下或者至 少0. 5mM二硫苏糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C温度温育至 少30分钟，例如90分钟。
[0376] 在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下或者至 少0. 5mM二硫苏糖醇存在下或至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C温度于5至 8的pH，诸如pH 7. 0或pH 7. 4温育至少30分钟，例如90分钟。
[0377] 在另一个或又一个实施方案中，步骤a)包括在至少25mM2-巯基乙胺存在下，或在 至少25mM L-或D-半胱氨酸存在下在至少20°C温度温育至少30分钟，例如90分钟。可以 于6至8的pH，诸如pH 7-8实施温育。
[0378] 在又一个实施方案中，步骤a)包括在25-75mM2-巯基乙胺存在下，或在25-100mM L-或D-半胱氨酸存在下在20-30°C温度温育4-6小时。可以于6至8的pH，诸如pH 7-8 实施温育。
[0379] 在甚至又一个实施方案中，步骤a)包括在50mM2-巯基乙胺存在下，或在25-100mM L-或D-半胱氨酸存在下在25°C温度温育5小时。可以于6至8的pH，诸如pH 7-8实施温 育。
[0380] 在一个或又一个实施方案中，步骤a)包括添加金属螯合剂，诸如EDTA、EGTA或柠 檬酸。本发明的发明人已经显示了在本发明的步骤a)中使用2-MEA作为还原剂时，步骤a) 中添加或包含EDTA降低此步骤中的2-MEA自身氧化速率，如通过较低的氧化率观察到的 (参见例如实施例47和54)。不限于任何理论，这可以是由于步骤a)中存在的金属离子被 EDTA螯合，然后，这可以降低通过金属离子进行的2-MEA自身氧化。一般地，还原剂的自身 氧化消耗还原剂，导致有效降低的还原剂浓度。如此，通过添加金属螯合剂，可以提高铰链 区中链间二硫键的还原速率和/或为了还原铰链区中的链间二硫键可以需要更少的还原 齐U。金属离子可以例如存在于反应中使用的溶液或缓冲液中和/或它们可以从用于反应的 设备中浸出。
[0381] 可以在步骤a)中添加或包括的合适金属螯合剂的例子包括但不限于EDTA、EGTA 和朽1檬酸。
[0382] 金属螯合剂的浓度取决于步骤a)中组合物中的金属离子浓度，其可以例如受到 步骤a)中使用的组分影响。然而，EDTA或EGTA的相关浓度可以在0. OlmM至10mM的范围 中，诸如在0. ImM至10mM的范围中，诸如在0. 5mM至5mM的范围中，或在ImM至5mM的范围 中，诸如ImM左右，或2mM左右，或3mM左右，或4mM左右或5mM左右。
[0383] 步骤a)中的氧（例如溶解氧）浓度也可以影响链间二硫键的还原和/或第一和 第二同二聚体蛋白的Fc区的交换。如此，在又一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包 括降低步骤a)中存在的氧（例如溶解氧）的量，例如溶解于步骤a)的组合物中的氧量。
[0384] 步骤a)中的组合物中的氧存在或氧（例如溶解氧或氧化剂）量可以受到多种 因素影响，诸如不同化合物的存在或可以降低或提高氧气从空气转移到溶液中的机械效 应。如此，在又一个实施方案中，本发明的步骤a)包括限制混合速率，限制氧喷射，使氧 气至顶部空间的转移最小化或那些的任何组合。在一个实施方案中，混合率可以例如是 50-200rpm，诸如75-150rpm，或75-125rpm，例如lOOrpm左右。顶部空间充气的速率可以例 如在5-25mL/min的范围中，例如在10-20mL/min的范围中，例如15mL/min左右。
[0385] 可以用以下等式2测定传氧速率：
[0386] 0TR = kla X In (D0*_D0) X s，
[0387] 其中：
[0388] 0TR =传氧速率（mM/hr)
[0389] kla =传氧系数（1/小时）
[0390] D0* =平衡D0浓度（氮气=0%，空气=100%，氮气=500% )
[0391] D0 =实际溶解氧浓度
[0392] s =氧溶解度（约 0· 2mM/100% )
[0393] 氧传递范围的最佳范围取决于还原剂的类型和浓度。
[0394] 在实施例57中，使用氮气作为气体，并且在交换反应前使系统D0恢复至0%。用 D0* = 0和D0 = 0依照等式2, 0TR = 0mM/hr。此条件导致合适的交换。
[0395] 在实施例53中，在气相中使用空气，因此D0* = 100%。实施例53(以100RPM搅 动）的kla是0.76/hr。系统的D0从100%的饱和数值下降到0.2%的稳态数值。那么，依 照等式2的此条件的传氧速率是0. 15mM/hr。此条件导致合适的交换。
[0396] 在实施例55中，在气相中使用空气，因此D0* = 100%。实施例55(以400RPM搅 动）的kla是4. Ο/hr。系统的D0从100%的饱和数值下降到3%的稳态数值。那么，依照 等式2的此条件的传氧速率是0. 78mM/hr。此条件导致不完全还原和异二聚体产物的低转 化。
[0397] 这些结果证明了在使用50mM2-MEA作为还原剂时，0-0. 15mM/hr的0TR提供合适的 结果，而0. 78mM/hr或更高的0TR提供亚最佳的结果。
[0398] 若使用空气传递氧，则步骤a)中的传氧系数（kla)可以小于例如3/小时，诸如小 于2/小时,或小于1/小时,或小于0. 90/小时,或小于0. 80/小时，例如小于0. 76/小时， 诸如0.76/小时左右。
[0399] 限制或清除步骤a)中的组合物中溶解的氧量的另一种方式包括添加惰性气体， 诸如氮气至步骤a)以从组合物中置换氧。
[0400] 如此,在又一个实施方案中，步骤a)中的还原性条件包括用惰性气体，例如氮气 置换、消除或替换步骤a)中的组合物中溶解的氧。这可以例如经由用氮气进行顶部空间充 气和/或用足够的搅拌喷射实现。
[0401] 可以通过监测氧化还原电势和/或通过监测溶解氧的浓度追踪第一和第二同二 聚体蛋白的铰链区中的二硫键的还原进展。用于此类监测的手段是本领域技术人员已知 的，并且包括例如不同类型的探头，诸如本文中描述或使用的任何探头。
[0402] 在一个备选实施方案中，可以通过使第一和第二异二聚体蛋白在包含还原剂的材 料上通过实施步骤a)。此类方法的例子可以是包含还原剂的柱，例如包含例如本文中描述 的还原剂的固定化反应剂柱，诸如实施例61中描述的柱。
[0403] 然后可以从所述材料获得异二聚体蛋白，例如将其从柱中洗脱。通过此方法获得 的异二聚体蛋白可以不包含或仅包含痕量的还原剂，因为这与材料（例如在柱中）结合。温 度、溶解氧的浓度、第一和第二同二聚体蛋白的浓度、氧化还原电势和pH可以与上文描述 的那些相似。
[0404] 步骤 b)
[0405] 本发明的方法进一步包括下列步骤：
[0406] b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，该氧化条件足以容许异二聚体蛋白 中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。
[0407] 在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)包括：
[0408] b)使至少10mL从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许异 二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。
[0409] 步骤a)的还原性条件引起第一和第二同二聚体蛋白的铰链区中链间二硫键的还 原。除了铰链区中的链间二硫键外，第一和/或第二同二聚体蛋白中也可以有其它二硫键， 诸如抗体的重链和轻链之间的二硫键或链内二硫键。步骤a)的还原性条件还可以引起第 一和/或第二同二聚体蛋白中此类其它链间或链内二硫键的还原。
[0410] 在步骤a)中的第一和第二同二聚体蛋白的Fc区交换后，若再形成异二聚体蛋白 的第一和第二Fc区之间的铰链区中的二硫键及任选地其它二硫键，则这可以是有利的。由 此导致生成异二聚体蛋白，其至少包含铰链区中的二硫键，以及任选地还有在与第一和/ 或第二同二聚体蛋白中的位置相似的位置处的其它二硫键。此类二硫键的存在提高异二聚 体蛋白的稳定性。
[0411] 实施例41显示了在依照本发明的步骤a)生成的双特异性抗体的缓冲液更换后， 仅将双特异性抗体部分再氧化。因此，实施例41指示所述实施例中的步骤a)的条件对于 双特异性抗体的铰链区中的二硫键再氧化不是充分的。此外，实施例48和实施例57也显 示了在通过添加氮气将其置换来降低溶解氧浓度时，抗体中半胱氨酸至二硫键的再氧化受 到抑制。为了将半胱氨酸氧化成二硫键，两个半胱氨酸应当彼此足够紧密接近。本发明的 方法一般导致异二聚体蛋白的天然再装配。如此，例如通过本方法生成的双特异性抗体中 的半胱氨酸一般可以定位为在第一和第二抗体（第一和第二同二聚体蛋白）中，使得抗体 中存在的二硫键也在双特异性抗体中形成。在本发明的上下文中，提及"步骤b)的氧化条 件"意图指"足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件"。在又一 个实施方案中，步骤b)中的氧化条件足以形成异二聚体蛋白中的所有相关二硫键；例如链 间和链内-硫键两者。
[0412] 在本发明的上下文中，足以容许将异二聚体蛋白中半胱氨酸氧化为链间二硫键的 条件意指形成至少80%、诸如至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少99%、或100% 链间-硫键。如本文中别处描述的，异-聚体蛋白可以包含能够形成链间和链内-硫键两 者的半胱氨酸残基。将半胱氨酸氧化成二硫键的相关时间范围取决于例如制造条件，并且 通常可以在48小时内，诸如24小时内，或15小时内，或10小时内，或5小时内，或4小时 内，或3小时内，或2小时内。
[0413] 出于产业生产的目的，在没有不利影响产物的情况中提高生产速度一般认为是一 个优点。实施例55和56指示提高氧量提高二硫键再氧化的速率。这对于较大体积的异二 聚体蛋白的生产可以是特别相关的。如此，本发明的方法包括步骤b)使至少10mL从步骤 a)获得的组合物经受氧化条件，该氧化条件足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链 间-硫键。
[0414] 在又一个实施方案中，步骤b)中使用的从步骤a)获得的组合物的体积可以是至 少15mL、诸如至少20mL、或至少25mL、或至少30mL、或至少40mL、或至少50mL、或至少75mL、 或至少100mL、或至少125mL、或至少150mL、或至少200mL、或至少250mL、或至少300mL、或 至少350mL、或至少400mL、或至少450mL、或至少500mL、或至少550mL、或至少600mL、或至 少650mL、或至少700mL、或至少750mL、或至少800mL、或至少850mL、或至少900mL、或至少 950mL、或至少1L、或至少2L、或至少3L、或至少4L、或至少5L、或至少10L。原则上，没有上 限，若过程以连续过程运行，则尤其没有。然而，对于许多过程条件，适合于此类生产的反应 器容器可以为1L至10, 000L的大小。
[0415] 在一个或又一个实施方案中，从步骤a)获得的组合物中的异二聚体蛋白的浓度 (例如其用于步骤b))可以是至少0· lmg/mL、诸如至少0· 2mg/mL、或至少0· 3mg/mL、或至 少0· 4mg/mL、或至少0· 5mg/mL、或至少0· 75mg/mL、或至少lmg/mL、或至少1. 5mg/mL、或至 少2mg/mL、或至少3mg/mL、或至少4mg/mL、或至少5mg/mL、或至少10mg/mL、或至少15mg/ mL、或至少16mg/mL、或至少20mg/mL。异二聚体蛋白浓度的上限可以是100-200mg/mL，诸如 100mg/mL左右，或150mg/mL左右，或200mg/mL左右。因此，在一个实施方案中，从步骤a) 获得的组合物中的异二聚体蛋白浓度可以在〇. l_200g/L的范围中，诸如在l-100g/L的范 围中。本发明不限于异二聚体蛋白的特定浓度，然而，在蛋白质的浓度（无论它是第一或第 二同二聚体蛋白还是异二聚体蛋白）太高时，组合物可能变得不稳定或者太粘，使得难以 一起运行和/或可形成蛋白质聚集体。比较而言，太低的异二聚体蛋白浓度可能不是经济 上可行的。
[0416] 获得足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件必需的 氧量（例如通过将其在步骤b)中供应）取决于不同因素。此类因素包括例如从步骤a) 获得的组合物的体积、异二聚体蛋白的浓度、需要氧化的二硫键数目和从步骤a)获得的组 合物中的氧浓度，其可以取决于例如缓冲液中的氧溶解度，该氧溶解度可以取决于特定的 溶液或缓冲液、pH、离子强度、温度、压力和周围氧浓度。使从步骤a)获得的组合物经受本 发明的步骤b)的氧化条件可以提高将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的速 率。一般地，步骤b)中对于将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键足够或必需的 氧量可以是或者大约是每摩尔二硫键〇. 5摩尔氧气（02)，例如在每摩尔二硫键0. 25-0. 75 摩尔氧气（〇2)，诸如每摩尔二硫键〇. 3-0. 7摩尔氧气（02)的范围中。这对应于每2摩尔半 胱氨酸1摩尔氧气（〇2)，诸如在每2摩尔半胱氨酸0.6-1. 4摩尔氧气（02)的范围中。如此， 在一个实施方案中，步骤b)中的"氧化条件"包括每摩尔二硫键0. 3-0. 7摩尔氧气，诸如每 摩尔二硫键存在0. 5摩尔氧气，或在每2摩尔半胱氨酸0. 6-1. 4摩尔氧气的范围中，例如每 2摩尔半胱氨酸1摩尔氧气。
[0417] 因此，获得氧气与二硫键或半胱氨酸的此类比率的相关氧浓度取决于从步骤a) 获得的组合物中的异二聚体蛋白的浓度。
[0418] 在一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件可以包括至少0. 05mM氧气、诸如至 少0. 075mM氧气、或至少0. ImM氧气、或至少0. 125mM氧气、或至少0. 15mM氧气、或至少 0. 175mM氧气、或至少0. 2mM氧气的浓度。
[0419] 氧气的分子溶解度在海水中于latm，25°C是0· 206mM。然而，在本方法的条件（例 如缓冲液，温度等），从步骤a)获得的组合物中的氧浓度可以小于0. 2mM。
[0420] 由于氧溶解度依赖于气相中氧气的部分压力，增加的氧传递可以通过提高系统中 的空气压力获得。例如，压力升高2倍导致平衡溶解氧浓度的2倍增加和增加的传氧速率。 或者，气相中的氧气的部分压力可以通过使用氧气代替空气提高。由于空气含有约21%氧 气，纯氧气的使用提供高约5倍的平衡溶解氧浓度和增加的传氧速率。可以组合压力和纯 氧气以进一步提高氧溶解度和传递率。
[0421] 在一个实施方案中，步骤b)中的氧化条件包括用氧气饱和从步骤a)获得的组合 物。
[0422] 从步骤a)获得的组合物一般包含少量的氧，以确保铰链区中的链间二硫键的正 确还原。如此，可能有必要在本发明的方法的步骤b)中供应氧气。
[0423] 在一个实施方案中，如上文描述的，第一和第二同二聚体蛋白可以存在于溶液，诸 如缓冲液中。如此，在一个具体的实施方案中，从步骤a)获得的组合物可以是溶液，例如缓 冲液。在此实施方案中，它是溶解于溶液中的氧量，即溶解氧浓度，其对于异二聚体蛋白中 半胱氨酸的氧化是重要的。
[0424] 如此，在一个实施方案中，"步骤b)的氧化条件"指控制溶解氧的水平，其可以例如 包括增加从步骤a)获得的组合物中的溶解氧的量或浓度。
[0425] 用于获得或产生步骤b)的氧化条件的不同手段可以在本发明的方法中使用，并 且包括但不限于本文中描述的那些手段。
[0426] 在一个实施方案中，本发明的步骤b)的氧化条件包括添加氧气。术语"添加氧气" 在本发明的上下文中应当理解为在从步骤a)获得的组合物中提高氧量，例如溶解氧，使得 它足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键。添加氧气的手段或方法包括但 不限于机械手段、将从步骤a)获得的组合的溶液或缓冲液改变为包含较高氧量的溶液或 缓冲液，诸如用于本文中描述的渗滤的缓冲液之一，用包含足够氧的溶液或缓冲液稀释从 步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液，添加能够生成氧气的化合物，提高压力或者通过直 接添加或包括氧，例如氧气。也可以使用此类方法的组合。
[0427] 可以例如连续测量步骤b)中氧的量或浓度，从而确保步骤b)期间的所有时间有 足够的氧。用于测量氧的方法或设备是本领域技术人员公知的，并且可以例如包括本文中 描述的那些方法或设备中的任一种，诸如实施例44中描述的探头。
[0428] 例如通过用氧气或空气喷射或提高压力对步骤b)添加氧气。另一种方法可以是 提高提高氧气从环境（例如空气）的传递。这可以例如通过机械手段，例如通过搅拌、搅 动、提高压力或产生流进行。例如，若步骤b)中的组合物存在于容器（诸如器皿）中，例 如，可以将氧气从例如顶部空间传递到步骤b)的组合物中，或者可以应用用于搅动或搅拌 步骤b)的组合物的手段。通过控制搅动或搅拌步骤b)中的组合物的速率，可以控制自环 境中的传氧率，即搅动或搅拌速率或流动越高，可以对从步骤a)获得的组合物中传递越多 的氧。也可以应用用于提高压力的手段。对步骤b)添加氧气也可以通过不同手段的组合 实施，例如，搅动和/或搅拌可以与喷射和/或用氧气或空气提高步骤b)中的组合物的压 力组合。
[0429] 在另一个实施方案中，本发明的步骤b)中的氧化条件包括氧化剂。优选地，氧化 剂是能够确保异二聚体蛋白中链间二硫键的氧化，但是同时避免氧化异二聚体蛋白中已知 对氧化敏感的其它部分，诸如如甲硫氨酸和色氨酸等氨基酸的氧化剂。合适的氧化剂的例 子是脱氢抗坏血酸（dhAA)。若使用dhAA氧化步骤a)中存在的还原剂，则dhAA的典型浓度 可以在还原剂浓度的1-2倍的范围中，例如在50-100mM的范围中。若在添加 dhAA前除去 步骤a)中存在的还原剂，则足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧 化剂量可以较低，诸如在〇. 01-lmM，例如0. 1-lmM的范围中。若在本发明的步骤b)中添加 氧化剂，诸如dhAA，则随后可以使用标准过滤和/或层析技术将其除去。
[0430] 可以组合使用用于在步骤b)中添加或增加氧的不同手段或方法。
[0431] 例如，不依赖于例如如何通过用氧气喷射、搅拌、搅动或产生流添加氧气，在一个 实施方案中，它可以与添加氧化剂组合。
[0432] 在本发明的一个实施方案中，步骤a)的还原性条件包含还原剂，其也可以存在于 从步骤a)获得的组合物中，因此经受步骤b)的氧化条件。步骤b)中的还原剂存在对于步 骤b)的氧化条件可以是有害的。如此，在一个实施方案中，可以将异二聚体蛋白与还原剂 分开。如下文描述的，本发明的发明人已经发现了用于将还原剂与异二聚体蛋白分开的某 些方法导致或产生足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件。
[0433] 根据方法，除去还原剂或将异二聚体蛋白与还原剂分开可能不一定足以容许将异 二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键，在步骤a)中生成大量异二聚体蛋白，即高浓 度和/或高体积的异二聚体蛋白时，尤其不行（参见例如实施例41、52和53)。然而，出于 其它原因可能有利的是，将异二聚体蛋白与还原剂分开，并且因此，本发明的方法可以进一 步包括将异二聚体蛋白与还原剂分开的步骤。下文进一步描述将还原剂与异二聚体蛋白分 开的实施方案。
[0434] 用于减少从步骤a)获得的组合物中的还原剂量的另一种方法是增加所述组合物 的体积，由此降低从步骤a)获得的组合物中还原剂的浓度。因此，在又一个实施方案中，可 以例如通过添加与从步骤a)获得的组合物的缓冲液相同的缓冲液（只是它不含步骤a)的 还原剂）或者通过添加与从步骤a)获得的组合物的缓冲液不同的缓冲剂（它不含步骤a) 的还原剂）增加从步骤a)获得的组合物的体积。增加从步骤a)获得的组合物的体积可以 与本文中描述的其它实施方案（包括用于分开还原剂和异二聚体蛋白的方法）组合使用。
[0435] 如上文描述的那样对步骤b)中的组合物添加氧气和/或氧化剂可以足以容许将 异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。此外，若步骤a)包括还原剂，则这些条件 也足以氧化还原剂，从而其不能进一步还原异二聚体蛋白的链间二硫键。如此，在又一个实 施方案中，步骤b)的氧化条件足以容许氧化步骤a)的还原剂。例如，若在步骤a)中使用 2-MEA作为还原剂，则步骤b)的氧化条件可以使得2-MEA自身氧化，从而它不能还原任何二 硫键（参见例如实施例59)。不依赖于还原剂被氧化与否，随后将异二聚体蛋白与还原剂分 开可以是相关的。因此，在又一个实施方案中，本发明的方法还可以包括分开异二聚体蛋白 和还原剂。用于将异二聚体蛋白与还原剂分开的方法包括本文（例如下文）中描述的那些 方法中的任一种。异二聚体蛋白和还原剂的分开可以是步骤b)的一部分或者可以是一个 分开的步骤。
[0436] 如此，在一个实施方案中，步骤b)包括添加氧气或氧化剂，任选地随后分开异二 聚体蛋白与还原剂。也可以在步骤b)后以分开的步骤实施分开异二聚体蛋白与还原剂。
[0437] 在步骤b)中添加氧气和/或氧化剂也可以导致还原剂的氧化，而没有将异二聚体 蛋白中的半胱氨酸完全氧化成二硫键。在此情况中，可以将异二聚体蛋白与还原剂分开，然 后随后可以将异二聚体蛋白的半胱氨酸氧化成链间二硫键，这通过例如如上文描述的，添 加氧气和/或氧化剂进行。如此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括使从步骤a)获得的 组合物经受足以氧化还原剂的氧化条件，分开异二聚体蛋白与还原剂，并使异二聚体蛋白 经受足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的条件。例如，可以与上文所 述类似地通过添加氧气和/或氧化剂进行或实施还原剂和异二聚体蛋白中的半胱氨酸至 链间二硫键的氧化。然而，就用于还原剂氧化和异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二 硫键的需要的氧量、温育时间等而言，可以有一些差异。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的 方法包括但不限于下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。因此，在一个实施方 案中，步骤b)可以包括使从步骤a)获得的组合物经受层析，例如柱层析，或过滤，例如渗 滤，诸如切向流过滤或正常流过滤。用于实施层析或过滤的方法包括但不限于下文描述的 任何方法。
[0438] 在另一个实施方案中，步骤b)的氧化条件可以使得与分开异二聚体蛋白和还原 剂同时将异二聚体蛋白的半胱氨酸氧化成链间二硫键。在此情况中，本发明的步骤b)可以 包括与分开异二聚体蛋白和还原剂同时添加氧气和/或氧化剂，如上文描述的。因此，在一 个实施方案中，用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法或条件可以导致或容许将异二聚体 蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。如此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括分开异 二聚体蛋白和还原剂。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法包括但不限于下文描述的任 何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。因此，在一个实施方案中，步骤b)可以包括使从步骤 a)获得的组合物经受层析，例如柱层析，或过滤，例如渗滤，诸如切向流过滤或正常流过滤。 用于实施层析或过滤的方法包括但不限于下文描述的任何方法。
[0439] 在又一个实施方案中，本发明的方法可以包括分开异二聚体蛋白与还原剂，随后 使异二聚体蛋白经受足以容许在异二聚体蛋白中将半胱氨酸氧化成链间二硫键的氧化条 件。在此实施方案中，分开异二聚体蛋白与还原剂的步骤可以视为步骤b)前的分开的步骤 或者其可以视为步骤b)的一部分。用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法包括但不限于 下文描述的任何方法，例如透析、沉淀、层析或过滤。可以如上文描述的那样获得足以容许 在异二聚体蛋白中将半胱氨酸氧化成链间二硫键的氧化条件，通过例如对包含异二聚体蛋 白的组合物添加氧气和/或氧化剂进行。
[0440] 用于分开异二聚体蛋白与还原剂的方法在原则上可以是任何导致或能够分开两 者而不损害异二聚体蛋白的方法。此类方法包括但不限于透析、沉淀、层析或过滤。分开异 二聚体蛋白和还原剂可以作为连续过程实施或者其可以作为分批过程实施。
[0441] 包含异二聚体蛋白的从步骤a)获得的组合物可以特别是溶液，诸如缓冲液。可以 通过用没有还原剂的另一种缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液完 成异二聚体蛋白与还原剂的分开。除非存在还原剂，可以将缓冲液或溶液更换为与从步骤 a)获得的组合物相同的缓冲液或溶液，或者可以将其更换为另一种缓冲液或溶液，诸如适 合于随后的步骤或异二聚体蛋白的最终配制剂的缓冲液或溶液。在一个实施方案中，将从 步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液更换的溶液或缓冲液也可以包含氧，例如溶解氧，或 氧化剂。因此，在步骤b)中更换或稀释从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液可以产生 "足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化为链间二硫键的氧化条件"。如上文描述的，步 骤b)的氧化条件可以通过不同手段获得；例如添加氧气或氧化剂，通过除去还原剂（分开 异二聚体蛋白和还原剂）、机械手段，例如层析或过滤方法，和/或通过将从步骤a)获得的 组合物的缓冲液或溶液更换成包含较高的氧量或氧化剂的缓冲液或溶液。"较高的氧量"在 此上下文中应当理解为与从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液中存在的氧量相比。从 步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液的更换可以例如通过层析或过滤实施。如此，在一个 实施方案中，本发明的方法包括通过层析或过滤更换从步骤a)获得的组合物的溶液（例如 缓冲液）的步骤。
[0442] 从步骤a)获得的组合物的溶液或缓冲液的更换可以例如用至少3 (三）个体积的 没有还原剂的缓冲液或溶液完成。原则上，可以更换的体积数没有上限，但是对于大多数 实际目的，可以更换3-12个体积的缓冲液或溶液，诸如范围为4-11个体积，或范围为4-10 个体积，或范围为5-10个体积，例如5,6, 7,8,9或10个体积可以足以充分降低还原剂的浓 度，或者从从步骤a)获得的组合物除去还原剂。
[0443] 通过层析或过滤分开异二聚体蛋白和还原剂可以牵涉溶液或缓冲液的更换，SP如 上文描述的缓冲液或溶液更换。
[0444] 在一个具体的实施方案中，用于分开异二聚体蛋白和还原剂的层析方法的合适例 子可以是基于结合和洗脱的层析方法。术语"结合和洗脱"基于还原剂或异二聚体蛋白对 层析材料的结合，而其它组分不结合。可以在流过和清洗步骤中收集不结合层析材料的组 分，而可以在改变缓冲液条件后分开收集结合的材料，从而从柱中洗脱组分。存在不同层析 方法，并且最合适的方法取决于还原剂的选择和异二聚体蛋白。合适的例子包括但不限于 蛋白A和蛋白G层析（或亲和层析的其它方式）、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和 层析、kappa或lambda选择、阳离子交换层析、混合模式层析（例如羟磷灰石）、离子交换、 疏水性相互作用、固定化金属亲和层析和亲硫性吸附层析。
[0445] 在一个实施方案中，层析可以是柱层析。如上文描述的，层析可以牵涉用没有还原 剂的另一种缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶液。这可以例如牵涉 范围3-12个体积的缓冲液或溶液更换。层析方法经常以分批过程实施，如此若通过层析分 开异二聚体蛋白和还原剂，则它在一个实施方案中可以以分批过程实施。
[0446] 如上文描述的，也可以通过过滤分开异二聚体蛋白和还原剂。过滤方法的合适例 子是渗滤。本发明的发明人已经发现了渗滤的条件可以足以容许异二聚体蛋白中的半胱氨 酸氧化为链间二硫键，即使在使用大体积的从步骤a)获得的组合物时（参见例如实施例 41)。如此，可以与将异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键同时进行通过渗滤分开 异二聚体蛋白和还原剂。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)可以包括从步 骤a)获得的组合物的渗滤。渗滤可以牵涉至少三个体积的缓冲液或溶液更换，如上文描述 的。渗滤的方法包括切向流过滤（TFF)和正常流过滤（NFF)，两者都可以用于本发明的方 法。TFF和NFF两者可以作为连续过程或作为分批过程实施。如此，在一个实施方案中，本 发明的步骤b)包括使从步骤a)获得的组合物经受下列方法之一：连续TFF、分批TFF、连续 NFF或分批NFF。
[0447] 不同的渗滤方法是本领域技术人员已知的。出于本发明的目的，例如可以用具有 范围为10-50kDa，例如20-40kDa，诸如30kDa左右的截留值的膜实施渗滤。膜可以例如由 材料诸如聚醚砜（PES)、改良型聚醚砜（mPES)、再生纤维素（RC)、三乙酸纤维素（CTA)、亲水 化聚偏氟乙烯（PVDF)、硝酸纤维素或尼龙制成。膜的构造可以例如是中空纤维、平片材或螺 旋缠绕的（spirally wound)。
[0448] 在一个实施方案中，可以使用中空筒，诸如纤维筒进行渗滤。中空筒的表面积影 响渗滤率，即表面积越大，渗滤率越高。渗滤率可以例如以L/小时测量。表面积可以在 0. 05-lm2的范围中，例如在0. 05-0. 5m2的范围中，诸如0. lm2左右，或0. 16m2左右或0. 4m2 左右。
[0449] 筒入口压力可以在10-40psig(70_280kPa)的范围中，优选在 20-30psig(140-210kPa)的范围中。
[0450] 术语"psig"指高于大气压的每平方英寸的磅数，并且与单位Pa (帕斯卡）的关联 是 101，325Pa = 14. 7psig。
[0451] 术语"PSI"指每平方英寸的磅数。
[0452] 可以将渗滤实施一段时间，该时间段对于实施相关数目的体积的缓冲液/溶液更 换是必需的。合适的时间段取决于例如膜的表面积、膜的类型、异二聚体蛋白的浓度、系统 压力、循环速率、滤器筒的几何学、温度、溶液的粘性、要过滤的体积、渗滤过程中由溶液引 起的滤器污垢量。通常，可以将渗滤实施30分钟至20小时。
[0453] 在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过中空纤维筒实施所述渗滤， 直到发生了 1至7个，诸如3至7个，或5至7个或7个体积的缓冲液更换，所述中空纤维筒 包含范围为10_50kDa的截留值，且具有范围为0. 05-lm2的表面积，具有范围为70-280kPa 的筒入口压力。
[0454] 在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤 维筒实施所述渗滤，直至发生了 5至7,诸如七（7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良型 聚醚砜中空纤维筒具有0. lm2的表面积及25PSI (170kPa)的筒入口压力，导致25mL/min的 渗透率。
[0455] 在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤 维筒实施所述渗滤，直至发生了 5至7,诸如七（7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良 型聚醚砜中空纤维筒具有0. 4m2的表面积及25PSI (170kPa)的筒入口压力，导致100mL/min 的渗透率。
[0456] 在一个实施方案中，可以通过使所述组合物循环通过30kDa改良型聚醚砜中空纤 维筒实施所述渗滤，直至发生了 5至7,诸如七（7)个体积的缓冲液更换，所述30kDa改良型 聚醚砜中空纤维筒具有0. 16m2的表面积及25PSI (170kPa)的筒入口压力，导致lOOmL/min 的渗透率。
[0457] 以连续过程实施过滤一般包括以与除去渗透物相同的速率对系统添加缓冲液或 溶液，由此使系统中溶液/缓冲液的量保持恒定。如此，在本发明的上下文中，这会意味着 在步骤b)中，以与除去渗透物相同的速率对从步骤a)获得的组合物添加缓冲液/溶液。可 以从保留物中收集异二聚体蛋白。另一方面，在本发明的方法中以分批过程实施层析或过 滤通常可以牵涉浓缩从步骤a)获得的组合物中存在的异二聚体蛋白，而除去从步骤a)获 得的组合物的溶液。或者，可以将包含异二聚体蛋白的从步骤a)获得的组合物稀释，随后 通过层析或过滤浓缩。若将该过程实施超过一次，则随后可以将浓缩的异二聚体蛋白在缓 冲液或溶液中再次稀释，之后重复层析或过滤步骤。
[0458] 在一个实施方案中，可以在分开还原剂和异二聚体蛋白前稀释从步骤a)获得的 组合物。
[0459] 在一个实施方案中，可以将通过层析或过滤，例如渗滤分开异二聚体蛋白和还原 剂实施一次。
[0460] 在一些实施方案中，可以将通过层析或过滤分开异二聚体蛋白和还原剂重复两次 或更多次，例如以之间的不同步骤。如此，在一个实施方案中，本发明的方法可以包括步骤 1)-111)。在一个具体的实施方案中，本发明的步骤b)可以包括步骤D-III):
[0461] I)分开从步骤a)获得的组合物的异二聚体蛋白和还原剂，
[0462] II)温育包含异二聚体蛋白的自步骤I)获得的组合物，
[0463] III)分开自步骤II)获得的组合物的异二聚体蛋白和还原剂。
[0464] 异二聚体蛋白和还原剂的分开在步骤I)中可能不是完全的，从而自步骤I)获得 的包含异二聚体蛋白的组合物仍然可以包含还原剂。
[0465] 可以通过本文中描述（诸如上文描述）的方法实施分开步骤I)中的异二聚体蛋 白和还原剂。特别地，它可以通过渗滤实施。上文描述的层析和过滤的条件也适用于步骤 I)和III)。可以将步骤II)中温育自步骤I)获得的异二聚体蛋白于范围为10-45°c，例如 范围为15-40°C，或范围为15-35°C，或范围为20-40°C，或范围为20-35°C的温度进行例如1 小时至10天的时段，或1小时至5天，或1小时至3天，或1小时至48小时，诸如5-24小 时，或8-18小时的时段。在又一个实施方案中，可以将步骤II)中温育自步骤I)获得的异 二聚体蛋白于范围为15_40°C的温度实施1至24小时的时段。
[0466] 在又一个实施方案中，步骤I)可以包括从步骤a)获得的组合物的渗滤。如此，在 又一个实施方案中，步骤I)、II)和III)可以包括：
[0467] I)渗滤从步骤a)获得的组合物
[0468] II)温育自步骤I)获得的渗余物
[0469] III)渗滤自步骤II)获得的组合物。
[0470] 在又一个实施方案中，步骤I)和/或III)中的渗滤可以包括缓冲液更换，诸如范 围为3-12个体积的缓冲液更换。
[0471] 在甚至又一个实施方案中，步骤II)包括在范围为15_35°C的温度温育12-48小时 的时段。
[0472] 如实施例45中显示的，对于一些条件（例如取决于步骤a)的还原性条件）可以 重复异二聚体蛋白和还原剂的分开，这有助于确保异二聚体蛋白中的半胱氨酸完全再氧化 成链间二硫键和/或使包含异二聚体蛋白的组合物中的还原剂量进一步最小化。
[0473] 此外，本发明的发明人已经发现了 EDTA(-种金属螯合剂）的存在（参见实施例 49)导致同二聚体蛋白中半胱氨酸至链间二硫键的氧化率降低，其中同二聚体蛋白用作异 二聚体蛋白的例子。对异二聚体蛋白看到类似的观察结果（实施例54)。这指示步骤b)中 的存在金属离子，至少与不存在金属离子的情况相比，提高异二聚体蛋白中半胱氨酸至链 间二硫键的氧化率。如此，在又一个实施方案中，步骤b)，例如步骤b)中的氧化条件可以包 含金属离子。可以在步骤b)中将金属离子添加至从步骤a)获得的组合物，或者它可以存在 于从步骤a)获得的组合物中，例如通过选择步骤a)中的缓冲液或溶液。因此，在一个实施 方案中，步骤b)中的氧化条件包括添加金属离子。即使金属离子已经存在于从步骤a)获 得的组合物中，进一步的金属离子可以添加或在步骤b)期间添加，尤其若金属离子的浓度 如此之低，以致于它可能限制异二聚体蛋白中的半胱氨酸至链间二硫键的氧化速率，或若 存在金属螯合剂。特别地，合适的金属离子的例子是二价过渡金属离子，诸如铜，例如以硫 酸铜形式，猛、铁、镍、镁和钴。适当地，金属离子可以以范围为0. 〇l-l〇〇ppm,或0. 1-100 μ Μ 的浓度存在或者添加。可以将铜以例如硫酸铜添加至步骤b)。
[0474] 若金属螯合剂存在于方法的步骤a)中，则特别可以添加二价过渡金属，例如铜 (例如为硫酸铜形式）的添加。硫酸铜可以发挥用氧进行氧化的催化剂的功能。
[0475] 本发明的发明人还已经发现了步骤b)中的氧化还原电势特别影响异二聚体蛋白 中半胱氨酸至链间二硫键的再氧化的速率，而且还在一定程度上影响产率。本发明的发明 人已经发现了重链间的链间二硫键的再氧化在约-350mV开始，而重链和轻链之间的链间 键的再氧化在约_280mV开始。异二聚体蛋白中所有二硫键的完全形成一般在氧化还原电 势高于_50mV时发生，而对于最佳的过程鲁棒性（robustness)，氧化还原电势应当优选是 至少50mV。因此，在又一个实施方案中，步骤b)中的氧化还原电势可以高于-300mV，诸如 高于-280mV，或高于-75mV，或高于-50mV、或高于OmV、或高于25mV、或高于50mV。为了将 异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫键，其是相关的氧化还原电势的下限。步骤b)中氧 化还原电势的上限可以是100-300mV左右，例如100-200mV，诸如100mV左右、或200mV左 右或250mV左右、或300mV左右。因此，步骤b)的氧化还原电势可以在-300mV至300mV、 或-300mV至200mV的范围中、或在-280mV至300mV、或-280mV至200mV的范围中、或 在-75mV 至 300mV、或-75mV 至 200mV 的范围中、或在-50mV 至 300mV、或-50mV 至 200mV 的 范围中、或在OmV至300mV、或OmV至200mV的范围中、或在25mV至300mV、或25mV至200mV 的范围中，或在50mV至300mV、或50mV至200mV的范围中。
[0476] 此外，本发明的发明人已经发现了在从步骤a)获得的组合物为溶液的实施方案 中，步骤b)中的pH也影响异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成二硫键。因此，在又一个实 施方案中，步骤b)中的pH在一个具体的实施方案中可以在pH 6-8. 5的范围中，诸如pH 6. 5-8的范围，或在pH 6. 5-8. 5的范围中，或在pH 6-8的范围中，或pH 6. 5-7. 5的范围，或 pH 7-7. 5的范围，例如pH 7. 4左右。
[0477] 确保步骤b)中的组合物的pH在某些范围内，例如pH 6-8. 5可以例如通过选择具 有合适pH的步骤a)中的溶液或缓冲液，或者通过对步骤b)中的组合物添加能够调节pH 的组分，例如浓缩的pH调节溶液来进行。确保步骤b)中的组合物的pH在特定范围内也可 以通过使用包含缓冲液更换的上文描述的方法之一进行，从而更换的缓冲液或溶液包含相 关范围内的pH。
[0478] 步骤b)中的缓冲液或溶液（例如用其改变从步骤a)获得的组合物，例如通过渗 滤）可以包括但不限于本文中描述的任何缓冲液或溶液，诸如实施例中描述的任何缓冲液 或溶液。此类缓冲液的例子包括例如PBS (磷酸盐缓冲盐水），PBS，pH 7. 4。
[0479] 可以通过监测氧化还原电势和/或通过监测溶解氧浓度追踪第一和第二同二聚 体蛋白的铰链区中链间二硫键的还原的进展。用于此类监测的手段是本领域技术人员公知 的，并且包括例如使用不同类型的探头，例如实施例44中描述的探头之一。
[0480] 在一些实施方案中，本发明的方法产生抗体产物，其中超过80%，诸如超过90%、 例如超过95%、诸如超过99%抗体分子是期望的双特异性抗体。
[0481] 与基于共表达的方法相比，本文中描述的后生产（post-production)方法更灵活 且更容易控制。
[0482] 钝化
[0483] 虽然本发明的方法经常产生较高的异二聚体蛋白产率，但是残留量的第一和/或 第二同二聚体蛋白也存在于通过本发明的方法获得的产物或组合物中。
[0484] 此外，通过本发明的方法获得的产物还可以包含方法过程中存在的还原剂和/或 其它组分诸如缓冲液或盐。在某些情况中，可以优选除去此类组分，从而它们不存在于终产 物中。
[0485] 如上文描述的，在一些实施方案中，可以在本发明的步骤b)中除去还原剂、缓冲 液组分、或盐。这些组分的除去可以作为本方法的分开的方法实施或者与还原剂的除去同 时实施，例如通过上文描述的任何方法，诸如牵涉从步骤a)获得的组合物的缓冲液更换的 任何方法进行。
[0486] 因此，在又一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括异二聚体蛋白的纯化 步骤。异二聚体蛋白的纯化可以视为步骤c)获得异二聚体蛋白。因此，在一个实施方案中， 步骤c)包括使自步骤b)获得的组合物经受纯化方法。
[0487] 合适的纯化方法的例子包括但不限于选自下组的方法：蛋白A和蛋白G层析（或 亲和层析的其它方式）、基于例如抗原结合或抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性 相互作用层析、kappa或lambda选择、硫亲和力、混合模式层析（例如轻磷灰石）、固定化金 属亲和层析和亲硫性吸附层析。其它纯化方法包括但不限于用例如盐或聚乙二醇沉淀以获 得纯化的蛋白质。还涵盖不同纯化方法的组合。
[0488] 使异二聚体蛋白经受纯化步骤，或纯化方法指异二聚体蛋白的任何种类的纯化； 诸如分开异二聚体蛋白与残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白，或分开异二聚体蛋白与 其它组分，例如还原剂、盐或缓冲液或其它产物或方法相关杂质。
[0489] 自残留量的第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或分开异二聚体蛋白可以由于异 二聚体蛋白非常类似于第一和第二同二聚体蛋白而变得复杂。如此，异二聚体蛋白与残留 量的第一和/或第二同二聚体蛋白的分开可以比异二聚体蛋白与存在的其它组分，例如还 原剂、缓冲剂或盐的分开更困难。
[0490] 如本文中别处描述的，可以实施本发明的方法，从而相对于异二聚体蛋白的形成， 第一或第二同二聚体蛋白的量是有限的。此类方法的一个例子称为操纵非等摩尔交换方 法（SNEEP)。如此，第一或第二同二聚体蛋白在步骤a)中可以超过另一种同二聚体蛋白存 在。特别地，可以通过相对于另一种包含过量或有限量的一种同二聚体蛋白调节步骤a)中 第一和第二同二聚体蛋白的比率，从而导致有限的同二聚体蛋白在步骤a)中完全使用。这 导致生成组合物，即从步骤a)获得的组合物，其包含异二聚体蛋白及残留量的仅第一和第 二同二聚体蛋白之一，而不是第一和第二同二聚体蛋白两者。随后从残留同二聚体蛋白纯 化异二聚体蛋白由此变得更简单，因为异二聚体蛋白仅必须与第一或第二同二聚体蛋白而 不是它们两者分开。
[0491] 因此，在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在步骤a)中超过第二同二聚体蛋白 存在，或反之亦然。特别地，第一与第二同二聚体蛋白的比率可以是如本文中描述的。
[0492] 在又一个实施方案中，用过量的第一或第二同二聚体蛋白实施方法与等度洗脱的 纯化步骤组合。
[0493] 在一个实施方案中，用过量的第一或第二同二聚体蛋白实施方法与纯化步骤组 合，所述纯化步骤基于过量使用的同二聚体的抗原结合或抗独特型抗体结合。
[0494] 在一个实施方案中，可以通过基于第一和第二同二聚体蛋白的差异的方法实施自 第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或分开异二聚体蛋白。此类方法可以促进第一和第二同 二聚体蛋白彼此分开，且根据方法，还促进同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。基于第一 和第二同二聚体蛋白的差异的此类纯化或分离方法的例子包括但不限于如下的方法，其中 第一或第二同二聚体蛋白不结合蛋白A或蛋白G，或其中第一和第二同二聚体蛋白包含不 同轻链，例如kappa和lambda轻链，或其中第一和第二同二聚体蛋白的Fc区包含不同同种 异型。此类方法可以促进第一或第二同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。在又一个实施 方案中，这可以与等度洗脱的纯化步骤组合。
[0495] 在一个实施方案中，基于第一和第二同二聚体蛋白的差异的此类纯化或分离方法 可以与如上文所述使用过量的第一或第二同二聚体蛋白组合。然后，随后自残留的同二聚 体纯化或分开异二聚体蛋白可以利用第一和第二同二聚体蛋白的差异，因为异二聚体蛋白 与残留的同二聚体差别为包含以限制量使用的同二聚体的Fc区。
[0496] 在一个实施方案中，可以已经将第一或第二同二聚体蛋白工程化改造或修饰为使 得它不结合蛋白A或蛋白G，或蛋白A和G的组合。然后，自第一和第二同二聚体蛋白中至 少一种纯化或分开异二聚体蛋白可以通过将其在蛋白A或蛋白G柱（仅异二聚体蛋白和尚 未在蛋白A或蛋白G结合方面修饰的同二聚体蛋白会与其结合）上通过实施。这促进不结 合蛋白A或蛋白G的同二聚体蛋白与异二聚体蛋白的分开。若第一同二聚体蛋白不结合蛋 白A而第二同二聚体蛋白不结合蛋白G，或反之亦然，则可以将异二聚体蛋白与第一和第二 同二聚体蛋白分开，这通过将包含异二聚体蛋白的组合物在蛋白A和蛋白G材料上通过进 行。第一和第二同二聚体蛋白可以已经修饰为不结合蛋白A和/或蛋白G，如本文中描述 的。这也可以用于分开还原剂与异二聚体蛋白。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组 合。
[0497] 使用步骤a)中已经修饰为使得不结合蛋白A、或蛋白G，或蛋白A和蛋白G的第 一或第二同二聚体蛋白可以特别用于如下的实施方案，其中过量的第一或第二同二聚体蛋 白在步骤a)中相对于另一种同二聚体蛋白使用。在此类实施方案中，可能有用的是工程 化改造或修饰会过量使用的同二聚体蛋白的蛋白A或蛋白G结合位点，使得其结合此类树 脂的能力被破坏。此类修饰包括但不限于CH3域中的修饰，其披露于W02010/151792,通 过提及将其收入本文。如此，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含W02010/151792 中描述的CH3域中的一处或多处修饰，其降低或消除IgG对蛋白A的结合。如此，在一个 具体的实施方案中，本发明的第一或第二同二聚体蛋白可以包含选自下组但不限于此的修 饰：a)435R及b)435R和436F。或者，第一或第二同二聚体蛋白可以包括下列突变：I253A、 H310A、和H435A，其消除对蛋白A的结合。然后，可以通过在蛋白A柱上通过将异二聚体蛋 白与过剩的未交换的同二聚体蛋白分开。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
[0498] 在第一和第二同二聚体蛋白包含轻链的另一个实施方案中，步骤a)中的第一和 第二同二聚体蛋白的轻链可以是不同的。例如，第一同二聚体蛋白可以包含kappa轻链，而 第二同二聚体蛋白可以包含lambda轻链，或反之亦然。适合于仅与kappa或lambda轻链结 合的柱层析的材料或树脂能够结合，然后可以用于自第一和/或第二同二聚体蛋白纯化或 分开异二聚体蛋白。此类材料或树脂的例子包括例如来自GE Healthcare Life Sciences 的称为KappaSelect和LambdaFabSelect的亲和介质。使用包含不同轻链，例如kappa和 lambda轻链的第一和第二同二聚体蛋白可以与步骤a)中过量使用同二聚体蛋白之一组 合。例如，可以用包含kappa轻链的第一同二聚体蛋白和包含lambda轻链的第二同二聚体 蛋白且在第一同二聚体蛋白超过第二同二聚体蛋白存在的情况中，或者就其是否是过量使 用的包含kappa或lambda轻链的同二聚体蛋白而言反之亦然实施步骤a)。然后，步骤c) 可以包括使异二聚体蛋白在仅能够与lambda轻链结合的柱上通过。然后，步骤c)导致异 二聚体蛋白与包含kappa轻链的残留第一同二聚体蛋白分开。类似地，步骤c)可以包括使 异二聚体蛋白在仅与kappa轻链结合的柱上通过，若它是步骤a)中过量使用的包含lambda 轻链的同二聚体。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
[0499] 或者，也可以在不过量使用同二聚体蛋白之一的情况中实施异二聚体蛋白的纯化 或分开，其基于kappa或lambda轻链对不同材料的结合差异。在此实施方案中，在此实施 方案中，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在与kappa轻链结合的材料上，随后在与lambda 轻链上通过，或者反之亦然。由于异二聚体蛋白包含kappa和lambda轻链两者，而第一和 第二同二聚体蛋白包含kappa或lambda轻链，由此可以将异二聚体蛋白与第一和第二同二 聚体蛋白分开。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
[0500] 通过其中第一和第二同二聚体蛋白包含不同轻链（例如kappa和lambda轻链）， 且其中同二聚体蛋白之一过量使用的方法生成的异二聚体蛋白的通过将其在与非过量使 用的同二聚体蛋白的轻链结合的材料上通过的纯化也可以适用于与本发明不同的生成异 二聚体蛋白的方法。例如基于在宿主细胞中共表达重链和轻链的方法或其它方法。
[0501] 在另一个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白的恒定区可以是不同同种异型 的。同种异型是通常在群体内找到的氨基酸序列的变异。例如，人IgGl重链的不同同种异 型是已知的，Glm(f)[又称作 Glm(3) ]、Glm(z)[又称作 Glm(17) ]，Glm(a)[又称作 Glm(l)] and Glm(x)[又称作 Glm(2)] (Jefferis, R.，mAbs2009 ;1:4, 1-7)。如此，在本发明的一 个实施方案中，第一和第二同二聚体蛋白的恒定区可以是不同同种异型；例如它们可以 是IgGl同种型，而第一同二聚体蛋白的恒定区可以是例如IgGlm(za) [ = IgGlm(l, 17)] 或IgGlm(zax) [ = IgGlm(l，2, 17)]同种异型，而第二同二聚体蛋白的恒定区可以是例如 IgGlm(f) [ = IgGlm(3)]或 IgGlm(fa) [ = IgGlm(l，3)]同种异型。类似地，与使用 kappa 和lambda轻链的上文描述的实施方案一样，使用包含不同同种异型的恒定区的第一和第 二同二聚体蛋白可以与步骤a)中过量使用第一或第二同二聚体蛋白组合。在此实施方案 中，步骤c)然后可以包括使异二聚体蛋白在材料，例如用同种异型特异性抗体（与不过量 使用的同二聚体蛋白中存在的同种异型结合）包被的珠上通过。由此，可以自步骤a)中过 量使用的同二聚体蛋白纯化异二聚体蛋白。这可以与如本文中描述的其它纯化方法组合。
[0502] 在一个备选实施方案中，不在步骤a)中调节第一或第二同二聚体蛋白的比率，如 此步骤a)中第一或第二同二聚体蛋白均未完全使用，导致包含异二聚体蛋白、第一和第二 同二聚体蛋白的组合物的生成。在此实施方案中，步骤c)可以包括使异二聚体蛋白在与同 种异型之一结合的材料上，随后在与另一种同种异型结合的另一种材料上通过。这可以与 如本文中描述的其它纯化方法组合。
[0503] 与异二聚体蛋白与同二聚体蛋白的分开组合的包含不同同种异型Fc区的第一和 第二同二聚体蛋白的使用也可以适用于与本发明的方法不同的生成异二聚体蛋白的方法。 此类方法可以进一步包括使用过量的第一或第二同二聚体蛋白。此类方法的例子包括那些 基于在同一宿主细胞中共表达第一和第二同二聚体蛋白的方法。
[0504] C端赖氨酸
[0505] 通过羧肽酶从重链除去C端赖氨酸是抗体在哺乳动物细胞中重组表达后，及人血 清中在体内通常观察到的抗体修饰（Cai等（2010)Biotechnol. Bioeng. Sep9)。除去经常是 部分的，导致具有0(K0)、1(K1)或2(K2)个C端赖氨酸的抗体的混合群体。特别地，B细胞 杂交瘤生成 Κ0、Κ1 和 Κ2 分子的混合物（Dick 等（2008)Biotech. Bioeng. 100:1132)。
[0506] 在一个实施方案中，可以将异二聚体蛋白，例如通过本发明的方法生成的双特异 性抗体的C端赖氨酸除去。术语"C端赖氨酸残基"指CH3区的C端，例如抗体重链的C端 (其是IgGl中的位置447)的赖氨酸残基。
[0507] 除了 C端赖氨酸可以具有的各种效应外，C端赖氨酸的除去生成异二聚体蛋白，例 如包含超过一种异二聚体蛋白分子的组合物或群体，其就C端赖氨酸的存在而言是更同质 的。
[0508] 如此，在又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白不含C端赖氨酸。
[0509] 可以通过将第一和/或第二同二聚体蛋白工程化改造为不含C端赖氨酸，或者通 过从第一和/或第二同二聚体蛋白除去（例如通过酶催化）C端赖氨酸或者通过从异二聚 体蛋白除去（诸如通过酶催化）C端赖氨酸除去C端赖氨酸。
[0510] 因此，在又一个实施方案中，将第一和/或第二同二聚体蛋白遗传修饰为不含C端 赖氨酸（例如在重链中）。
[0511] 在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括例如通过与羧肽酶一起温育例如 从重链除去c端赖氨酸的步骤。
[0512] 若第一和/或第二同二聚体蛋白工程化改造为不含C端赖氨酸，则可以如下生成 第一和/或第二同二聚体蛋白：
[0513] i)提供编码免疫球蛋白的Fc区的核苷酸构建体，所述Fc区包含第一 CH3区和/ 或包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述构建体不编码所述第一和 /或第二CH3区C端的赖氨酸残基，
[0514] ii)在宿主细胞中表达所述核苷酸构建体，和
[0515] iii)从所述宿主细胞的细胞培养物回收所述第一和/或第二同二聚体蛋白。
[0516] 在一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白可以是抗体，其在大多数实施 方案中还可以包含轻链，如此，所述宿主细胞可以进一步表达在相同或不同载体上的轻链 编码构建体。
[0517] 用于制备核苷酸构建体的方法是本领域技术人员公知的。
[0518] 类似地，用于在宿主细胞中表达核苷酸构建体的方法也是本领域技术人员公知 的。
[0519] 在本发明的上述方法的又一个实施方案中，从/基于具有C端赖氨酸残基密码子 的初始重链序列衍生或设计步骤i)中提供的核苷酸构建体。如此，与所述初始重链序列相 t匕，所述核苷酸构建体可以包含C端赖氨酸残基密码子的缺失。
[0520] 在另一个实施方案中，可以从第一和/或第二同二聚体蛋白除去C端赖氨酸残基， 例如通过酶促切割进行。如此，可以在生成第一和/或第二同二聚体蛋白后自其除去C端赖 氨酸。用于酶促除去C端赖氨酸的方法包括但不限于使第一和/或第二同二聚体蛋白经受 与羧肽酶的温育。因此，可以在步骤a)前实施例如从重链除去C端赖氨酸的步骤。如此， 在一个实施方案中，本发明的方法可以包括在步骤a)前使第一和/或第二同二聚体蛋白经 受羧肽酶的进一步步骤。
[0521] 类似地，可以从异二聚体蛋白除去C端赖氨酸。如此，在一个实施方案中，本发 明的方法可以在步骤a)后包括使异二聚体蛋白经受羧肽酶的进一步步骤。此步骤可以 在步骤a)和步骤b)之间或者它可以在步骤b)后。如此，在一个实施方案中，可以在步 骤a)后实施（例如从重链）除去C端赖氨酸的步骤。在另一个实施方案中，可以在步骤 b)后实施（例如从重链）除去C端赖氨酸的步骤。原则上，本发明的方法可以包括使第一 和/或第二同二聚体蛋白和异二聚体蛋白两者经受羧肽酶。然而，对于大多数目的，包括 上文提及的步骤之一应当足以除去C端赖氨酸。合适的羧肽酶的例子包括但不限于羧肽 酶B或羧肽酶N(Cai等Biotechnol.Bioeng.Sep9(2010)见上文）。适合于用羧肽酶处理 的条件是本领域技术人员公知的。除去C端赖氨酸的另一种方法应当是在表达羧肽酶的 宿主细胞中表达第一和/或第二同二聚体蛋白。将第一和/或第二同二聚体蛋白在羧肽 酶有活性的温度留在宿主细胞培养基中达足够的时间量也会导致C端赖氨酸的除去（Luo JL, Ahang J, Ren D, Tsai ff-L, Li F (2102)Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant Monoclonal Antibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically Defined Media. Biotechnol.Bioeng. 109:2306-2315)。
[0522] 核酸序列
[0523] 在又一个方面，本发明还涉及编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的核酸序 列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。第一和第二同二聚体蛋白可以 是与本发明相关的上文描述的任一种第一和第二同二聚体蛋白。
[0524] 在又一方面，本发明还涉及编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的表达载体， 其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
[0525] 在甚至又一个实施方案中，本发明还涉及包含编码本发明的第一或第二同二聚体 蛋白的表达载体的宿主细胞，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
[0526] 在本发明的上下文中，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色 体、和合成核酸载体（包含合适的一组表达控制元件的核酸序列）。此类载体的例子包 括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的 组合的载体、和病毒核酸（RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，核酸序列可以包含在 裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件（如记载于例如Sykes和Johnston, Nat Biotechl7, 355-59(1997))、紧密核酸载体（compacted nucleic acid vector)(如 记载于例如 US 6, 077, 835 和 / 或 WO 00/70087)、质粒载体诸如 pBR322、pUC19/18、 或pUC 118/119、"艨（midge) "最小尺寸核酸载体（如记载于例如Schakowski等，Mol Ther3, 793-800 (2001))、或者作为沉淀的核酸载体构建体，诸如CaP04沉淀的构建体（如 记载于例如 W0 00/46147, Benvenisty and Reshef，PNAS USA 83, 9551-55 (1986)，Wigler 等，Cell 14,725(1978)，及 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7,603(1981)), 所述核酸序列编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的Fc区，其中所述第一或第二同二 聚体蛋白不包含C端赖氨酸。此类核酸载体及其用法是本领域中公知的（参见例如US 5, 589, 466 和 US 5, 973, 972)。
[0527] 在一个实施方案中，载体适合于在细菌细胞中表达。此类载体的例子包括表达 载体，诸如 BlueScript(Stratagene)、pIN 载体（Van Heeke 和 Schuster, J Biol Chem 264. 5503-5509 (1989)、pET 载体（Novagen, Madison WI)等）。
[0528] 表达载体也可以或备选是适合于在酵母系统中表达的载体。可以采用适合于在酵 母系统中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成性或诱导型启动子，诸如alpha 因子、醇氧化酶和PGH的载体（综述见：F.Ausubel等编Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987),及 Grant 等，Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)) 〇
[0529] 表达载体也可以或备选是适合于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如包含谷氨酰 胺合成酶作为选择标志物的载体，诸如Bebbington(1992)Biotechnology(NY) 10:169-175 中描述的载体。
[0530] 核酸和/或载体也可以包含编码分泌/定位序列（其可以将多肽，诸如新生多肽 链靶向至周质空间或靶向入细胞培养基中）的核酸序列。此类序列是本领域中已知的，并 且包括分泌前导或信号肽。
[0531] 在本发明的表达载体中，核酸序列可以包含任何合适的启动子、增强子、和其它表 达促进元件或者与任何合适的启动子、增强子、和其它表达促进元件联合，所述核酸序列编 码本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖 氨酸。此类元件的例子包括强表达启动子（例如人CMV IE启动子/增强子及RSV、SV40、 SL3-3、MMTV、和HIV LTR启动子）、有效的多聚（A)终止序列、大肠杆菌（E.coli)中的质粒 产物的复制起点、抗生素抗性基因如选择标志物、和/或方便的克隆位点（例如多接头）。 核酸还可以包含诱导型启动子，其与组成性启动子诸如CMV IE形成对比。
[0532] 在一个实施方案中，可以经由病毒载体将表达载体定位于和/或投递至宿主细胞 或宿主动物。
[0533] 在甚至又一个方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，诸如转染瘤 (transfectoma)，其生成本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚 体蛋白不包含C端赖氨酸，如本文中定义的。宿主细胞的例子包括酵母、细菌和哺乳动物细 胞，诸如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含稳定整合到细胞基 因组中的核酸的细胞，所述核酸包含编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白Fc区的表达 的序列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。在另一个实施方案中，本发 明提供包含非整合型核酸的细胞，所述非整合型核酸诸如质粒、粘粒、噬菌粒、或线性表达 元件，其包含编码本发明第一或第二同二聚体蛋白表达的序列，其中所述第一或第二同二 聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
[0534] 在又一个方面，本发明涉及杂交瘤，其生成本发明的第一或第二同二聚体蛋白，其 中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。在甚至又一个方面，本发明涉及转基 因非人动物或植物，其包含编码本发明的第一或第二同二聚体蛋白的核酸，其中所述第一 或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸，其中所述动物或植物生成本发明的第一或第二同 二聚体蛋白，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不包含C端赖氨酸。
[0535] 异二聚体蛋白
[0536] 本发明还涉及通过本发明的方法获得的异二聚体蛋白。
[0537] 本发明的方法能够形成不对称分子，在每条Fab臂或者每个CH3域上具有不同特 征的分子或者在整个分子内具有不同修饰的分子，例如具有用于缀合的非天然氨基酸取代 的分子。此类不对称分子可以任何合适的组合产生。这在下文通过一些非限制性例子进一 步说明。
[0538] 双特异性抗体可用于将成像或免疫治疗剂投递至感兴趣的靶细胞，包括但不限于 肿瘤细胞。
[0539] 在本发明方法的一个实施方案中，双特异性分子的第一 Fab臂结合肿瘤细胞，诸 如肿瘤细胞表面蛋白或者肿瘤细胞表面的糖，诸如本文列出的肿瘤细胞表面蛋白中的一 种，而第二Fab臂识别放射活性效应分子，包括但不限于与肽或半抗原偶联或连接（经由 螯合剂）的放射性标记物。此类放射性标记肽的例子是铟标记的二乙烯三胺五乙酸（抗 DTPA(In)van Schaijk 等 Clin. Cancer Res. 2005 ;ll:7230s-7126s)。另一种例子是使用 携带放射性核素诸如例如锝-99的半抗原标记的胶粒诸如脂质体、聚合物胶束的纳米颗粒 (Jestin 等Q J Nucl Med Mol Imaging2007 ;51:51-60)。
[0540] 在另一个实施方案中，使用半抗原偶联的备选细胞抑制分子诸如毒素作为由第二 Fab臂识别的效应分子。
[0541] 在本发明方法的又一个实施方案中，将双特异性分子的第一 Fab臂在N297位置 (EU编号）糖基化，并将双特异性分子的第二Fab臂无糖基化（aglycosylated)(非糖基化， 例如通过将 N297 突变为 Q 或 A 或 E 突变（Bolt S 等，Eur J Immunol 1993, 23:403-411))。 在Fc区的不对称糖基化影响与Fc γ -受体的相互作用，并且影响抗体的抗体依赖性细胞的 细胞毒性效应（Ha等，Glyc〇bi〇l 〇gy2011，21 (8) : 1087-1096)以及与其它效应器功能分子 诸如Clq的相互作用。
[0542] 在本发明方法的另一个实施方案中，双特异性分子的第一 Fab臂与FcRn(新生儿 Fe 受体）相互作用（Roopenian DC,等 Nat. Rev.Immunol. 2007,7:715-725)，并且通过使 分子上FcRn相互作用位点突变例如通过产生H435A突变来妨碍第二Fab臂与FcRn结合 (Shields，R.L.等，J Biol Chem，2001，Firan，M.等，Int Immunol，2001)。
[0543] 在另一个实施方案中，在双特异性分子的两条Fab臂中的一条上改善或减少与 Clq的结合。
[0544] 在另一个实施方案中，已将蛋白质工程化改造为在分子的两条Fab臂中的一条或 两条上增强补体活化。
[0545] 在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂从不同的IgG亚类衍 生。
[0546] 在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂携带不同的同种异型 突变（Jefferis 和 Lefranc, 2009, MABsl: 332-8)。
[0547] 在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过用免疫活性、免疫刺激性 或免疫抑制性细胞因子置换双特异性分子的一条Fab臂的Fab产生。此类细胞因子的非 限制性例子是 IL-2、IFN- a、IFN- β、IFN- γ、TNF- a、G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6、 IL-13。或者，在分子中包括（生长）因子或激素刺激剂或抑制剂。
[0548] 在另一个实施方案中，一条Fab臂的Fab被裂解肽置换，裂解肽即能够裂解肿 瘤细胞、细菌、真菌等的肽，包括但不限于抗微生物肽如爪蟾抗菌肽（magainin)、蜂毒肽 (mellitin)、杀菌肤（cecropin)、KLAKKLAK 及其变体（Schweizer 等 Eur. J. Pharmacology 2009 ;625:190-194, Javadpour，J. Med. Chem.，1996, 39:3107 - 3113, Marks 等，Cancer Res2005 ;65:2373-2377, Rege等，Cancer Res. 2007 ;67:6368-6375)或阳离子裂解肽（CLYP 技术，US2009/0269341)。
[0549] 在另一个实施方案中，Fab臂上的Fab中之一或两者被细胞因子和/或生长因子 的受体置换，产生所谓的诱饵受体，其中靶向TNF-α的Enbrel? (依那西普）和靶向VEGF 的VEGF-trap是众所周知的例子。将这两种诱饵受体组合成一个分子显示优于单一诱饵受 体的活性（Jung, J. Biol. Chem. 2011 ;286:14410-14418)。
[0550] 在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过将免疫活性细胞因 子、免疫刺激性细胞因子或免疫抑制性细胞因子与存在于双特异性分子中的Fab臂中 的一条或两条的N-端或C-端融合而产生。这可对双特异性分子的抗肿瘤活性产生 积极影响。此类分子的例子是（但不限于下文列表）IL-2 (Fournier等，2011，Int. J. Oncology, doi: 10. 3892/i jo. 2011. 976)、IFN-a、IFN-P 或 IFN-Y(Huan 等，2007; J. Immunol. 179:6881-6888, Rossie 等，2009 ;Bloodll4:3864-3871)、TNF-a。或者，细胞因 子比如例如G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-4、IL-6或IL-13的N-端或C-端融合可积极地影响 双特异性抗体分子效应器功能。或者将生长因子或激素刺激剂或抑制剂在N-端或C-端包 括在分子中。
[0551] 在另一个实施方案中，裂解肽比如例如抗微生物肽如爪蟾抗菌肽、蜂 毒肤、杀菌肤、KLAKKLAK 及其变体（Schweizer 等 Eur. J. Pharmacology 2009 ; 625:190-194, Javadpour，J. Med. Chem.，1996, 39:3107 - 3113, Marks 等，Cancer Res 2005 ; 65:2373-2377, Rege 等，Cancer Res. 2007 ;67:6368-6375)或阳离子裂解肽（CLYP 技术， US2009/0269341)在一条或两条Fab臂上的N-端或C-端融合可增强分子的活性。
[0552] 在另一个实施方案中，另一类别的不对称免疫治疗分子是单价抗体，该分子以一 条Fab臂与选择的靶标相互作用。在此类分子中，存在于双特异性分子中的一条Fab臂针 对选择的祀分子，分子的第二条Fab臂不携带Fab或者具有非结合/非功能性Fab比如对 MetMab所述的（Genentech ;W0 96/38557)。或者，可产生单体的Fc融合蛋白诸如对因子 VIII 和 IX 所述的那些（Peters 等，Blood2010 ;115:2057-2064)。
[0553] 或者，可通过本发明方法产生任何上述不对称分子的组合。
[0554] 通过本发明的方法生成的异二聚体蛋白可以含有包含第一免疫球蛋白的Fc区的 第一多肽和包含第二免疫球蛋白的Fc区的第二多肽，所述第一 Fc区包含第一 CH3区，所述 第二Fc区包含第二CH3区，其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第 一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互 作用，且
[0555] 其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸， 且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366, 368, 370, 399,405和 407,
[0556] 和 / 或
[0557] 其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每 个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0. 01-10微摩尔，诸如0. 05-10微摩尔，更优选 0. 01-5,诸如0. 05-5微摩尔，甚至更优选0. 01-1微摩尔，诸如0. 05-1微摩尔，0. 01-0. 5或 0· 01-0. 1。
[0558] 在一个实施方案中，所述第一 CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨 基酸，且所述第二CH3区具有位置405处与Phe不同的氨基酸，
[0559] 和 / 或
[0560] 所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个 CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0. 01-10微摩尔，诸如0. 05-10微摩尔，更优选 0. 01-5,诸如0. 05-5微摩尔，甚至更优选0. 01-1微摩尔，诸如0. 05-1微摩尔，0. 01-0. 5或 0· 01-0. 1。
[0561] 在异二聚体蛋白的又一个实施方案中，
[0562] 所述第一 CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3 区具有位置405处与Phe不同的氨基酸，诸如位置405处与Phe、Arg或Gly不同的氨基酸，
[0563] 或
[0564] 所述第一 CH3区具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3 区具有位置407处与Tyr，Asp, Glu，Phe, Lys，Gin, Arg，Ser或Thr不同的氨基酸。
[0565] 在其它实施方案中，依照本发明的异二聚体蛋白包含上文关于生产方法描述的任 何其它特征。
[0566] 如此，在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽是抗体（优选 人抗体）的全长重链。
[0567] 在本发明异二聚体蛋白的另一个实施方案中，所述第二多肽是抗体（优选人抗 体）的全长重链。
[0568] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和第二多肽都是两种抗体 (优选结合不同表位的两种人抗体）的全长重链，因此所得异二聚体蛋白是双特异性抗体。 这种双特异性抗体可以是重链抗体，或者是除了重链以外还包含两条全长轻链（其可相同 或不同）的抗体。
[0569] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，第一多肽的Fc区与源自选自下组 的同种型的Fc区相似或相同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(除了规定突变以外），且第二多肽 的Fc区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的（除了规定突变以外）。
[0570] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置405处的 Phe和位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置405处与 Phe不同的氨基酸和位置409处的Lys。
[0571] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置405处的 Phe和位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置405处的 Leu和位置409处的Lys。
[0572] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置405处的 Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
[0573] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置409处与 Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处 的lie和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
[0574] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置409处的 Arg，且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的lie和位置405处的 Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
[0575] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置350处的 Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位 置409处的Lys和：a)位置350处的lie和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和 位置405处的Leu。
[0576] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含位置350处的 Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，且所述第二CH3区包含位 置350处的lie、位置370处的Thr、位置405处的Leu和位置409处的Lys。
[0577] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和所述第二多肽在铰链区 中都不包含Cys-Pr〇-Ser_Cys序列。
[0578] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和所述第二多肽在铰链区 中都包含Cys_Pr〇-Pr〇-Cys序列。
[0579] 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽 包含除去用于Asn-连接的糖基化的受体位点的突变。
[0580] 靶抗原
[0581] 如上文所解释的，在本发明的一个重要实施方案中，异二聚体蛋白是包含两个在 结合特异性（即结合不同表位）上不同的可变区的双特异性抗体。
[0582] 原则上，任何特异性组合都是可能的。如上文提到，双特异性抗体可以潜在用于进 一步提高单克隆抗体疗法的效力和功效。单特异性抗体一种可能的局限性是缺乏对期望的 靶细胞的特异性，这是因为靶抗原表达在对其不期望抗体结合的其它细胞类型上。例如，在 肿瘤细胞上过表达的靶抗原也可在健康组织中表达，这可导致在用针对该抗原的抗体治疗 后产生不期望的副作用。对只在靶细胞类型上表达的蛋白具有进一步特异性的双特异性抗 体可以潜在改善与肿瘤细胞的特异性结合。
[0583] 因此，在一个实施方案中，同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体和第二抗体结合 同一肿瘤细胞上的不同表位。
[0584] 在另一个实施方案中，同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体结合肿瘤细胞上的 表位，而另一种抗体是对于意图的应用没有任何相关体内结合活性的无关或无活性抗体。
[0585] 如此，在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二表位位于同一细胞，例如肿 瘤细胞上。肿瘤细胞上的合适靶物包括但不限于下列各项：erbBl(EGFR)、erbB2(HER2)、 erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-包膜蛋白、骨膜蛋 白（periostin)、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFRvIII、Ll-CAM、AXL、组织因子（TF)、 CD74、EpCAM和MRP3。肿瘤细胞靶物的可能组合包括但不限于：erbB 1+erbB2、erbB2+erbB3、 erbBl+erbB3、CD19+CD20、CD38+CD34、CD4+CXCR5、CD38+RANKL、CD38+CXCR4、CD20+CXCR4、 CD20+CCR7、CD20+CXCR5、CD20+RANKL、erbB2+AXL、erbBl+cMet、erbB2+c-Met、erbB2+EpCAM、 c-Met+AXL、c-Met+TF、CD38+CD20、CD38+CD138。
[0586] 在又一个实施方案中，所述第一和第二表位可位于同一祀抗原上，其中两个表位 在靶抗原上的位置使得抗体与一个表位的结合不干扰抗体与另一表位的结合。在本文 又一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是结合位于同一靶抗原上两个不同表 位，但对于靶细胞例如肿瘤细胞具有不同的杀伤作用模式的抗体。例如，在一个实施方案 中，祀抗原是erbB2 (HER2)，且双特异性抗体组合培妥珠单抗（pertuzumab)和曲妥珠单抗 (trastuzumab)抗原结合位点。在另一个实施方案中，祀抗原是erbBl(EGFr)，且双特异性 抗体组合扎鲁木单抗（zalutumumab)和尼妥珠单抗（nimotuzumab)抗原结合位点。
[0587] 双特异性抗体还可作为介质用于将效应机制再靶向疾病相关组织，例如肿瘤。因 此，在又一个实施方案中，所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞诸如肿瘤细胞蛋白 或肿瘤细胞糖上，而另一表位位于效应细胞上。
[0588] 在一个实施方案中，效应细胞是T细胞。
[0589] 效应细胞上的可能靶标包括下列各项：Fc γ RI (⑶64):在单核细胞和巨噬细胞和 活化的嗜中性粒细胞上表达；FcyRIII (⑶16):在自然杀伤细胞和巨噬细胞上表达；⑶3 : 在循环T细胞上表达；CD89 :在PMN(多形核嗜中性粒细胞）、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨 噬细胞上表达；⑶32a :在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞上表达；在嗜碱性粒细胞 和肥大细胞上表达的Fc ε RI。在一个实施方案中表位位于在T细胞上表达的⑶3。
[0590] 在另一个实施方案中，第一抗体对病原性微生物具有结合特异性，而第二抗体对 效应细胞蛋白（诸如 CD3, CD4, CD8, CD40, CD25, CD28, CD16, CD89, CD32, CD64, Fc ε RI 或 CD 1)具有结合特异性。
[0591] 此外，双特异性抗体可用于使化疗剂更特异性地靶向该化疗剂应对其发挥作用的 细胞。因此，在一个实施方案中，同二聚体蛋白中的一种是识别小分子或肽的抗体，或者能 够例如根据描述于Rader等，（2003) PNAS 100:5396的原理与此类分子形成共价键。在本 发明方法的又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞表面蛋白（诸如erbBl， erbB2, erbB3, erbB4, EGFR3vIII，CEA，MUC-1，CD19, CD20, CD4, CD38, EpCAM，c-Met，AXL， Ll-CAM，组织因子，CD74或CXCR5)具有结合特异性（即结合所述肿瘤细胞或肿瘤细胞表面 蛋白上的表位），而第二抗体对可以任选与肽或半抗原偶联或连接的化疗剂诸如毒素（包 括放射性标记肽）、放射性同位素、药物或前药具有结合特异性。
[0592] 双特异性抗体还可用于靶向囊泡，如电子致密囊泡，或者含有针对肿瘤的毒素、药 物或前药的小细胞。参见例如MacDiarmid等（2009)Nature Biotech27:643。小细胞是非 染色体细胞，其是不含有染色体DNA的异常细胞分裂产物。因此，在另一个实施方案中，所 述第一或所述第二表位位于肿瘤细胞，诸如肿瘤细胞蛋白或肿瘤细胞糖上，而另一表位位 于电子致密囊泡或小细胞上。
[0593] 另外，通过将对血清蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可改变抗体的血清 半衰期。例如，通过将对血清白蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可延长血清半 衰期。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白诸如 erbBl(EGFR)， erbB2(HER2)， erbB3, erbB4, MUC-1， CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5， c-Met，HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白、Bigh3, SPARC，BCR，CD79, CD37, EGFRvIII，Ll-CAM，AXL， 组织因子（TF)，⑶74, EpCAM或MRP3, CEA具有结合特异性，而第二抗体对血液蛋白诸如血 清白蛋白具有结合特异性。第二结合特异性还可用于使抗体靶向特定组织，诸如中枢神经 系统或脑（跨越血脑屏障）。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对脑特异 性靶标具有结合特异性，脑特异性靶标诸如淀粉样蛋白-β (例如用于治疗阿尔茨海默病 (Alzheimer' s disease))、Her_2(例如用于治疗乳腺癌脑转移）、EGFR(例如用于治疗原 发性脑癌）、Nogo A (例如用于治疗脑损伤）、TRAIL (例如用于治疗HIV)、alpha-突触核蛋 白（synuclein)(例如用于治疗帕金森病）、Htt (例如用于治疗亨廷顿病（Huntington))、 朊病毒（例如用于治疗疯牛病）、西尼罗病毒蛋白；第二抗体对血脑屏障蛋白具有结合特异 性，血脑屏障蛋白诸如转铁蛋白受体（TfR)、胰岛素受体、黑素转铁蛋白受体（MTfR)、乳铁 蛋白受体（LfR)、载脂蛋白E受体2 (Ap〇ER2)、LDL受体相关蛋白1和2 (LRP1和LRP2)、高级 糖基化终产物的受体（RAGE)、白喉毒素受体=肝素结合表皮生长因子样生长因子（DTR = HB-EGF)、gpl90 (Abbott 等，Neurobiology of Disease37 (2010) 13-25)。
[0594] 对血脑屏障蛋白的结合特异性还可用于使另一种非抗体分子靶向特定组织，诸 如中枢神经系统或脑（跨越血脑屏障）。因此，在又一个实施方案中，同二聚体蛋白之一 是对血脑屏障蛋白（诸如TfR，胰岛素受体，MTfR，LfR，ApoER2, LRP1，LRP2, RAGE，DTR(= HB-EGF)或gpl90)具有结合特异性的全长抗体，而另一种同二聚体蛋白是在N-或C-端 连接另一种蛋白的Fc区，所述另一种蛋白诸如细胞因子、可溶性受体或者其它蛋白，如 VIP(血管活性肠肽）、BDNF(脑衍生的神经营养因子）、FGF(成纤维细胞生长因子）、多种 FGF、EGF(表皮生长因子）、PNA(肽核酸）、NGF(神经生长因子）、神经营养蛋白（NT)-3、 NT-4/5、胶质细胞衍生的神经营养因子、睫状神经营养因子、神养蛋白（neurturin)、神经 调节蛋白、白介素、转化生长因子（TGF)-a、TGF-β、促红细胞生成素、肝细胞生长因子、血 小板衍生的生长因子、artemin、persephin、导蛋白、心肌营养蛋白-1、干细胞因子、中期 因子、多效营养因子、骨形态发生蛋白、脑信号蛋白、脑信号蛋白（semaphorin)、白细胞抑 制因子、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰基-半乳糖胺-6-硫酸 酯酶、芳香基硫酸酯酶Β、酸性α-葡萄糖苷酶或者鞘憐脂酶（Pardridge，靶向脑的生物 药物（Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting 2010, 1-11 ;Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry2008, 19:1327-1338)
[0595] 在本发明方法的又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白诸如 erbBl，erbB2, erbB3, erbB4，MUC-l，CD19, CD20, CD4 或 CXCR5 具有结合特异性，而第二抗体 对参与凝血的蛋白诸如组织因子具有结合特异性。
[0596] 其它特别引入关注的结合特异性组合包括：⑶3+HER2,⑶3+⑶20, IL-12+IL18， IL-la+IL-lb， VEGF+EGFR， EpCAM+CD3, GD2+CD3, GD3+CD3, HER2+CD64, EGFR+CD64， CD30+CD16, NG2+CD28, HER2+HER3, CD20+CD28, HER2+CD16, Bcl2+CD3, CD19+CD3, CEA+CD3, EGFR+CD3, IgE+CD3, EphA2+CD3, CD33+CD3, MCSP+CD3, PSMA+CD3, TF+CD3, CD19+CD16， CD19+CD16a, CD30+CD16a, CEA+HSG, CD20+HSG, MUC1+HSG, CD20+CD22, HLA-DR+CD79， PDGFR+VEGF，IL17a+IL23, CD32b+CD25，CD20+CD38，HER2+AXL，CD89+HLA II 类，CD38+CD138， TF+c-Met，Her2+EpCAM，HER2+HER2, EGFR+EGFR，EGFR+c-Met，c-Met+ 非结合臂以及 G-蛋白 偶联受体的组合。
[0597] 在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗体可基本按照Taylor等 J. Immunol. 158:842-850(1997)及 Taylor 和 Ferguson, J. Hematother. 4:357-362, 1995 所 述，通过靶向红细胞而用于清除病原体、病原性自身抗体或者有害化合物诸如来自循环的 毒液和毒素。所述第一表位位于红细胞（红血球）蛋白（包括但不限于红细胞补体受体1) 上，所述第二表位位于待靶定清除的化合物或生物体上。
[0598] 在又一个实施方案中，第二Fab臂包含代表自身抗原或者连接自身抗原的缀合位 点诸如dsDNA的融合蛋白。因此通过本发明的双特异性抗体靶向病原体、自身抗体或有害 化合物以及接着的红细胞介导的清除，可在各种疾病和综合征的治疗中具有治疗效用。
[0599] 缀合
[0600] 在本发明的其它实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至选自下列的化 合物：毒素（包括放射性同位素）、前药或药物。此类化合物可例如在癌症疗法中更有效地 杀伤靶细胞。因此所得异二聚体蛋白是免疫缀合物。或者化合物可与所得异二聚体蛋白偶 联，即在已发生Fab臂交换之后。
[0601] 因此，在又一个实施方案中，本发明的方法进一步包括将第一和/或第二同二聚 体蛋白与另一种化合物；例如毒素、前药或药物连接或缀合的步骤。
[0602] 或者，本发明的方法进一步包括将异二聚体蛋白与另一种化合物；例如毒素、前药 或药物连接或缀合的步骤。
[0603] 如本文中别处描述的，可以将第一和第二同二聚体蛋白与不同化合物缀合，由此 导致生成与两种不同化合物（例如毒素、前药和/或药物）缀合的异二聚体蛋白。若用于缀 合第一化合物的方法与用于缀合第二化合物的方法不相容，则这可以是特别有用的。例如， 不同化合物可以是两种不同毒素，或两种不同前药，或两种不同药物，或者一种化合物可以 是毒素，而另一种是前药或药物，或一种化合物可以是前药，而另一种是药物。可以使用任 何合适的组合。
[0604] 或者，本发明的方法包括使用还原-氧化组合异二聚体蛋白的形成与毒素的缀 合。
[0605] 用于形成本发明免疫缀合物的合适化合物包括泰素（taxol)、细胞松弛素 B(cytochalasin B)、短杆菌肤 D(gramicidin D)、溴化乙淀（ethidium bromide)、依米 丁（emetine)、丝裂霉素（mitomycin)、依托泊苷（etoposide)、tenoposide、长春新碱 (vincristine)、长春喊（vinblastine)、秋水仙素（colchicin)、多柔比星（doxorubicin)、 柔红霉素（daunorubicin)、二轻基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽 醌（mitoxantrone)、光神霉素（mithramycin)、放线菌素 D(actinomycin D)、l_ 去氢睾酮 (l-dehydrotestosterone)、糖皮质激素（glucocorticoids)、普鲁卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普蔡洛尔（propranolol)和噪罗霉素（puromycin)、 抗代谢药（例如甲氨蝶呤、6-巯基噪呤、6-硫鸟噪呤、阿糖胞苷、氟达拉滨（fludarabin)、 5-氟尿啼陡、氨烯咪胺（decarbazine)、轻基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨（gemcitabine)、 克拉屈滨（cladribine))、烧化剂（例如氮芥（mechlorethamine)、噻替派（thioepa)、 苯丁酸氣芥（chlorambucil)、美法仑（melphalan)、卡莫司汀（carmustine，BSNU)、洛莫 司汀（lomustine，CCNU)、环憐醜胺（cyclophosphamide)、白消安（busulfan)、二溴甘露 醇（dibromomannitol)、链唑菌素（streptozotocin)、达卡巴嗪（dacarbazine, DTIC)、 丙卡巴肼（procarbazine)、丝裂霉素 C(mitomycin C)、顺钼（cisplatin)和其它钼 衍生物，诸如卡钼（carboplatin))、抗生素（例如放线菌素 D (dactinomycin)(旧称 放线菌素（actinomycin))、博来霉素（bleomycin)、柔红霉素（daunorubicin)(旧称 道诺霉素（daunomycin))、多柔比星（doxorubicin)、伊达比星（idarubicin)、光神 霉素（mithramycin)、丝裂霉素（mitomycin)、米托蒽醌（mitoxantrone)、普卡霉素 (plicamycin)、安曲霉素（anthramycin，AMC))、白喉毒素和相关分子（例如白喉A链和其 活性片段和杂合分子）、蓖麻毒蛋白毒素（例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化蓖麻毒蛋白A链 毒素）、霍乱毒素、志贺样毒素（SLT-I, SLT-II, SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百 日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属（Pseudomonas)外毒 素、alorin、肥阜草蛋白（saporin)、蒴莲根毒素（modeccin)、gelanin、相思豆毒蛋白A链、 蒴莲根毒素 A链、α-帚曲霉素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹素 (dianthin)蛋白、美洲商陆（Phytolacca americana)蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜 (momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白（curcin)、巴豆毒蛋白、肥阜草（sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素（gelonin)、mitogellin、局限曲菌素（restrictocin)、酚 霉素（phenomycin)和依诺霉素（enomycin)毒素。其它合适的缀合分子包括核糖核酸酶 (RNA酶）、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌内毒素、 美登木素生物喊、Auristatins(MMAE,MMAF)、刺抱霉素（Calicheamicins)和 Duocarmycin 类似物（Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21:5-13)、Dolostatin_10、 Dolostatin-15、伊立替康（Irinotecan)或其活性代谢物SN38、吡咯并苯并二氮杂（PBD)。 [0606] 在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至α发射体，包 括但不限于钍-227、镭-223、铋-212和锕-225。
[0607] 在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至β发射放射性 核素，包括但不限于碘-313、钇-90、氟-18、铼-186、镓-68、锝-99、铟-111和镥-177。
[0608] 在另一个实施方案中，待缀合化合物包括核酸或核酸相关分子。在本发明一个这 样的方面，缀合的核酸是细胞毒性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性RNA分子（如siRNA分子） 或免疫刺激性核酸（如免疫刺激性含CpG基序的DNA分子）。
[0609] 可采用本领域已知用于缀合的任何方法，包括Hunter等，Nature 144, 945 (1962), David 等，Biochemistry 13., 1014 (1974), Pain 等，J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)及 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)描述的方法。可 通过使其它部分与蛋白的N-端侧C-端侧在化学上缀合制备缀合物（参见例如Antibody Engineering Handbook, Osamu Kanemitsu 编，Chijin Shokan(1994)出版）。在适当的情 况下，还可通过在内部残基或糖处缀合产生此类缀合的抗体衍生物。药剂可直接或间接与 本发明的蛋白偶联。第二药剂的间接偶联的一个例子是通过间隔物部分偶联。用于药物缀 合物的连接技术最近已概括于 Ducry and Stump (2010) Bioconjugate Chem. 21: 5。
[0610] 鉬合物和用涂
[0611] 通过本发明的方法生成的异二聚体蛋白可以在具有药学可接受载体的药物组合 物中使用。
[0612] 可按照常规技术配制药物组合物，所述常规技术例如公开于下述文献中的常规 技术：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 编，Mack Publishing Co.，Easton, PA, 1995。本发明的药物组合物可包含例如稀释剂、填充剂、盐、缓 冲剂、去污剂（例如非离子型去污剂，例如Tween-20或Tween-80)、稳定剂（例如不含糖或 蛋白质的氨基酸）、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适于纳入药物组合物中的其它物质。
[0613] 药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任何和所有合适的 溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延缓剂等。可用 于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、乙 醇、右旋糖、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇）。药学可接受载体包括无菌水性溶液剂 或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。可通过例如使用包衣材 料（例如卵磷脂）、在分散剂的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂，来保持适 当的流动性。
[0614] 本发明的药物组合物还可包含药学可接受抗氧化剂，例如（1)水溶性抗氧化剂， 例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂， 诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α -生育酚等； 和（3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0615] 本发明的药物组合物还可在组合物中包含等张剂，诸如糖、多元醇，诸如甘露醇、 山梨糖醇、甘油或氯化钠。
[0616] 本发明的药物组合物还可含有适于所选给药途径的可提高药物组合物的保存期 限或有效性的一种或多种辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂。 可将本发明的化合物与可防止化合物快速释放的载体一起制备，诸如受控释放配制剂，包 括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。这类载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸 甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物诸如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸 酯和单独的或与蜡一起的聚乳酸，或者本领域众所周知的其它物质。用于制备这类配制剂 的方法一般为本领域技术人员所知。
[0617] 可根据需要通过将所需量的活性化合物与例如上文列举的一种成分或成分的组 合一起掺入适当溶剂中，接着灭菌微量过滤，来制备无菌注射用溶液剂。
[0618] 药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定患者、组合 物和给药方式有效实现所需治疗反应而又对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将 取决于多个药动学因素，包括所用的本发明具体组合物的活性、给药途径、给药时间、所用 具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用具体组合物联用的其它药物、化合物和/或物 质、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等医学领域众所周知的 因素。
[0619] 可通过任何合适的途径和方式施用药物组合物。在一个实施方案中，胃肠外施用 本发明的药物组合物。本文所用"胃肠外施用"意指非肠内和局部给药的施用方式，通常通 过注射施用，包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、腱 内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注 射和输注。
[0620] 在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注施用药物组合物。
[0621] 在一个主要方面，本发明涉及用作药物的依照本发明的异二聚体蛋白诸如本发明 的双特异性抗体。本发明的异二聚体蛋白可用于多种目的。具体来讲，如上文解释的，本发 明的异二聚体蛋白可用于治疗各种形式的癌症，包括转移癌和难治性癌。
[0622] 因此，一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖和/或杀伤肿瘤细胞的 方法，其包括对有需要的个体施用如本文描述的本发明异二聚体蛋白。
[0623] 在另一个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白用于治疗免疫疾病和自身免疫疾 病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病、CNS和肌肉骨骼疾病。
[0624] 调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应（例如治疗反 应）。例如，可施用单次推注，可随时间施用若干分剂量，或可按治疗情况危急程度所示，按 比例减少或增加剂量。
[0625] 异二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，并且可由本 领域技术人员决定。本发明双特异性抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约 0· l-100mg/kg，诸如约 0· l-50mg/kg，例如约 0· l-20mg/kg，诸如约 0· l-10mg/kg，例如约 0. 5,约诸如0. 3,约1、约3、约5或者约8mg/kg 〇
[0626] 具有本领域普通技能的医生或兽医可容易决定和规定有效量的所需药物组合物。 例如，医生或兽医可以以低于达到所需治疗效果需要的水平开始给予用于药物组合物中的 异二聚体蛋白的剂量，逐渐增加剂量直到达到所需效果。一般而言，本发明组合物的合适剂 量会是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用可以是例如胃肠外，例如静脉内、 肌内或皮下。
[0627] 本发明的异二聚体蛋白还可预防性给药以减小发生疾病诸如癌症的危险，在疾病 进展中延迟事件出现的发作，和/或当疾病诸如癌症缓解时减小复发的危险。
[0628] 本发明的异二聚体蛋白诸如双特异性抗体还可在组合疗法中给药，即与其它与待 治疗疾病或状况有关的治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含异二聚体蛋白的药物与一 种或多种其它治疗剂诸如细胞毒剂、化疗剂或抗血管生成剂组合。此类组合给药可以同时、 单独或序贯给予。在又一个实施方案中，本发明提供治疗疾病诸如癌症的方法，该方法包括 对有需要的受试者施用治疗有效量的与放射疗法和/或手术组合的异二聚体蛋白，诸如本 发明的双特异性抗体。
[0629] 本发明的异二聚体蛋白诸如双特异性抗体还可用于诊断目的。 实施例
[0630] 实施例1 :用于表达人IgGl_2F8和IgGl_7D8的表达载体
[0631] 将 HuMab 2F8 (TO 02/100348)和 HuMab 7D8 (TO 04/035607)的 VH 和 VL 编码 区克隆在表达载体pConGlf(含有人IgGlm(f)同种异型恒定区的基因组序列（Lonza Biologies))中用于制备人IgGl重链及克隆在pConKappa(含有人κ轻链恒定区，Lonza Biologies)中用于制备κ轻链。对于IgG4抗体，将VH区插入pTomG4载体（含有在 PEE12. 4载体（Lonza Biologies)中的人IgG4恒定区的基因组序列）中。或者，在随后 的构建体中，使用含有在PEE12. 4载体中的重链（IgGl或IgG4)的完全密码子优化编码区 或者在ρΕΕ6·4载体（Lonza Biologies)中的HuMab 2F8或HuMab 7D8的人κ轻链的载 体。此外，将HuMab-2F8的密码子优化的VH编码区以及含有F405L突变的人IgGlm(za)同 种异型恒定区的密码子优化的序列在pcDNA3. 3载体（Invitrogen)中克隆，产生表达载体 p33Glza-2F8-F405L。
[0632] 实施例2 :用于表达铰链缺失的IgGl_2F8和含有特定突变的人IgGl和IgG4 CH2-CH3片段的表达载体
[0633] 为了在抗体重链的铰链和CH3区中引入突变，根据制造商的推荐使用 Quickchange定向诱变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA)。或者，完全合成构建体或将VH 区在已含有编码取代的特定氨基酸的载体中克隆。
[0634] 通过PCR或者合成构建完全密码子优化的编码CH2和CH3片段的构建体。这些构 建体具有N-端信号肽和6个氨基酸的His标签，含有人IgGl/4恒定区的341-447位氨基 酸。将构建体在PEE12. 4中克隆。
[0635] 为了构建铰链缺失的IgGl (Uni-Gl)分子，制备编码具有EGFR特异性的人IgGl同 种型的Uni-Gl形式的合成DNA构建体。在该构建体中，将天然铰链区（如由铰链外显子所 限定的）缺失。在IgGl构建体中在158位产生额外的Ser至Cys突变以补救此同种型中 HC和LC链之间的Cys键。下文显示了蛋白序列（SEQ ID N0:4)。将构建体插入到pEE6.4 载体中，称为PHG1-2F8。
[0636] QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYY ⑶ SVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0637] 实施例3:用于表达猕猴IgG4_2F8和IgG4_7D8的表达载体
[0638] 合成含有中国猕猴IgG4重链和κ轻链的编码区和Humab2F8和7D8的VH和VL区 的载体，将其完全密码子优化并插在PEE 12. 4 (重链）和pEE6. 4 (轻链）中。所用重链恒定 区序列（基于由Scinicariello等，Immunology 111 :66_74, 2004描述的序列）如下（与 人序列比对）：
[0639] 人 IgG4
[0640] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH 猕猴（Ch) IgG4
[0641] -STKGPSVFPLASCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
[0642] 人 IgG4
[0643] TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
[0644] 猕猴（Ch) IgG4
[0645] TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYVCNVVHEPSNTKVDKRVEFT-
[0646] 人 IgG4
[0647] PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
[0648] 猕猴（Ch) IgG4
[0649] PPCPACPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
[0650] 人 IgG4
[0651] QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
[0652] 猕猴（Ch) IgG4
[0653] QFNWYVDGAEVHHAQTKPRERQFNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKV
[0654] 人 IgG4
[0655] SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY
[0656] 称猴（Ch) IgG4
[0657] SNKGLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPPQEELTKNQVSLTCLVTGFY
[0658] 人 IgG4
[0659] PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF 猕猴（Ch) IgG4
[0660] PSDIAVEWESNGQPENTYKTTPPVLDSDGSYLLYSKLTVNKSRWQPGNIF
[0661] 人 IgG4 SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID N0:5)
[0662] 猕猴（Ch)IgG4 TCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID N0:6)
[0663] 使用的猕猴轻链恒定区（CL)序列是：
[0664] AVAAPSVFIFPPSEDQVKSGTVSVVCLLNNFYPREASVKWKVDGVLKTGNSQESVTEQDSKDNTYSLSS TLTLSSTDYQSHNVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :7)
[0665] 实施例4 :通过在HEK-293F细胞中瞬时表达生成抗体
[0666] 按照制造商说明书，使用293fectin (Invitrogen)，通过在HEK-293F细胞 (Invitrogen)中共转染相关的重链和轻链表达载体,在无血清条件下生成抗体。
[0667] 实施例5 :IgGl和IgG4抗体的纯化
[0668] 通过蛋白A亲和层析纯化IgGl和IgG4抗体。将细胞培养上清液用0. 20 μ Μ死端 式滤器过滤，接着在 5mL 蛋白 Α 柱（rProtein A FF，GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上上 样，用0. 1M柠檬酸-NaOH，pH 3洗脱IgG。将洗脱液立即用2MTris-HCl，pH 9中和，并针对 12. 6mM憐酸钠，140mM NaCl, pH 7. 4(B. Braun, Oss, The Netherlands)透析过夜。在透析后， 将样品用〇. 20 μ Μ死端式滤器无菌过滤。通过比浊法和280nm处的吸光度确定纯化的IgG 的浓度。将纯化的蛋白用SDS-PAGE、IEF、质谱法和糖分析法（glycoanalysis)分析。
[0669] 实施例6 :CH2_CH3片段的纯化
[0670] 将有His标签的CH2-CH3蛋白通过固定化金属离子（Ni2+)亲和层析 (Macherey-Nagel GmbH, Diiren, Germany)纯化，用 PBS 平衡的 Η)_10 柱（GE Healthcare)脱 盐，用〇.2μΜ死端式滤器无菌过滤。通过280nm处的吸光度测定纯化的蛋白质的浓度。通 过SDS-PAGE分析了纯化蛋白的质量。
[0671] 实施例7 :通过人与猕猴IgG4抗体之间GSH诱导的Fab臂互换产生双特异性抗体
[0672] 为了测试人与猕猴IgG4抗体之间的Fab臂交换，用人IgG4_2F8 (抗EGFR)、 IgG4-7D8 (抗CD20)、猕猴IgG4-2F8和猕猴IgG4-7D8制备两种抗体所有可能的组合。对 于体外Fab臂交换，将抗体混合物（在0. 5mL PBS中以4 μ g/mL终浓度含有各种抗体）与 0. 5mM还原型谷胱甘肽（GSH)在37°C温育24小时。为终止还原反应，将.5mL PBS/0. 05% Tween20(PBST)加至反应混合物。
[0673] 用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA)通过测定双特异性结合测试双特异性抗体 的存在情况。将ELISA板（Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)用 2 μ g/mL(100 μ L/ 孔）重组EGFR胞外域在PBS中在4°C包被过夜。将板用PBST清洗一次。将系列稀释 的抗体样品（0-1 μ g/mL，在3倍稀释液中）在PBST/0. 2% BSA(PBSTB)中转移至包被的 ELISA板（100 μ L/孔），在室温（RT)在平板振荡器（300rpm)上温育60分钟。弃去样品， 将板用PBS/0. 05% Tween 20(PBST)清洗一次。接着，将板在平板振荡器（300rpm)上与 含2yg/mL小鼠抗独特型单克隆抗体2F2 SABI. 1 (针对7D8;Genmab)的PBTB(100yL/ 孔）温育60分钟。将板用PBS/0. 05% Tween 20 (PBST)清洗一次。接着，将板在平板振 荡器（300rpm)上与PBSTB(100yL/孔）中缀合有HRP的山羊抗小鼠 IgG(15G;Jackson ImmunoResearch Laboratories, Westgrove, PA, USA ; 1: 5· 000)在RT -起温育60 分钟。将板 用 PBS/0. 05% Tween 20 (PBST)清洗一次。加入 ABTS(PBS 中 50mg/mL ;Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) (100 μ L/ 孔），并在 RT 避光温育 30 分钟。用 2 % 草酸（100 μ L/ 孔；Riedel de Haen Seelze, Germany)终止反应。在RT10分钟后，在ELISA读板器中测量 405nm处的吸光度。
[0674] 图1显示人和猕猴IgG4的组合与相同物种的IgG4分子的各个组合相比产生更大 的双特异性结合（更高的〇D 405nm)。这些数据显示Fab臂互换发生在人IgG4与猕猴IgG4 之间。而且，更高的双特异性结合提示人IgG4半分子显示优先与猕猴IgG4半分子二聚体 化（异二聚体化），导致Fab臂交换反应的平衡转向双特异性异二聚体而不是转向50%异 二聚体和50%同二聚体的随机互换。
[0675] 实施例8 :人和猕猴IgG4的序列分析
[0676] 为了尝试阐明与相同物种的IgG4分子之间的Fab臂交换相比的人与猕猴IgG4 之间的Fab臂交换增加，分析了人和猕猴抗体的核心铰链和CH3-CH3界面氨基酸（关于人 CH3-CH3 界面残基的综述参见例如 Dall'Acqua,等（1998)Biochemistry 37:9266)。图 2 显示中国猕猴IgG4的核心铰链序列是226-CPAC-229,并且CH3域含有在409位的赖氨酸 (K)。此外，序列比对显示猕猴IgG4的特征在于与人IgG4相比在CH3-CH3界面的额外的三 个氨基酸取代：在350位猕猴为异亮氨酸（I)对比人的苏氨酸（T);在370位猕猴为苏氨酸 (T)对比人的赖氨酸（K);和在405位猕猴为亮氨酸（L)对比人的苯丙氨酸（F)。
[0677] 实施例9 :用人IgG4与含有猕猴IgG4CH3序列的人IgGl之间GSH诱导的Fab臂 交换产生双特异性抗体
[0678] 基于实施例7所述人与猕猴IgG4之间的Fab臂交换，分析了中国猕猴IgG4CH3序 列是否可参与人IgGl的Fab臂交换。因此，除了产生铰链序列CPSC的P228S突变外，将三 重突变T350I-K370T-F405L (下文称为ITL)引入人IgGl_2F8中。将人IgGl-2F8突变体与 人IgG4-7D8组合用于体外GSH诱导的Fab臂交换。将含有在0. 5mL具有0. 5mM GSH的PBS 中4 μ g/mL终浓度的每种抗体的抗体混合物在37°C温育0-3-6-24小时。为了终止还原反 应，将0. 5mLPBS/0. 05% Tween20 (PBST)加至反应混合物。按照实施例7所述在ELISA中进 行双特异性结合的测量。
[0679] 图3证实与人IgG4-7D8组合时，单独引入CPSC铰链不使人IgGl-2F8参与GSH 诱导的Fab臂交换。而且，将猕猴IgG4特异性CH3界面氨基酸（ITL)引入人IgGl-2F8中 并同时保留野生型IgGl铰链，在这些条件下与人IgG4-7D8组合时也不导致参加 Fab臂交 换。相反，具有在铰链中的CPSC序列和猕猴IgG4特异性CH3界面氨基酸（ITL)的变体人 IgGl-2F8主链序列，在与人IgG4-7D8发生GSH诱导的Fab臂交换后，显示比两种人IgG4抗 体增加的双特异性结合。这些数据显示含CPSC的铰链与在350、370和405位分别含有I、 T和L的CH3域组合，足以使人IgGl参加 GSH诱导的Fab臂交换，并且与人IgG4组合时，交 换反应的平衡向经交换的双特异性产物移动。
[0680] 实施例10 :通过人IgG4与IgGl或IgG4突变体之间的体内Fab臂交换产生双特 异性抗体
[0681] 为了进一步鉴定参与Fab臂交换需要的特征，体内分析了人IgG4和IgGl变体。对 每组 4 只雌性 SCID 小鼠 （Charles River, Maastricht, The Netherlands) i.v.注射抗体混 合物，其在300 μ L总体积中含有600 μ g抗体（500 μ g 7D8+100 μ g2F8)。在注射后3、24、 48和72小时从隐静脉抽取血液样品。将血液收集在含肝素的瓶中，以10, 000g离心5分钟 使细胞与血浆分离。产生双特异性抗体，接着按实施例7所述用在PBSTB中系列稀释的血 浆样品在ELISA中评估⑶20和EGFR双特异性反应性。用体外经交换的抗体混合物作为参 考物，通过非线性回归曲线拟合（GraphPad Software, San Diego, CA)将血楽样品中的双特 异性抗体量化。
[0682] 图4显示其中铰链或CH3序列转化为相应的人IgGl序列（分别是CPPC或R409K) 的人IgG4-2F8不再参加体内Fab臂交换。反之亦然，其中铰链区和CH3界面序列两者转化 为相应的人IgG4序列（CPSC和K409R)人IgGl能够参与体内Fab臂交换。这些数据显示含 CPSC的铰链（在228位的S)与在409位含精氨酸（R)的CH3域组合，足以使通过人IgGl 和人IgG4在体内的Fab臂交换能够进行。
[0683] 实施例11 :通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体：稳定化铰链的绕开 /破坏
[0684] 2-巯基乙胺·Η(：1 (2-MEA)是温和的还原剂，已被描述为选择性裂解抗体铰链区的 二硫键，同时保留重链与轻链之间的二硫键。测试一系列浓度的2-ΜΕΑ通过两种含有CPSC 或CPPC铰链区的抗体之间的Fab臂交换诱导双特异性抗体产生的能力。将抗体混合物（含 有各种0· 5mg/mL终浓度的抗体）与一系列浓度的2-MEA (0,0· 5, L 0, 2. 0, 5. 0, 7. 0,10. 0， 15. 0,25. 0和40. OmM)以100 μ L Tris-EDTA(TE)总体积中于37°C温育90分钟。为了终止 还原反应，按照制造商推荐用离心柱（Microcon离心过滤器，30k，Millipore)通过使样品 脱盐除去还原剂2-MEA。按照实施例7所述在ELISA中测量双特异性结合。
[0685] 对组合IgG4-2F8 X IgG4-7D8 (其含有CPSC铰链区且已知参与GSH诱导的Fab臂 交换）和组合IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC(其因为稳定的铰链区而不参与GSH诱导 的Fab臂交换（描述于实施例9,图3))测试2-MEA诱导的Fab臂交换。令人惊奇地，如通 过非还原性SDS-PAGE所确定的，发现2-MEA诱导轻链与重链分离（数据未显示）。但是， 如图5所示产生功能性双特异性抗体。在2. 0mM2-MEA浓度下达到在野生型人IgG4-2F8与 IgG4-7D8之间的Fab臂交换后双特异性结合的最大水平，其与实施例9所述的用0. 5mM GSH 所达到的水平（图3)相当。但是，2-MEA能够以剂量依赖性方式诱导人抗体IgGl-2F8-lTL 与IgG4-7D8-CPPC(具有稳定的铰链区）之间的Fab臂交换。虽然在低2-MEA浓度形成很 少或不形成双特异性抗体（这可能是因为两种抗体的铰链区都存在CPPC序列所致），但在 更高浓度的2-MEA下非常有效地产生双特异性抗体。在25mM2-MEA达到最大的双特异性结 合，其超过在两种野生型IgG4抗体之间的Fab臂交换后的最大结合。这些最大结合水平与 实施例9(图3)关于对含有CPSC铰链的相应抗体（IgGl-2F8-CPSC-ITL)的GSH处理所述 的最大结合水平相当。因为IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC两者都含有CPPC铰链，所以 这些数据提示2-MEA可绕过体外Fab臂交换对CPSC铰链的需要。
[0686] 实施例12 :在通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体后的质谱法
[0687] 通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体描述于实施例11，其中双特异 性结合通过ELISA显示（图5)。为了证实形成双特异性抗体，通过电喷雾电离质谱法 (ESI-MS)分析样品以确定分子量。首先，通过将200μ 8抗体与0.005U N-聚糖酶（产 品目录号GKE-5006D ;Pr〇Zyme)在180μ L PBS中在37°C温育过夜使样品去糖基化。将 样品在具有 BEH300C18, 1·7μπι，2· 1x50mm 柱的 Aquity UPLC?(Waters，Milford，USA)上 60°(1|脱盐，用含0.05(%甲酸（卩1111^1^6(161-(16 1131&1,1311(3118,661'1]1&115〇的]^-]\^级乙臆 (洗脱剂13)(13；[0801￥6，\^11^118￥331(1，1116他1：1161'1311(18)和]\1( >)水（洗脱剂4)的混合物 梯度洗脱。在以正离子模式操作的mi crOTOF?质谱仪（Bruker, Bremen, Germany)上在 线记录飞行时间电喷雾电离质谱。在分析前，用ES调谐混合物（tuning mix) (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)校准 500-4000m/z 标度。通过用由DataAnalysis? 软件 3· 4版本（Bruker, Bremen, Germany)提供的Maximal Entropy对质谱解卷积。基于在本实 验用于Fab臂交换的抗体分子量，可将双特异性抗体与原来的抗体区别开来（还描述于实 施例15,对于IgGl-2F8-ITLxIgG4-7D8-CPPC，见图9C)。对于双特异性抗体的峰，确定曲线 下面积，并除以曲线下总面积以计算每个样品中的双特异性抗体百分数。
[0688] 图6A显示用0mM2-MEA(对应于亲本抗体的两个峰）、7mM2-MEA(对应于亲本 和双特异性抗体的三个峰）和40mM2-MEA(对应于双特异性抗体的一个峰）进行的 IgGl-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的Fab臂交换反应的三个代表性质谱曲线。双特异性 产物的均匀峰提示不发生轻链错配（这会导致再分的峰）。定量数据在图6B中呈现，显示 1 861-2?8-111与1864-708-0--(：之间的？&13臂交换产生接近100%双特异性抗体。相反， 野生型IgG4抗体之间的Fab臂交换产生少于50%双特异性产物。这些数据证实描述于实 施例11的双特异性结合ELISA的结果（图5)。
[0689] 实施例13 :通过2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体的稳定性
[0690] 测试通过2-MEA诱导的体外Fab臂交换产生的双特异性抗体的稳定性。因此，将 2 μ g用7. 0mM2_MEA从IgGl_2F8_ITL和IgG4_7D8_CPPC产生的双特异性样品（如实施例11 所述，图5)在一系列浓度（0、2、20、100μ g)的无关IgG4(针对乙酰胆碱受体的IgG4-MG) 的存在下用于GSH诱导的Fab臂交换反应，所述一系列浓度代表与2 μ g双特异性测试样品 相比0,1，10, 50倍过量的IgG4-MG。在该反应中的Fab臂交换会导致双特异性EGFR/⑶20 结合的丧失。GSH还原反应的条件与实施例7所述相同（在37°C在0. 5mLPBS/0. 5mM GSH 中24小时）。为了终止还原反应，将0. 5mL PBSTB加至反应混合物。按照实施例7所述在 ELISA中测量双特异性结合。将GSH还原反应后的双特异性结合相对于在起始材料（对照） 中测量的双特异性结合（其设置为100% )表示。
[0691] 图7A显示对于IgGl-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC衍生的双特异性样品，在无关 IgG4的存在下GSH诱导的Fab臂交换后的EGFR/⑶20双特异性结合无明显改变。这指 示双特异性产物稳定，即不参与GSH诱导的Fab臂交换。作为对照，图7B显示IgG4-2F8 X IgG4-7D8衍生的样品显示在无关IgG4的存在下GSH诱导的Fab臂交换后减少的 EGFR/⑶20双特异性结合，指示该产物不稳定。这些数据显示由在CH3域含有三重突变 T350I-K370T-F405L的人IgGl重链和含有产生稳定化铰链（CPPC)的S228P取代的人IgG4 重链组成的异二聚体是稳定的。
[0692] 实施例14 :通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生的双特异性抗体的药动学和稳定性 的体内分析
[0693] 将通过IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之间体外2-MEA诱导的Fab臂交换产 生的双特异性抗体（实施例11，图5,7mM2-MEA)注射在SCID小鼠中以分析其与亲本抗体 IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC比较的稳定性（体内Fab臂交换）和药动学性质（血浆清 除率）。对三组小鼠（每组3只小鼠）尾静脉内静脉内注射200 μ L纯化抗体：（1) 100 μ g双 特异性抗体；（2) 100 μ g双特异性抗体+1，000 μ g无关IgG4 (那他珠单抗，抗-α 4-整联蛋 白）；（3)50yg IgGl-2F8-ITL+50yg IgG4-7D8-CPPC。在抗体施用后以预定时间间隔（10 分钟、3小时、1、2、7、14、21天）通过颊穿刺收集血液样品（50-100 μ L)。将血液收集在含肝 素的小瓶内，以14, 000g离心10分钟。在进一步分析以前将血浆贮存于_20°C。
[0694] 通过ELISA测定血浆样品中的总IgG浓度。后续步骤的测定条件与实施例7所述 ELISA的相同。用于总IgG测量的具体化合物如下：用2 μ g/mL小鼠抗人IgG (克隆MH16-1 ; CLB ;产品目录号M1268)包被；血清样品稀释液（对于第1和3组为1:500和1:2, 500)和 (对于第2组为1:2, 500和1:10,000);缀合物：缀合有HRP的山羊抗人IgG(克隆11H; Jackson ;产品目录号109-035-098 ;1:10, 000)。测定血浆样品中双特异性抗体的存在，并 通过如实施例10所述在ELISA中的⑶20和EGFR双特异性反应性来量化。
[0695] 图8A显示总抗体血浆浓度。血浆清除曲线的形状在所有组中是相同的，指示在 分析时间间隔里双特异性抗体的血浆清除与亲本抗体IgGl-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC相 同。图8B显示随着时间推移双特异性抗体的血浆浓度。将10倍过量的无关IgG4加至 双特异性抗体不影响双特异性抗体浓度，指示不发生体内Fab臂交换。在注射亲本抗体 (IgGl-2F8-ITL+IgG4-7D8-CPPC)后，血浆中检测不到双特异性抗体，证实这些抗体不参与 体内Fab臂交换。这些数据提示通过IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之间的体外2-MEA 诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体产物，在体内稳定（无 Fab臂交换）并显示与亲本单 价抗体相当的药代动力学性质（血浆清除率）。
[0696] 实施例15 :通过两种抗体之间2-MEA诱导Fab臂交换产生的双特异性抗体的纯度
[0697] 将通过人IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之间2-MEA诱导Fab臂交换产生的双 特异性抗体批次，在ro-ΙΟ脱盐柱（产品目录号17-0851-01 ;GEHealthcare)上纯化。接 着，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)、高效大小排阻层析（ΗΡ-SEC)和 质谱法分析双特异性产物的纯度。通过在ELISA中的双特异性结合（数据未显示）证实了 产生的双特异性抗体的功能性。
[0698] 用改良的 Laemmli 法（Laemmlil970Nature227 (5259) :680-5)在 4-12 % NuPAGE Bis-Tris凝胶（Invitrogen, Breda, The Netherlands)上在还原和非还原条件下进行 SDS-PAGE，其中在中性pH运行样品。将SDS-PAGE凝胶用考马斯染色，并用GeneGenius (Syn optics, Cambridge, UK)数字成像。图9A显示在Fab臂交换后的抗体样品由完整IgG和在 非还原凝胶上可检测到的痕量半分子（H1L1)构成（图9A-b)。
[0699] 用连接 TSK ΗΡ-SEC 柱（G3000SWxl ;Toso Biosciences, via Omnilabo，Breda，The Netherlands)和 Waters2487 双重 λ 吸光度检测器（Waters)的 Waters Alliance2695 分 离单兀（Waters, Etten-Leur, The Netherlands)进行 HP-SEC 分级。使样品以 lmL/min 运 行。将结果用2002版Empower软件处理，并将每个峰表示为总峰高的百分数。图9B显示 >98%的样品由完整IgG构成，实际上不形成聚集物。
[0700] 按照实施例12所述进行质谱法。图9C显示起始材料IgGl-2F8-ITL和 IgG4-7D8-CPPC 以及通过 IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC 之间的 Fab 臂交换产生 的双特异性产物的质谱概貌。在Fab臂交换的样品中的产物是145, 90lkDa，其与从 IgGl-2F8-ITL(146, 259. 5/2 = 73, 130)+IgG4-7D8-CPPC(145, 542. 0/2 = 72, 771)衍生的双 特异性产物完全相配。此外，双特异性抗体产物显示均匀的峰，提示不发生会导致产生再分 的峰的轻链错配。这些数据显示Fab臂交换产生100%双特异性抗体。除了 IgG4-7D8-CPPC 和双特异性样品的主峰（K0)以外所检测到的小峰可归因于抗体重链中存在一个（K1)或两 个（K2)C-端赖氨酸。
[0701] 这些数据显示约100 %功能性双特异性抗体样品是通过IgGl-2F8-ITL X IgG4-7D8-CPPC之间的2-MEA诱导Fab臂交换产生的。
[0702] 实施例16 :阐明人IgGl进行Fab臂交换对T350I、K370T和F405L取代的需要 [0703] 为了进一步鉴定IgGl参与Fab臂交换所需要的在IgGl CH3域中的决定 簇（determinant)，将含有三重突变T350I-K370T-F405L (ITL)的IgGl与双重突变体 T350I-K370T(IT)，T350I-F405L(IL)和 K370T-F405L(TL)比较。还测试单突变体 405L(L)。 用2-MEA作为还原剂以诱导体外Fab臂交换（50 μ g每种抗体在100 μ L PBS/25mM2-MEA 中在37°C达90分钟）。对于单突变体F405L抗体，在使用Amicon Ultra离心装置 (30k，Millipore，产品目录号UFC803096)将缓冲液更换为PBS后使用来自瞬时转染上清液 的未纯化抗体。为了终止还原反应，按照实施例11所述使用离心柱通过使样品脱盐除去还 原剂2-MEA。通过在按照实施例7所述的ELISA中测量的双特异性结合来确定双特异性抗 体的产生。
[0704] 将三重突变（ITL)、双重突变（IT、IL和TL)和单突变（L)引入IgGl-2F8中。将 这些突变体与含有CPSC铰链（野生型）或稳定化铰链（IgG4-7D8-CPPC)的IgG4-7D8组 合，在37°C用25mM2-MEA进行Fab臂交换90分钟。图10A-B显示IgGl-2F8-IL和-TL突 变体显示与三重突变体ITL相同水平的Fab臂交换，这与组合的IgG4-7D8 (CPSC或CPPC铰 链）无关。相比之下，对于与IgGl-2F8-IT突变体的组合未发现双特异性结合。图10C显 示IgGl-2F8-F405L突变体也显示Fab臂交换，这与组合的IgG4-7D8 (CPSC或CPPC铰链） 无关。这些数据指示在上述条件下F405L突变足以使人IgGl参与Fab臂交换。
[0705] 实施例17 :在不同温度下通过2-MEA诱导Fab臂交换产生双特异性抗体
[0706] 在不同温度下测试2-MEA诱导通过两种不同抗体之间的Fab臂交换产生双特异 性抗体的能力。通过在0°C、20°C(RT)或37°C在320μ1 PBS/25mM2-MEA中将160yg人 IgGl-2F8-ITL与160μ g IgG4-7D8-CPPC(每种抗体终浓度为0· 5mg/mL) -起温育开始 Fab臂交换反应。从这些反应中，在不同时间点（0、2. 5、5、10、15、30、45、60、75、90、120、 150、180和240分钟）取出20yL样品。将20yL PBS加至每个样品，之后按照制造商 的推荐，用Zeba96孔离心脱盐板（7k,产品目录号89808Thermo Fisher Scientific)通 过使样品脱盐，除去还原剂2-MEA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands)通过测量280nm波长的吸光度确定总抗体浓度。按 照实施例7所述在ELISA中使用系列稀释的抗体样品（总体浓度0-20 μ g/mL，在25倍稀释 液中）测量双特异性结合。
[0707] 图11显示发现通过人IgGl-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的2-MEA诱导的Fab 臂交换产生双特异性抗体在37°C最有效，45分钟后达到最大双特异性结合。在室温，双特 异性抗体的产生更慢，240分钟后达到最大双特异性结合。在0°C，在分析时间过程期间观 察不到双特异性结合的产生。
[0708] 实施例18 :对不同还原剂分析其诱导通过体外Fab臂交换产生双特异性抗体的能 力
[0709] 上文已显示0. 5mM GSH可在体外诱导人IgG4与IgGl-CPSC-ITL之间而不是人 IgG4与含有稳定铰链的IgGl-ITL之间的Fab臂交换（图3)。此外，发现2-MEA能够诱导 具有稳定化铰链区的抗体诸如IgGl-ITL X IgG4-CPPC之间的Fab臂交换（图5)。为了测 试是否其它浓度的GSH或2-MEA或者其它还原剂能够体外诱导两种不同抗体之间的Fab臂 交换，测试一系列浓度的2-MEA、GSH和DTT (二硫苏糖醇）。因此，将20 μ 1 PBS中10 μ g人 IgGl-2F8-ITL和10μ gIgG4-7D8-CPPC (每种抗体终浓度为0. 5mg/mL)的组合与一系列浓度 的不同还原剂（〇· 〇,〇· 04,0· 1，0· 2,0· 5,1. 0,2· 5,5· 0,12. 5,25· 0 和 50. OmM)在 37°C温育。 90分钟后，将20 μ L PBS加至每种样品，并按照实施例17所述用离心脱盐板通过使样品脱 盐除去还原剂。按照实施例17所述确定总抗体浓度。按照实施例7所述在ELISA中使用 抗体样品的系列稀释液（总抗体浓度0-20 μ g/mL，3倍稀释）测量双特异性结合。
[0710] 图12证实2-MEA在25mM2-MEA浓度下诱导最大双特异性结合。发现DTT非常有 效地产生双特异性抗体，在2. 5mM DTT下达到最大双特异性结合。在0-5mM范围的GSH浓 度不能诱导通过IgGl-ITL与IgG4-CPPC抗体（两者都含有稳定化铰链区）之间的Fab臂 交换产生双特异性抗体。更高的GSH浓度（12. 5-50mM)导致形成抗体聚集物，如通过非还 原性SDS-PAGE(数据未显示）所确定的。因此，从分析中排除这些样品。这些数据显示不 同还原剂可诱导通过两种不同抗体之间的Fab臂交换产生双特异性抗体。
[0711] 实施例19 :用于与IgGl-ITL组合参加2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1409位 的决定簇
[0712] 2-MEA可诱导人IgGl-ITL和IgG4-CPPC之间的Fab臂交换，如实施例11所述（图 5)。人IgGl与IgG4的CH3界面残基区别只在于409位：IgGl为赖氨酸⑷和IgG4为精 氨酸（R)(描述于实施例8,图2)。因此，测试在409位用精氨酸或任何其它氨基酸取代赖 氨酸（K409X)，是否可使IgGl能够参加2-MEA诱导的与IgGl-ITL的Fab臂交换。将20 μ 1 PBS/25mM2-MEA 中 10 μ g 人 IgGl-2F8-ITL 和 10 μ g IgGl-7D8-K409X 的组合（每种抗体终 浓度为〇.5mg/mL)在37°C温育90分钟。在用Amicon Ultra离心单元（30k，Millipore,产 品目录号UFC803096)将缓冲液更换为PBS后，使用来自瞬时转染上清液的未纯化抗体。在 Fab臂交换反应后，将20μ L PBS加至每种样品，按照实施例17所述使用离心脱盐板通过使 样品脱盐除去还原剂。按照实施例7所述在ELISA中使用抗体样品的系列稀释液（总抗体 浓度0-20 μ g/mL，在3倍稀释液中）测量双特异性结合。
[0713] 图 13A 显示在 IgGl-2F8-ITL X IgGl-7D8-K409X 之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂交换后 双特异性结合的结果。在图13B中，将交换表示为相对于纯化批次的双特异性抗体（将其设 为100% )的双特异性结合，所述双特异性抗体从IgGl-2F8-ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的 2-MEA诱导的Fab臂交换衍生。如表I表示，还将这些数据评分为（-)无 Fab臂交换、（+/-) 低度、（+)中度或（++)高度Fab臂交换。当IgGl-7D8的409位是K(=野生型IgGl)、L或 Μ时发现无 Fab臂交换（-)。发现Fab臂交换当IgGl-7D8的409位是F、I、N或Y时是中度 (+)，当 IgGl-7D8 的 409 位是 A、D、E、G、H、Q、R、S、T、V 或 W 时为高度（++)。
[0714] 表 1 :2-MEA 诱导的 IgGl-2F8-ITL 和 IgGl-7D8-K409X 突变体之间的 Fab 臂交换。 通过夹心ELISA确定2-MEA诱导的IgGl-2F8-ITL和IgGl-7D8-K409X突变体之间的体外 Fab臂交换后双特异性抗体的产生。（_)无，（+/_)低度，（+)中度，（++)高度Fab臂交换。
[0715]
【权利要求】
1. 一种用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤： a) 在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条 件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且 其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第一 CH3区，且所 述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的Fc区，所述Fc区包含第二CH3区，且其中所述第一 和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用 强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用， b) 使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋 白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
2. 依照权利要求1的体外方法，其中步骤b)包括使至少10mL从步骤a)获得的组合物 经受足以容许氧化的氧化条件。
3. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述方法进一步包括如下步骤： c) 获得所述异二聚体蛋白。
4. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括添 加还原剂。
5. 依照权利要求4的体外方法，其中所述还原剂选自下组：2_巯基乙胺、2-巯基乙胺 的化学衍生物、L-半胱氨酸、和D-半胱氨酸。
6. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括添加金属螯合剂。
7. 依照权利要求6的体外方法，其中所述金属螯合剂是EDTA、EGTA或柠檬酸。
8. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括减 少步骤a)中的组合物中的氧量。
9. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中在还原性条件下实施步骤a)，所述还 原性条件具有介于-150和-600mV之间，诸如介于-350和-450mV之间的氧化还原电势。
10. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括在存在至少25mM选自 下组的还原剂的情况中于至少20°C的温度温育至少30分钟：2_巯基乙胺、L-半胱氨酸和 D-半胱氨酸。
11. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二同二聚体蛋白在缓 冲液中。
12. 依照权利要求11的体外方法，其中所述缓冲液包含范围为Ι-lOOmM的磷酸盐，诸如 l-50mM磷酸盐或范围为1-25禮，或范围为5-20mM。
13. 依照权利要求11-12中任一项的体外方法，其中所述缓冲液具有范围为4. 5-8. 5， 诸如范围为6. 5至7. 5的pH。
14. 依照权利要求11-13中任一项的体外方法，其中所述缓冲液选自下组：a)8. ImM磷 酸钠（Na2HP04-7H20)、1· 5mM 磷酸钾（KH2P04)、138mM 氯化钠（NaCl)、2· 7mM 氯化钾（KCl)pH 5· 0 ;b)8. ImM磷酸钠（Na2HP04-7H20)、L 5mM 磷酸钾（KH2P04)、138mM 氯化钠（NaCl)、2· 7mM 氯 化钾（KCl)pH 7.0 ;3)20mM Tris-HCl，pH 7.8。
15. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括范围为6-8. 5的pH。
16. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括至少-300mV的氧化还原 电势。
17. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括至少 0. 05mM氧气的存在。
18. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括添加 氧气。
19. 依照权利要求18的体外方法，其中以机械方式，例如通过搅动、搅拌、提高压力或 产生流动实施添加氧气。
20. 依照权利要求18-19中任一项的体外方法，其中通过用氧气或空气喷射或者提高 压力实施添加氧气。
21. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括氧化 剂。
22. 依照权利要求21的体外方法，其中所述氧化剂是脱氢抗坏血酸（dhAA)。
23. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括分开所述异二聚体蛋白 和所述还原剂。
24. 依照权利要求23的体外方法，其中步骤b)包括使从步骤a)获得的组合物经受层 析或过滤。
25. 依照权利要求24的体外方法，其中所述层析是柱层析。
26. 依照权利要求24的体外方法，其中所述过滤是渗滤。
27. 依照权利要求26的方法，其中所述渗滤是切向流过滤（TFF)或正常流过滤（NFF)。
28. 依照权利要求27的体外方法，其中所述渗滤是TFF。
29. 依照权利要求27的体外方法，其中通过使所述组合物循环通过中空纤维筒实施所 述渗滤，直到发生了 1至7个体积的缓冲液更换，所述中空纤维筒包含范围为10-50kDa的 截留值，且具有范围为〇. 〇5-lm2的表面积，且具有范围为70-280kPa的筒入口压力。
30. 依照权利要求23-29中任一项的体外方法，其中分开所述异二聚体蛋白和所述还 原剂包括用不含所述还原剂的缓冲液或溶液更换从步骤a)获得的组合物的缓冲液或溶 液。
31. 依照权利要求30的体外方法，其包括范围为3-12个体积的缓冲液或溶液更换，诸 如范围为4-10个体积。
32. 依照权利要求24-30中任一项的体外方法，其中分开所述异二聚体蛋白和所述还 原剂是连续过程。
33. 依照权利要求24-30中任一项的体外方法，其中分开所述异二聚体蛋白和所述还 原剂是分批过程。
34. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括下列 步骤： I) 从步骤a)获得的组合物的渗滤 II) 从步骤I)获得的渗余物的温育 III) 从步骤II)获得的组合物的渗滤。
35. 依照权利要求34的体外方法，其中步骤I)和/或III)中所述的渗滤包括范围为 3-12个体积的缓冲液更换。
36. 依照权利要求34-35中任一项的体外方法，其中步骤II)包括于范围为15-35°C的 温度温育12-48小时的时段。
37. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中从步骤a)获得的所述组合物中的异 二聚体蛋白浓度范围为l-l〇〇g/L。
38. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包含金属 离子。
39. 依照权利要求38的体外方法，其中步骤b)中的所述氧化条件包括添加金属离子。
40. 依照权利要求38-39中任一项的体外方法，其中所述金属离子的浓度范围为0. 1至 100 μ M。
41. 依照权利要求38-40中任一项的体外方法，其中所述金属离子选自下组：铜、锰、 镁、铁、镍和钴。
42. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中第一与第二同二聚体蛋白 的比率范围为1:1.01至1:2。
43. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一或第二同二聚体蛋白不能 结合蛋白A和/或蛋白G。
44. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二同二聚体蛋白包含 不同轻链。
45. 依照权利要求44的体外方法，其中步骤c)包括通过将所述异二聚体蛋白在仅与轻 链之一结合的材料上通过而将其与残留的第一和/或第二同二聚体蛋白分开。
46. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二同二聚体蛋白的Fc 区是不同同种异型的。
47. 依照权利要求44的体外方法，其中步骤c)包括通过将所述异二聚体蛋白在仅与所 述同种异型之一结合的材料上通过而将其与残留的第一和/或第二同二聚体蛋白分开。
48. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括使从步骤b)获得的组合 物经受纯化方法。
49. 依照权利要求48的体外方法，其中所述纯化方法选自下组：蛋白A或蛋白G层析、 基于抗原结合的亲和层析、基于抗独特型抗体的亲和层析、离子交换、疏水性相互作用层 析、混合式层析（诸如羟磷灰石）、固定化金属亲和层析和亲硫性吸附层析。
50. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括下列步骤： i) 提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一 CH3区， ii) 提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3区， 其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的 异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用， iii) 在还原性条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起温育，所述还原性条件足以 容许所述铰链区中链间二硫键的还原。
51. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤b)包括使至少30mL从步骤a) 获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化 成链间-硫键。
52. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的第一同二聚体和第二同 二聚体蛋白的终浓度是至少〇. 25mg/mL。
53. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列含有 不同位置处的氨基酸取代。
54. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中相对于野生型CH3区，所述第一同二 聚体蛋白具有述CH3区中的不超过1处氨基酸取代，且所述第二同二聚体蛋白具有CH3区 中的不超过1处氨基酸取代。
55. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有选自下 组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，且所述第二同二聚体蛋白具 有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，且其中所述第一同 二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白不在相同位置处被取代。
56. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置 409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处 的氨基酸取代：366、368、370、399、405 和 407。
57. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置 409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有位置405处与Phe不 同的氨基酸。
58. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置 409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有位置405处与Phe、 Arg或Gly不同的氨基酸。
59. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置 409 处选自下组的氨基酸：Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、 Trp and Tyr，且所述第二同二聚体蛋白具有位置405处选自下组的氨基酸：Ala、Asp、Glu、 Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 和 Tyr〇
60. 依照权利要求59的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处选自下 组的氨基酸：Arg、Gly、His、Val和lie，且所述第二同二聚体蛋白具有位置405处的Leu。
61. 依照权利要求56-60中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置 409 处的 Arg。
62. 依照权利要求56-61中任一项的体外方法，其中所述第二同二聚体蛋白具有位置 405 处的 Leu。
63. 依照权利要求62的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处的Arg， 且所述第二同二聚体蛋白具有位置405处的Leu。
64. 依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和/或第二同二聚体蛋白 不含c端赖氨酸。
65. 依照权利要求64的体外方法，其中所述第一和/或第二同二聚体蛋白在遗传上修 饰为在重链中缺乏c端赖氨酸。
66. 依照权利要求64的体外方法，其中所述方法包括从所述重链除去c端赖氨酸的步 骤。
67. -种用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤： X)提供编码包含免疫球蛋白的第一 Fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一 Fc 区包含第一 CH3区， y) 提供编码包含免疫球蛋白的第二Fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二Fc 区包含第一 CH3区， 其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的 异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用，且 其中所述第一同二聚体蛋白具有位置409处与Lys、Leu或Met不同的氨基酸，且所述 第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407， 和/或 其中所述第一和第二CH3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个所述 CH3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0. 01和10微摩尔，诸如介于0. 05和10微摩尔 之间，更优选介于〇. 01和5之间，诸如介于0. 05和5微摩尔之间，甚至更优选介于0. 01和 1微摩尔之间，诸如介于0. 05和1微摩尔之间，介于0. 01和0. 5之间或介于0. 01和0. 1之 间， z) 在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体， b)使步骤z)中获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋 白中半胱氨酸氧化成链间二硫键。
68. 依照权利要求67的体外方法，其包含权利要求1-66的任一项特征。
69. 编码第一或第二同二聚体蛋白的核苷酸序列，其中所述第一或第二同二聚体蛋白 的重链不包含c端赖氨酸。
【文档编号】C07K16/46GK104114579SQ201280064946
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月27日
【发明者】M.格雷默, A.昆杜, E.T.J.范登布雷默, M.范坎彭, P.普赖姆, A.F.拉布里杰恩, J.I.美斯特斯, J.J.内杰森, J.舒尔曼, P.帕伦, P.范博凯尔, W.L.沃斯, A.格里特森 申请人:根马布股份公司