专利名称：：抗微管化疗药物基因TUBB3mRNA表达量快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种利用荧光定量PCR技术检测抗微管类化疗药物相关基因TUBB3mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
：微管是一种具有极性的细胞骨架，是由α，β两种类型的微管蛋白亚基形成的微管蛋白二聚体。微管系统的动态变化与细胞的增殖、分化密切相关(JourdainI，LachkarS，CharbautE，etal.Asynergisticrelationshipbetween3regionsofstathminfamilyproteinsisrequiredfortheformationofastablecomplexwithtubulin.BiochemJ,2004；378:877-888)0TUBB3基因编码的β-Tubulin-III蛋白通过磷酸化调节自身活性，影响细胞内微管系统动力平衡，促进微管的解聚或阻止微管的聚合从而影响(MistrySJ,BankA,AtwehGF.Synergisticantiangiogeniceffectsofstathmininhibitionandtaxolexposure.MolCancerRes，2007；5(8)773-8。通过抑制TUBB3的表达，可以干扰恶性肿瘤细胞的有丝分裂，从而影响肿瘤细胞的增殖与凋亡(HolmfeldtP,SellinME,GullbergΜ.UpregulatedOp18/stathminactivitycauseschromosomalinstabilitythroughamechanismthatevadesthespindleassemblycheckpoint.ExpCellRes，2010，316(12):2017-26)。抗微管类化疗药(紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱等)是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成来抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。紫杉醇以TUBB3为作用靶点，抑制TUBB3表达可以促进微管聚合和稳定已聚合微管。在接触紫杉醇后，肿瘤细胞内会积累大量微管，从而干扰细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止，从而起到抗肿瘤效果(ZhouJ,GiannakakouP.Targetingmicrotubulesforcancerchemotherapy.CurrMedChemAnticancerAgents,2005；5(1):65-71)。紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。TUBB3过度表达可见于多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、头颈部癌、恶性黑色素瘤等(LeeKM,CaoD，ItamiA,etal.ClassIIIbeta-tubulin,amarkerofresistancetopaclitaxel,isoverexpressedinpancreaticductaladenocarcinomaandintraepithelialneoplasia.Histopathology.2007，51(4):539-46)，并促进肿瘤细胞增殖、转移。TUBB3基因是紫杉醇等抗微管类化疗药物的作用靶点。在多种肿瘤细胞系的研究和临床研究中，TUBB3基因的mRNA表达水平与抗微管类化疗的疗效密切相关。TUBB3低表达的肿瘤患者接受紫杉醇或长春瑞滨/顺钼治疗的效果较好，中位生存期较长，反之，TUBB3高表达的患者接受紫杉醇或长春瑞滨/顺钼的疗效较差(RosellR,ScagliottiG,DanenbergKD.Transcriptsinpretreatmentbiopsiesfromathree-armrandomizedtrialinmetastaticnon-small-celllungcancer.Oncogene,2003,22(23):3548-53)。而且，TUBB3在肿瘤中的蛋白表达水平与患者预后直接相关。研究表明，在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌患者中，TUBB3基因表达产物β-Tubulin-III高表达的患者比β-Tubulin-III低表达的患者使用紫杉醇、顺钼的治疗反应性差，并且生存率低、预后差(SSveP,DumontetC.IsclassIIIbeta-tubulinapredictivefactorinpatientsreceivingtubulin-bindingagents？LancetOncol.2008,9(2):168-75)。可见，TUBB3及其基因表达产物β-Tubulin-III是肿瘤患者使用紫杉醇等抗微管类化疗药的预测指标和估计预后的指标。目前检测TUBB3表达的方法有免疫组化法、荧光定量PCR法、液相芯片法等。免疫组化法成本低，但敏感性不高；液相芯片法方法复杂，操作技术要求高；而荧光定量PCR法方法简便，特异性和敏感性均高，便于在临床实验室广泛开展，是一种简便、快速、特异的定量检测TUBB3mRNA表达量的新技术。目前尚无文献报告使用荧光定量PCR技术检测TUBB3mRNA表达量的试剂盒。
发明内容本发明的目的在于提供一种能快速检测TUBB3mRNA表达量的试剂盒。为实现上述目的，本发明首先提供了用于TUBB3基因mRNA定量检测的引物，其序列如下TUBB3基因上游引物序列为5，-GAGCGGATCAGCGTCTACTACA-3，；TUBB3基因下游引物序列为5，-GGCTCGAGGCACGTACTTG-3，。上述引物在使用时需要配合相应的荧光探针，在设计荧光探针时可以按照本领域所熟知的方法进行。本发明优选iTaqman荧光探针，其序列为5’-CGAGGCCTCTTCTC-3’，其一端具有报告荧光基团，例如FAM；另一端具有淬灭荧光基团，例如TAMRA。进而，本发明提供一种用于TUBB3基因mRNA定量检测的试剂盒，其包括上述引物和探针。此外，在进行荧光定量PCR的时候，还需要使用适当的内参引物及相应的荧光探针以便进行定量，例如GAPDH。因此，本发明试剂盒还可进一步包括内参引物和相应荧光探针，优选GAPDH，相关引物及荧光探针如下GAPDH基因上游引物序列为5，-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3，；GAPDH基因下游引物序列为5，-CGCCCCACTTGATTTTGG-3，；GAPDH基因荧光探针6FAM5，-CAGGAGCGAGATCC-3，TAMRA。本发明试剂盒还可包括荧光定量PCR所需其他试剂，包括以下试剂中的一种或多种第一链cDNA合成试剂、阴性对照、阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。第一链cDNA合成试剂为4μ125mmol/LMgCl2,2y1IOX逆转录酶缓冲液，2μ110mmol/LdNTP，0.5μ1RNA酶抑制剂，0.5μgOligo(dT)15，AMV逆2U转录酶，12μ1无RNase去离子水。其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有TUBB3总RNA样品为阳性对照。其中的PCR反应液包括10XPCR缓冲液、2.54.OmM的MgCl2、2U/μ1的Taq酶、0.20.4mM的dNIPsUU/μ1的UNG酶、0.30.6mMdUTP，所述引物及探针溶于PCR反应液中，浓度为引物各0.25ρπι01/μ1，荧光探针各0.3pmol/yL·用本发明的试剂盒检测TUBB3基因mRNA表达量首先获取临床肿瘤组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成第一链cDNA；然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。分别计算TUBB3及GAPDH基因的CT值，两者之差即为ΔCt值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。本发明试剂盒的优点和有益效果如下(1)敏感荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。(4)快速速度快、高通量，可在34小时完成。图IA为荧光实时定量RT-PCR检测TUBB3标准品的荧光曲线图。图IB为根据TUBB3标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。图2Α为荧光实时定量RT-PCR检测GAPDH标准品的荧光曲线图。图2Β为根据GAPDH标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1.本发明试剂盒的制备(1)本发明试剂盒组成如下①Trizol快速提取癌组织RNA；②第一链cDNA合成试剂盒(RT-PCR)；包括25mmol/LMgCl24μ1，IOX逆转录酶缓冲液2μ1，10mmol/LdNTP2μ1，RNA酶抑制剂0.5μ1，Oligo(dT)150·5μg，AMV逆转录酶15U，无RNase去离子水；③引物包括目的基因TUBB3、内参基因GAPDH及荧光探针，具体如下TUBB3基因上游引物序列为5，-GAGCGGATCAGCGTCTACTACA-3，；下游引物序列为5，-GGCTCGAGGCACGTACTTG-3，；Taqman荧光探针6FAM5，-CGAGGCCTCTTCTC-3，TAMRA；GAPDH基因GAPDH基因上游引物序列为5，-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3，；GAPDH基因下游引物序列为5，-CGCCCCACTTGATTTTGG-3，；Taqman荧光探针6FAM5，-CAGGAGCGAGATCC-3‘TAMRA上述引物序列、探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有TUBB3总RNA样品为阳性对照。⑤PCR反应液:10XPCR缓冲液、0.25pmol/y1的引物、0.3pmol/μ1的探针、3.OmM的Mg2+、2U/μ1的Taq酶、0.3mM的dNTPs、IU/μ1的UNG酶、0.5mMdUTP。通常取12ul的模板、反应总体积通常为20μ1(以上所有的浓度都是指终浓度)PCR扩增程序的设定在lightcycler2.0仪器上通常是先50°C10s，95°CIOmin,然后95°C15秒60°CImin，循环45次。实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测TUBB3mRNA的表达量以检测30例卵巢癌石蜡切片标本组织结果为例。检测流程首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。获取临床卵巢癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA；配置PCR反应液进行荧光定量PCR。在LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算TUBB3及GAPDH基因的CT值，两者之差即为ACt值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提癌和癌旁组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定^Onm与^Onm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1%DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA取2μ1上述RNA液在70°C保温IOmin随后加入4μ125mmol/LMgCl2,2μ1IOX逆转录酶缓冲液，2μ110mmol/LdNTP，RNA酶抑0.5μ1制剂，0.5μgOligo(dT)15，1.5UAMV逆转录酶，补加DEPC处理水至总体积20μ1，于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。③反应结束后，加热至99°C5min以灭活逆转录酶。加20μ1无菌水混勻置冰箱-20°C保存。④荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20μ1含2XPCR反应液10.0μ1，TUBB3弓丨物浓度0.25ymol/L，探针浓度0.3ymol/L，cDNAl.0μ1，超纯水补齐。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件95°CIOmin预变性，95°C15s，60°CImin扩增45个循环，仪器自动收集荧光信号。⑤数据收集处理和分析将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出目的基因相对于管家基因(GAPDH)的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于1.50为高表达，比值小于0.50为低表达权利要求1.用于TUBB3基因mRNA定量检测的引物，其序列如下TUBB3基因上游引物序列为5，-GAGCGGATCAGCGTCTACTACA-3，；TUBB3基因下游引物序列为5，-GGCTCGAGGCACGTACTTG-3，。2.与权利要求1所述引物配合使用的荧光探针，其序列为5’-CGAGGCCTCTTCTC-3’，其一端具有报告荧光基团，另一端具有淬灭荧光基团。3.一种用于TUBB3基因mRNA定量检测的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括内参引物和相应荧光探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物和探针为GAPDH基因上游引物序列为5，-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3，；GAPDH基因下游引物序列为5，-CGCCCCACTTGATTTTGG-3，；GAPDH基因荧光探针6FAM5，-CAGGAGCGAGATCC-3，TAMRA。6.根据权利要求3飞任一项所述的试剂盒，其还包括选自以下试剂中的一种或多种第一链cDNA合成试剂、阴性对照、阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于第一链cDNA合成试剂为4μ125mmol/LMgCl2,2μ110X逆转录酶缓冲液，2μ110mmol/LdNTP，0.5μ1RNA酶抑制剂，0·5μgOligo(dT)15，2UAMV逆转录酶，12μ1无RNase去离子水。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有TUBB3总RNA样品为阳性对照。9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中的PCR反应液包括10XPCR缓冲液、2.54.OmM的MgCl2、2U/μ1的Taq酶、0.20.4mM的dNTPs、IU/μ1的UNG酶、0.30.6mMdUTP，所述引物及探针溶于PCR反应液中，浓度为引物0.25ρπι01/μ1，荧光探针0.3pmol/μI。全文摘要本发明涉及一种快速检测抗微管类化疗药物相关基因表达量的试剂盒，该试剂盒包括SEQIDNo.1和2所示的引物以及相应的荧光探针，此外还可包括适当的内参引物、荧光探针以及和荧光定量PCR相关的试剂。本发明试剂盒用于抗微管类化疗药物相关基因TUBB3mRNA的快速荧光定量PCR检测。TUBB3高表达预示肿瘤患者使用紫杉醇等抗微管类药物的疗效差、患者预后不佳，检测TUBB3mRNA水平能帮助医生预测使用这类药物的疗效和患者临床结局，具有重要的临床意义。本发明的试剂盒采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR技术检测TUBB3mRNA水平，特异性和敏感度均显著提高，为临床恶性肿瘤患者是否使用紫杉醇等抗微管类化疗药物并预测化疗药物疗效提供了一种全新的快速简便的基因诊断方法。文档编号G01N21/64GK102492775SQ20111042180公开日2012年6月13日申请日期2011年12月15日优先权日2011年12月15日发明者李艳,童永清申请人:李艳,童永清