抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒，所述检测试剂盒，主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因mRNA与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与标记探针互补配对的序列。本发明所述试剂盒除了具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定,从而能更准确地进行检测结果判读。
【专利说明】抗微管类化疗药物疗效相关基因 mRNA表达水平液相芯片 检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及抗微管类化疗 药物疗效相关的基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 抗微管类化疗药物是一类重要的化疗药物，主要包括有紫杉醇、泰素帝、长春碱和 长春新碱和诺维本。其中，紫杉醇通过促进微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促进微管 双聚体形成、阻止其多聚化，导致纺锤体异常并抑制有丝分裂而使细胞阻滞于G-2/M期，进 而诱导细胞凋亡。而长春类生物碱能在受体部位与纺锤微小管蛋白结合，形成高度规则的 结晶体，从而影响微管蛋白装配，使细胞阻滞于G-2/M期，阻断细胞的正常分裂。抗微管类 药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作 用。其副作用主要神经系统毒性、组织局部坏死、脱发、低血压、支气管痉挛、恶心，呕吐或腹 泻、红斑等不良反应。
[0003] 大量的临床研究已经证实，抗微管类药物的疗效/毒副作用与患者体内β -微管 蛋白-III ( β -tubulin-III，TUBB3)、STMN1的表达水平关系密切。
[0004] (1)抗微管药物与 β-微管蛋白-III(e-tubulin-III，TUBB3)
[0005] 细胞内微管蛋白是细胞骨架的重要组成部分，是有丝分裂时纺锤体的基本组成单 位。人类细胞中存在着6种β微管蛋白同型体，其中3型β微管蛋白（β-tubulin-III) 与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系。β -tubulin亚型的选择性表达，最主要 是β-tubulin-III的过表达可减弱紫杉醇与微管相互作用的动力学，从而导致紫杉醇的 耐药性。在细胞系的研究中证明β-tubulin-III的过表达与紫杉醇的耐药性相关，大量临 床研究也支持β-tubulin-III过表达与对紫杉醇的低应答存在相关性。在一项对93例非 小细胞肺癌（NSCLC)患者的研究中，发现β -tubulin-III的表达水平是与无进展生存率（P =0. 04)和总生存率（P = 0. 012)相关的独立因素，显示高表达的β -tubulin-III与长春 瑞滨的耐药性和NSCLC患者的化疗预后不良也有密切关系。因此，β -tubulin-III的表达 水平可能是抗微管类化疗药物的良好预后指标。
[0006] (2)抗微管类药物与STMN1
[0007] STMN1 (Stathmin，又称oncoproteinl8)，其编码的STMN1蛋白通过促进微管的解 聚或阻止微管的聚合从而影响有丝分裂纺锤体的形成。抑制STMN1表达可以干扰恶性肿瘤 细胞的有丝分裂，从而影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。在多种肿瘤细胞系的研究和临床研究 中，STMN1基因的mRNA表达水平与抗微管类化疗的疗效密切相关。STMN1低表达的肿瘤患 者接受长春瑞滨/顺钼治疗的效果较好，中位生存期较长，反之，STMN1高表达的患者接受 长春瑞滨/顺钼的疗效较差。而且，STMN1在肿瘤中mRNA的表达水平与患者预后直接相关， STMN1的表达水平越高，患者的生存率越低，肿瘤发生转移的风险越高。
[0008] (3)持家基因β 2-微球蛋白（B2M)、铁传递蛋白受体（TFRC)和TATA框结合蛋白 (TBP)
[0009] 持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理 状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中 稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量 的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β 2-微球蛋白（B2M)、铁传 递蛋白受体（TFRC)、TATA框结合蛋白（ΤΒΡ)。
[0010] 基于以上基因的表达水平与化疗药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受化疗药 物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制 定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。
[0011] 目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧 光定量PCR法、RNA原位核酸杂交（RISH)以及液相芯片等。其中，RISH主要用于分析组织 或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床 应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、 逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增， 容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对 照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作 为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。针对现有技术存在的上述问题，本发明 申请人: 在项目开发早期申请了的中国发明专利（申请号：200910193801. 3)，但其针对同一样本不 同基因mRNA检测信号的强弱不均衡，从而影响到目标检测基因TUBB3和STMN1的判读，因 此急需对该产品进行改进。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供一种抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯 片检测试剂盒，该检测试剂盒除了可以高灵敏度和特异性地单独或者任意组合并列检测以 下5种目标基因的表达水平：1'耶83、5了1^1、821^?此、了8?，且其中3种内参基因表达检测 更加稳定。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下：
[0014] 一种抗微管类化疗药物疗效相关的基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒，主 要包括：
[0015] (1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序 列和3'端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
[0016] ⑵连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基 序列从5'端到3'端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序 列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性 序列P2包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID N0. 6 - SEQ ID N0. 10中的2条以上、针对 STMN1基因的选自SEQ ID N0. 11- SEQ ID N0. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID N0. 16 - SEQ ID N0. 20 中的 2 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 21 - SEQ ID NO. 25中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条 以上；
[0017] (3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与 目标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5, 3'末端还修饰有生物素； 所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID N0. 31 - SEQ ID NO. 40中的5条以上、针对STMN1基因的选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的5条 以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的5条以上、针对TFRC基因 的选自SEQ ID NO. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形 成二聚体、不存在错配、与PI、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
[0018] 或者，主要包括：
[0019] (1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序 列和3'端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
[0020] (2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基 序列从5'端到3'端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序 列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性 序列P2包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID N0. 6 - SEQ ID N0. 10中的2条以上、针 对STMN1基因的选自SEQ ID N0. 11 - SEQ ID N0. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自 SEQ ID N0. 16 - SEQ ID N0. 20 中的 2 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 21 - SEQ ID NO. 25中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的 2条以上；
[0021] (3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目 标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5 ;所述扩增延伸探针的特异性 序列P4包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID N0. 31 - SEQ ID N0. 40中的5条以上、针 对STMN1基因的选自SEQ ID N0. 41 - SEQ ID N0. 50中的5条以上、针对B2M基因的选自 SEQ ID N0. 51 - SEQ ID N0. 60 中的 5 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID N0. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的 5条以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与PI、 P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和
[0022] (4)标记探针,所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具 有生物素修饰。
[0023] 在其中一个实施例中，所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平检 测液相芯片，还包括有填充序列，包括有：针对TUBB3基因的SEQ ID N0. 81、针对STMN1基 因的选自SEQ ID N0. 82 - SEQ ID N0. 85中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 86 - SEQ ID NO. 89中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 90 - SEQ ID NO. 91中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO. 92 - SEQ ID NO. 93。
[0024] 在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5 - 10个T ;所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
[0025] 本发明的主要优点在于：
[0026] (1)本发明在已有产品的基础上，通过各种探针的设计和组合的进一步优化，除了 具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同 基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定，从而 使检测结果更为准确。
[0027] (2)所设计的各种探针能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间 基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的 组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统，有着操作简易、准确性高、 特异性高的特点。
【具体实施方式】
[0028] 本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提 供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0029] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的【技术领域】 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任意的和所有的组合。
[0030] 实施例1抗微管类化疗药物疗效相关基因表达水平检测液相芯片试剂盒，主要包 括有：
[0031] 一、偶联有支持探针（SP)的微球
[0032] 支持探针由三部分组成，5'端是与微球结合的胺基端，3'端是与支持延伸探针结 合（互补配对）的特异性序列P1，长度为16nt，中间是8个寡聚核苷酸T的间隔臂序列，每 个目标基因选用一种微球，并选用一条支持探针，每种微球具有不同的荧光编码。
[0033] 本实施例中，每个目标基因的支持探针如表1所示：
[0034] 表1不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针（SP)
[0035]
【权利要求】
1. 一种抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒，其特征 在于：主要包括： (1) 与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序列 和3'端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2) 连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基序列从 5'端到3'端依次为：对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对 应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包 括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID NO. 6 - SEQ ID NO. 10中的2条以上、针对STMN1基因 的选自SEQ ID NO. 11 -SEQ ID NO. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 16 - SEQ ID NO. 20中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 21 - SEQ ID NO. 25中的2 条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条以上； (3) 扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目标基 因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5, 3'末端还修饰有生物素；所述扩增 延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID NO. 31 - SEQ ID NO. 40 中的5条以上、针对STMN1基因的选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的5条以上、针对 B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的5条以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不 存在错配、与PI、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
2. 根据权利要求1所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对STMN1基因的选自SEQ ID NO. 82 - SEQ ID NO. 85中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 86 - SEQ ID NO. 89中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 90 - SEQ ID NO. 91中的一条或 多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO. 92 - SEQ ID NO. 93。
3. 根据权利要求1所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：所述特异性序列P1为：针对TUBB3基因的SEQ ID NO. 1、针对STMN1 基因的SEQ ID NO. 2、针对B2M基因的SEQ ID NO. 3、针对TFRC基因的SEQ ID NO. 4、和/或 针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 5。
4. 根据权利要求1所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：所述间隔臂序列为5 - 10个T。
5. 根据权利要求1一4任一项所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平 液相芯片检测试剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
6. -种抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检测试剂盒，其特征 在于：主要包括： (1) 与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5'端的间隔臂序列 和3'端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 5,每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2) 连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针的碱基序列从 5'端到3'端依次为：对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对 应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包 括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID NO. 6 - SEQ ID NO. 10中的2条以上、针对STMN1基因 的选自SEQ ID NO. 11 -SEQ ID NO. 15中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 16 - SEQ ID NO. 20中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 21 - SEQ ID NO. 25中的2 条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 26 - SEQ ID NO. 30中的2条以上； (3) 扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5'端到3'端依次为：能与目标 基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5 ;所述扩增延伸探针的特异性序 列P4包括有：针对TUBB3基因的选自SEQ ID NO. 31 - SEQ ID NO. 40中的5条以上、针对 STMN1基因的选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60 中的 5 条以上、针对 TFRC 基因的选自 SEQ ID NO. 61 - SEQ ID NO. 70中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 71 - SEQ ID NO. 80中的5条 以上；所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、 P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和 (4) 标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生 物素修饰。
7. 根据权利要求6所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对STMN1基因的选自SEQ ID NO. 82 - SEQID NO. 85中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO. 86 - SEQ ID NO. 89中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO. 90 - SEQ ID NO. 91中的一条或 多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO. 92 - SEQ ID NO. 93。
8. 根据权利要求6所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：所述特异性序列P1为：针对TUBB3基因的SEQ ID NO. 1、针对STMN1 基因的SEQ ID NO. 2、针对B2M基因的SEQ ID NO. 3、针对TFRC基因的SEQ ID NO. 4、和/或 针对TBP基因的选自SEQ ID NO. 5。
9. 根据权利要求6所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平液相芯片检 测试剂盒，其特征在于：所述间隔臂序列为5 - 10个T。
10. 根据权利要求6- 9任一项所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平 液相芯片检测试剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO. 81。
【文档编号】C12Q1/68GK104195232SQ201410356999
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】吴诗扬, 罗彩英, 杨惠夷, 何嘉英 申请人:益善生物技术股份有限公司