专利名称：：一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含利钠肽基因的药物，具体的说，是一种可以降低眼压，治疗青光眼的基因药物，及其制备方法。
背景技术：
：青光眼是一种视神经病变，是目前主要致盲原因之一。据统计，每年全世界大约700万人因本病导致失明。尽管青光眼的发病机制尚未完全清楚，但眼压(intraocularpressure,IOP)升高是主要的危险因素之一。因此，降眼压一直是青光眼的主要治疗手段，及时有效地降低眼压可减缓病程及降低对视功能的损害。目前临床应用的降眼压药物均局限在能影响酶活性的小分子化合物，如碳酸酐酶抑制药，或影响受体活性的小分子药物，如前列腺素受体兴奋药、肾上腺素P受体阻滞药、肾上腺素a受体兴奋药和乙酰胆碱受体兴奋药等。由于如何能有效的控制青光眼病人的眼压是青光眼治疗的关键问题所在，目前大多降眼压药存在费用高，疗效不理想，患者依从性和毒副作用等问题。并没有一种非常理想的控制眼压的药物。利钠肽是一种大分子的生物活性肽，包括心房利钠肽(atrialnatriureticp印tide，ANP)，脑利納月太(brainnatriureticp印tide，BNP)禾口C型利納月太(C—typenatriureticp印tide，CNP)。所有利钠肽均通过结合细胞膜上特异性的利钠肽受体(NPR)而发挥作用。已知cGMP(guanosine3，，5，一cyclicmonophosphate)及可增力口目艮组织cGMP的制剂(如一氧化氮供体)可降低眼压。利钠肽能增加细胞cGMP的生成，影响房水生成，因此有降眼压的作用。其作用机制与可溶性鸟苷酸环化酶通路有关。cGMP激活依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-d印endentproteinkinase,PKG)，PKG使能构成运转体或离子通道的特异底物蛋白磷酸化，从而影响其生物效应，减少房水生成。利钠肽可通过激活其在组织中的相应受体参与眼压调节，有明显的降压效果。由于利钠肽可被中性内肽酶水解后清除，所以需反复给药以维持治疗效果，但又由于利钠肽角膜通透性差，只能通过结膜下、玻璃体腔注射进入眼内(前者效差)；而反复结膜下、玻璃体腔注射无临床实用意义，因此利钠肽未能广泛应用于青光眼的治疗。现有技术中，利用利钠肽基因药物治疗青光眼国内外未尚见报道。
发明内容为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种重组质粒，其含有如SEQIDN0.1的核苷酸序列，质粒载体为逆转录病毒或腺病毒；优选的载体选择逆转录病毒，进一步地，优选载体为慢病毒，最优选的载体为pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表达载体。本发明还提供一种药物组合物，它含有权利要求15任一一项所述的重组质粒。本发明还提供制备权利要求6所述药物组合物的方法，克隆含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列，将其与表达载体链接，然后包装成病毒颗粒，再制备成药物制剂，所述表达载3体为pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表达载体。本发明也提供所述的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用，所述药物优选为注射剂。本发明是采用基因治疗的途径，即将利钠肽基因慢病毒表达载体导入大鼠玻璃体腔，我们观察到目的基因的表达高，有明显的降低活体动物眼压的效果，并且不良反应少，成本低廉，效果肯定，为青光眼治疗开创新的思路。以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。图1RT-PCR从大鼠肾脏组织总RNA中合成并扩增CNP基因M:核酸分子量标准；泳道1:RT-PCR产物图2限制性核酸内切酶消化鉴定重组质粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNPM:核酸分子量标准；泳道1，2，3:双酶切pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP质粒；泳道4:pCDFl-MCS2-EFl-copGFP质粒。图3pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP测序结果图4慢病毒包装流程图图5CNP基因在mRNA水平表达的RT-PCR检测图中泳道依次为100bpMarker、质粒阳性对照、重组质粒转染DNAse处理组、重组质粒转染组、空载体转染组和阴性对照。图6检测CNP转染后细胞内cGMP的表达图7放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平图8Tonolab眼压计测量大鼠眼压和真实眼压的相关性图9双眼眼压在不同时间段眼压的比较图，横坐标的时间段1、2、3.....为与表3.2中No.1、2、3对应的时间段图10本发明基因药物注射后大鼠眼压的比较具体实施例方式实施例1CNP基因的扩增、克隆1材料1.1质粒与细胞株l)Lentivectorexpressionsystems(pPACKFlPackagingMix):购自美国SBI公司，由pCDFl-MCS2-EFl-copGFP、pFIV-34N及pVSV-G三个质粒一定比例混合而成。2)293FT细胞株来自美国Invitrogen公司，本实验室保种。1.2工具酶及主要试剂1)TRIZOLReagent、Lipofectamine2000和消化用胰酶(Tyrisin):购自美国Invitrogen公司2)TakaRaOneSt印RNAPCRKit(AMV)和焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC):购自日本TakaRa公司3)质粒大抽试剂盒PureYielcTPlasmidMidipr印System:购自美国Promega公司4)限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自美国MBIFermentas公司5)DNA琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit:购自美国BioBasic公司6)大肠杆菌DH5a:购自北京TIANGEN公司7)DNAmarker:购自美国MBIFermentas公司8)RNA酶抑制剂购自日本TaKaRa公司9)dNTP:购自美国Promega公司10)Tryptone、Yeastextract:购自英国0X0ID公司1.3细胞培养试剂l)DEME培养基购自美国Hyclone公司2)胎牛血清(FBS):购自美国GibicoBRL公司3)胰酶(Trypsin):购自美国GibicoBRL公司4)依地酸二钠(EDTA):购自美国GibicoBRL公司5)青霉素、链霉素为国产注射用药6)二甲基亚砜(DMSO):购自美国Sigma公司1.4试剂配制1.4.1细菌培养基l)LB液体培养基Bacto-tryptone10g，Yeastextract5g，，NaCl10g，蒸馏水溶解、定容至1000ml，高温高压灭菌20min;2)选择性LB液体培养基临用前在灭菌后的普通LB液体培养基中加入100mg/ml的氨苄青霉素贮存液，使其终浓度为100g/ml。3)选择性LB固体培养基在普通LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度为1.5%)，灭菌后冷却至55t:左右时加入氨苄青霉素(终浓度100g/ml)，混匀后倒入己经消毒备用的玻璃培养皿，室温固化后置4t:保存备用。1.4.2碱裂解法质粒抽提试剂1)溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，15psi压力下灭菌15min，4t:保存；2)溶液II:0.2MNaOH，1%SDS，现用现配;3)溶液III:冰乙酸11.5ml，5M乙酸钾(KAc)60ml，ddH2028.5ml。1.4.3DNA电泳缓冲液(TAE)1)50X的储存液pH8.5，Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，Na2EDTA_2H2037.2g，加ddH20定容至1L;2)工作液取50X的储存液100ml加ddH20定容至5L。1.4.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKC1、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04，用HC1调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高压下蒸气灭菌20min，室温保存。51.4.5细胞培养溶液1)细胞培养基①青霉素及链霉素双抗溶液取青霉素及链霉素各100万单位，无菌操作下溶于40ml三蒸水中，分装，置-20°C冰箱保存。②DMEM高糖培养基配置10%的胎牛血清加双抗培养基，置4。C冰箱保存。2)细胞保种液二甲基亚砜与胎牛血清1:9混匀。3)胰蛋白酶/EDTA消化液称取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTA溶解于100ml的Hank's液，于37oC水浴中置20分钟，待完全溶解后，以除菌滤器过滤，经无菌实验检查无菌生长后分装，置4t:冰箱保存。1.5其他试剂均为进口或国产分析纯产品2实验方法2.1CNP基因的获得和扩增2.1.1Norway大鼠肾脏组织总RNA的提取将该步骤所使用的器材预先用0.1%的DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水处理，再按照Invitrogen公司TRIZOL⑧Reagent操作说明进行1)取新鲜正常Norway大鼠肾脏组织约100mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；2)加入lmlTRIZOL，继续研磨，直到组织完全破碎。3)将上述组织的TRIZ0L裂解液转入EP管中，在室温下放置5min;4)在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15sec，室温放置3min后，12，000g(4。C)离心15min;5)取上层水相置于新EP管中，再加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，12，000g(4。C)离心10min;6)弃上清，加lml75X乙醇进行洗涤，涡旋混合，7，500g(4t:)离心5min，弃上清；7)让沉淀的RNA在室温下自然干燥；8)用100illRnase-freewater溶解RNA沉淀，分装后置-8(TC冰箱保存备用。2.1.2扩增CNP基因—、引物设计和合成CNP序列(NM_053750)使用primer5.0软件设计引物，上游引物引入BamHI酶切位点，序列为CNPF:5'-AGGATCCATCGGCACCATGCA-3'，下游引物引入EcoRI酶切位点序列为CNPR:5'-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3'。送上海Invitrogen公司合成。二、扩增CNP基因按TaKaRa试剂盒OneSt印RNAPCRKit(AMV)—步法RT-PCR操作说明进行(该步骤所使用的器材预先用0.1%的DEPC水处理)按下列组成在PCR反应管中配制反应液6Reagent(试齐U)Quantity(用量)10XOnestepRNAPCRbuffer5WMgC12(25mM)10WdNTPmixture(lOmM)5WRNaseInhibitor(40U/l4)1WAMV-OptimizedTaq(5腦)114AMVRTaseXL(5簡)1W上游引物PrimerI(20PM)1Ml下游引物PrimerII(20PM)1Ml肾脏总RNA5WRNasefteeddH2020WTotal50Ml按以下条件在PCR仪进行反应步骤温度rc)时间(min)循环次数逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.2，退火550.5>35延伸721一最后延伸7251取上述RT-PCR产物5iU，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相保存。三、鉴定扩增的CNP基因根据CNP序列(GenbankNM_053750)使用primer5.0软件设计引物，扩增全长CNP基因，RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，结果显示清晰单一的410bp目的条带(图l)，与预期的扩增片段大小完全相符。实施例2构建重组质粒lpCDFl-MCS2-EFl-copGFP空载体和CNP基因PCR产物酶切回收分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切pCDFl-MCS2-EFl-copGFP空载体和CNP基因PCR产物。双酶切反应体系如下，反应条件为37t:水浴4h。BamHI和EcoRI双酶切空载体BamHI和EcoRI双酶切PCR产物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>质粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP双酶切后，O.7%琼脂糖凝胶电泳30min后，精确切割6749bp所在位置凝胶，然后胶回收。PCR产物双酶切后，1.5X琼脂糖凝胶电泳30min后，精确切割410bp所在位置凝胶，然后胶回收。采用BioBasic公司的凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体和PCR产物。2构建pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP质粒2.1CNP基因与pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector连接胶回收后将CNP和pCDFl-MCS2-EFl-copGFP的回收产物使用promega公司T4DNA连接酶做定向连接反应。将连接产物及阳性对照质粒pUC19转化Tiagen公司的感受态细胞DH5a，过程如下1.取一支-80。C保存的100ii1感受态细胞DH5a立即置于冰上解冻。2.向感受态细胞中加入101的连接产物，轻柔吹打混匀后于冰上静置30分钟。3.30分钟后将离心管于42。C水浴锅中热击90秒。4.热击后立即将离心管置于冰上静置5分钟。5.向离心管中加入9001不含抗生素高压灭菌的LB培养基，混匀后于摇床中37°C，150rpm恢复培养2小时。6.将高压灭菌后的固体培养基约100ml重新烧熔，待温度降至5(TC左右时加入5iU的100mg/ml氨苄青霉素，混匀后倒四个平板。7.将恢复培养的细菌液于4000rpm离心2分钟，弃上清，留约100y1，吹打混匀后涂在两个平板上。将PUC19涂一个平板做对照，将灭菌的LB培养基涂一个平板作为阴性对照。在室温静置20分钟，待菌液吸收后于37t:生化培养箱中过夜培养。[cmo]8、质粒提取将过夜培养的平板取出挑克隆，将菌落置于已加入5iU浓度为100mg/ml氨苄青霉素的5mlLB培养基中，在37t:，280rpm摇床中过夜培养。将菌液用碱裂解法提取质粒，试剂的配制及具体提取方法参考分子克隆手册。2.3pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP重组质粒的鉴定1)酶切初步鉴定按以下配制20iU酶切反应体系，置37°C，5h:Reagent(试齐j)_Quantity(用量)重组质粒1lOXBuffer,AI)311ddH201TotalVolume_^质粒双酶切后成为两个线性片段，分别为410bp和6749bp。取上述酶切产物5iU，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的410bp的片段，证明连接产物酶切片段大小正确(图2)。经北京三博远志公司3730测序仪测序验证，测序引物为5'-tcgtttagtgaaccgtcagat-3'。序列经Blast同源性分析，从第一个方框内的起始密码开始到第二个方框内的终止密码为止，克隆得到的序列与GenbankCNP基因(NM_053750)序列相比仅有一处多态性改变，即第310位上G—T，但不影响所编码的氨基酸(丙氨酸)，其他序列完全相同，证明CNP基因克隆成功(图3)。实施例3慢病毒的包装经脂质体Lipofectamine2000介导的pPACKFlPackagingPlasmidMix和表达质粒(空载体pCDFl-MCS2-EFl-copGFP或重组质粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP)共同转染293FT细胞，包装病毒。病毒包装流程图(图4)。病毒的收获、浓縮及滴度的检测293FT细胞转染后48及72h，收获培养基上清。经离心过滤，去除细胞碎片。然后进行超速离心，将沉淀用PBS重悬，即收获了浓縮的含重组质粒的慢病毒(将连接上CNP基因的pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector包装进病毒的蛋白质包壳)FIV-CNP和含空载体的慢病毒(将未连接CNP基因的pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector包装进病毒蛋白质包壳)病毒储存液。将FIV-CNP病毒液和FIV-GFP感染293细胞，病毒原液孔几乎所用细胞均表达GFP，在稀释至第6孔时绿色荧光细胞的数量(<5个)，计算病毒滴度107Tu/ml。实施例4重组CNP基因表达检测—、CNP基因在mRNA水平表达的RT-PCR检测转染后48h的293细胞收集，用Trizol处理后抽提总RNA，使用逆转录试剂盒做逆转录反应得到cDNA，再以cDNA为模板用RT-PCR方法检测CNP在mRNA水平上的表达，反应条件为94°C2min;94°C10s，56.8°C30s，72°Clmin(共35个循环)；72°C10min。反应完毕后，在1.5%琼脂糖凝胶电泳35min同时，用RT-PCR的方法做GAPDH在mRNA水平表达的检测。如图5。"图中泳道依次为100bpMarker、质粒阳性对照、重组质粒转染DNAse处理组、重组质粒转染组、空载体转染组和阴性对照。"二、检测CNP基因转染后cGMP的表达A、体外表达将普通293细胞均匀种在24孔板上，待细胞贴壁且出现正常形态后分别做重组质粒和空载质粒的转染，24h后将转染后细胞的培养基移除，每孔加入200ii1浓度为10—3M的:u-HiHiHI4o34S9IBMX(将IBMX溶于DMEM中)，于37°C，5%C02细胞培养箱中孵育40min，移除IBMX，每孔用200ii18%次氯酸，于冰浴裂解细胞40min;每孔加入40y12mol/L的K2C03，混合均匀，然后将细胞裂解物移入干净无菌的5001离心管中，于3000g离心10分钟，将上清移入另一干净无菌的500离心管中，使用放射性免疫试剂盒检测含目的基因的质粒和空载体对cGMP表达的影响，见图6。(cGMP放射免疫试剂盒购自上海中医药大学同位素室)含CNP基因的重组质粒转染的细胞，其cGMP表达显著增高。B、体内表达放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平1、取材于注射病毒后20天，断颈法处死大鼠(n=6)，摘取眼球，浸入PBS液中。将眼球置于在显微镜下，从视神经做3条巩膜放射状切口，小心取出晶状体及附着其上睫状体，并小心剪除附着的视网膜组织，最后将睫状体剥离，立即放入液氮中保存备用[5]。2、放射免疫法检测从液氮中取出睫状体，放入0.2ml预冷(4度)含lmmol/L的IBMX的50mmol/L醋酸缓冲液中。冰浴下用组织均浆器均浆，取均浆液，用0.2ml无水乙醇洗涤均浆器后，将洗涤液和均浆液混合，静置5分钟，3500转/min离心15分钟，收集上清夜。再用75%乙醇0.2ml清洗离心管内沉淀，混均，3500转/min离心15分钟，将上清夜与第一次收集的上清夜混合，6(TC烘干，称量使治疗组和对照组等量。100醋酸缓冲液溶解烘干等量组织，按放射免疫试剂盒(上海中医药大学同位素室)操作说明检测。实验重复两次。3、放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平结果显示大鼠玻璃体腔注射病毒后4周，治疗组睫状体cGMP水平升高(1.33±0.29pmol/L)，高于对照组(0.76±0.15pmol/L)，差异有统计学意义(P<0.05)(图7)(n=6)。实施例5重组CNP基因药物的制备本发明药物的组成活性物质包含pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP基因的慢病毒[OH2]辅料PBS溶液制备成液体注射制剂，规格l(fTu/ml，分别制备成10ml/支、20ml/支、50ml/支等合适的规格。实施例6重组pCDFl-MCS2-EFl-copGFP/ratCNP降低小鼠眼压实验1实验材料1.1实验动物Wistar大鼠购于四川大学实验动物研究中心。1.2主要试剂放射免疫试剂盒购自上海中医药大学同位素室其他生化试剂均为进口或国产分析纯产品1.3溶液配制1.3.1中性福尔马林缓冲液将福尔马林稀释于PBSpH7.2，终浓度为10%。1.3.20.02M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2-7.6)NaH2P042H200.449g，Na2HP0412H20，6.76g，NaCl8.74g加ddH20定容至1L，高10压灭菌。1.3.3TBS:Tris-HCl缓冲液(0.5M，pH7.6)100ml，NaCl8.5g，定容至1000ml。1.3.40.01M枸橼酸盐缓冲液(ra6.0)1)储存液:A液0.1M枸橼酸钠，29.41g枸橼酸钠溶于1LddH20中;B液0.1M枸橼酸，20.Olg枸橼酸溶于1LddH20中。2)工作液取82mlA液和18mlB液，加900mlddH20定容至1000ml，调整PH值为6.0。1.3.5Mayer，s苏木精苏木精lOOmg，蒸馏水100ml，碘酸钠20mg，硫酸铝铵5g，拧檬酸lOOmg，水合氯醛5g，用蒸馏水溶解苏木精后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、柠檬酸和水合氯醛，过滤后存于4t:冰箱备用。1.3.6盐酸-乙醇分化液浓盐酸lml，75X乙醇99ml。1.3.7DAB:1)储备液(DAB25mg/ml):DAB250mg+PBS10ml，待完全溶解后分装成lml，100iil，50iil，20ii1等，-2(TC，冻存;2)工作液:DAB储备液20ii1+PBS1000ii1+3%H2025ii1。1.4主要实验仪器与设备1.4.l眼压计l)Tonolabtonometer:购自美国ColonialMedicalSupply,Franconia，NH2)微管眼压测量系统由四川大学物理研究所提供1.4.2眼科手术显微镜由六六视觉馈赠2实验方法按照IACUC(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的操作饲养禾口处理实验动物。2.1大鼠眼压测量评估由于啮齿类动物体积小，精确地测量眼压非常困难；而大部分眼压计的设计是用于人或较大动物。因此，精确和方便地测量啮齿类动物眼压非常必要。最近，一种专门用于啮齿类动物的Tonolab眼压计问世。我们采用Tonolab眼压计测量Wistar大鼠眼压，实际眼压的测量采用微管导入前房的方法。所用的操作在上午10:0011:00完成。结果显示大鼠眼压直线回归系数为0.99±0.04(n=10)。Tonolab眼压计读数和真实眼压之间有很好的相关性，Tonolab眼压计可精确地，非侵袭性地检测大鼠眼压(图8)。2.2大鼠基线眼压的测量健康成年Wistar大鼠15只，雌雄不拘，体重150_200g。Tonolab眼压计分别于10:0011:00、12:0013:00、14:0015:00、16:0017:00、18:0019:00、20:0021:00六个时间段，测量大鼠基线眼压。11结果显示在测量的6(16)个时段，大鼠眼压波动于12.6714.20之间(表3.1)。各时间段双眼眼压比较，差异无统计学意义(P=0.220.94)(表3.2，图9)。表3.1大鼠右眼和左眼不同时段的眼压(单位mmHg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3.2双眼眼压在不同时间段的比较(单位mmHg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3大鼠玻璃体腔病毒注射上述测量基线眼压15只Wistar大鼠，麻醉散瞳后，分别用消毒后的10iU(33g)微量推进器吸取FIV-CNP、FIV-GFP各5iil(约5X104个病毒)，选取右眼为治疗组，左眼为对照组，针尖斜面朝上，于大鼠眼球上方赤道部(距角巩膜缘后2mm)斜向后下方进针，从瞳孔直视下观察针尖避免损伤晶状体。治疗组玻璃体腔内注射FIV-CNP5ia，对照组玻璃体腔内注射FIV-GFP5iU。术后双眼涂红霉素眼膏。2.4病毒注射后大鼠眼压的测定于病毒注射后，每天观察大鼠角膜，前房及晶状体等。涂抗生素眼膏一周。一周后每天同一时间(10:0011:00)采用Tonolab眼压计测量眼压，持续三周后处死大鼠。结果显示1只大鼠发生严重眼内感染，另2只大鼠因注射损伤晶状体发生白内障，共12只大鼠纳入实验。纳入的12只大鼠未见明显的角膜、前房炎症反应及其它眼部异常。病毒注射后眼压比较治疗组和对照组的基线眼压(10:0011:00)分别为12.83±0.42mmHg和12.67±0.26mmHg，差别无统计学意义(P>0.05，n=12)。病毒注射后第11天，治疗组眼压开始下降，与对照组相比，差别有统计学意义(P<0.05);第13天开始，治疗组眼压与基线眼压及对照组眼压相比，差别均有统计学意义(P<0.05);之后治疗组眼压持续下降，稳定在一个相对低水平，直至第28天处死。对照组眼压在病毒注射后第8天开始测量一直较基线眼压升高，差别有统计学意义(P<0.05)，而在病毒注射后第25天开始，对照组眼压与基线眼压相比差别没有统计学意义(P>0.05)，直至第28天处死(表3.3，图10)。表3.3病毒注射后大鼠眼压的比较(单位mmHg)天数样本数FIV-CNP组FIV-GFP组尸值01212.83±0.4212.67±0.260.2188d1213.20±0.5213.28±0.55A0.6929d1213.30±0.8413.53±0.86A0.32710d1213.33±1.1513.48±0.69A0.697Ud1212.68±1.1213.52±0.71A0.02212d1212.47±0.9013.67±0.75A0.00713d1211.83±1.13*13.50±0.70A0.00014d1211息0.89*13.40±0.75A0.00015d1211.83±1.18*13.53±0.77AO週16d1211.65±U1*13.50±0.9AO細17d1211.18±0.86*13.37±0.74A0.00018d1211.43±1.01*13.52±0.74A0.00019d1211.30±1.01*13.37±0.90AO細20d1212.03±1.06*13.35±0.74A0.00221d1211.93±0.98*13.48±0.76AO避22d1211.40±0.98*13.25±0.74A0.00123d1211.25±1.09*13.10±0.58AO細24d1211.18±0.86*13.32±0.82A0.00025d1211.27±0.88*12.97±0.43o扁26d1211.17±1.05*12.88±0.57o細27d1211.22±1.00*12.93±0.47o細28d1211.12±0.83*12.82±0.66o細0:基线眼压；*P<0.05:治疗组VS基线眼压；A:P<0.05:对照组VS基线眼压综上，本发明的重组基因药物可通过在体内表达有活性的CNP，增加细胞cGMP的生成，可有效降低眼压，且不良反应少，为治疗青光眼提供了一种新的用药途径，疗效持续，病人依从度好，具有良好的制药应用前景。序列表SEQUENCELISTING〈110〉四川大学华西医院〈120〉一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用13〈130>CD520-08P105289〈160>1〈170>PatentInversiori3.2〈210>1〈211>1243〈212>DNA〈213>C型利钠肽〈400>1cacgctgttttgacctccatag^gattct卿gcccgggcgcgccggatccatcggcac60catgcacctctcccagctgatcgcctgtgccctgctgctcgcgctectctcactccggcc120ctccgaagccaagcccgggaC3CC3CCg皿ggtcccgagaaccccgccagggg郷agct180ggcagagccccaggcagctggtggc皿tcagac皿gactcc郷cggcgg240gggagccaatctcaagggagaccgatcgcgactgcttcgggacctgcgtgtgg3C3CC皿300gtcccgggctgcgtgggctcgccttctgcacgagcacccc皿cgcgcgca360cggc朋c朋g朋gggcttgtcca皿ggctgctttggcctc皿gctggaccggatcggctc420catgagcggtctgggatgtt3gtgC3gCg3attcgcggccgcg皿ggatctgcgatcgct■CCggtgCCCgtcagtgggcagagcgcaratcgcccacagtCCCCg3g皿gttggggggag540gggtcggcaattg雄gggtgcctegag皿ggtggcgcggggt腿ctggg腿gtgatg600tcgtgtectggctccgcctttttcccgagggtggggg卿accgtetete660tcgccgtgaacgttctttttcgc皿cgggtttgccgccag皿C3C3gCtg皿gcttcgag720gggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctecctgaggccgccatccacgccggt780tgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctegg840teagttte朋gctcagtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagccteccteg■actcagccggctctccacgctttgctgaccctgcttgctcaactctecgtctttgtttcg960tttctgtctgcgccgtecagatccaagctgtgacggcgctacgctegacgccaccatgga1020g￡lgCg￡lCg￡lgagcggctgccgccatggagatcgagtgccgcatcaacggcacctg皿cgg1080cgtggagttccagctggtgggcggcgg腿aggcacccccCC3gC3gggCcgcctggacc1140cac朋gattg3g朋3gCtC3g郷ctgg皿cgtcagccctacctggctgggacacgtetg1200teacgttcteccttcggagcgctcatctecacagcggtctgga12431权利要求一种重组质粒，其特征是含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的质粒，其特征是质粒载体为逆转录病毒或腺病毒。3.根据权利要求2所述的质粒，其特征是所述载体为逆转录病毒。4.根据权利要求3所述的质粒，其特征是所述载体为慢病毒。5.根据权利要求4所述的质粒，其特征是所述载体为pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表达载体。6.—种药物组合物，其特征是含有权利要求15任一一项所述的重组质粒。7.—种制备权利要求6所述药物组合物的方法，其特征是克隆含有如SEQIDNO.l的核苷酸序列，将其与表达载体链接，然后包装成病毒颗粒，再制备成药物制剂。8.根据权利要求7所述的方法，所述表达载体为pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表达载体。9.权利要求6所述的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，所述药物为注射剂。全文摘要本发明提供了一种重组质粒，含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本发明还提供了一种药物组合物，它含有所述的重组质粒。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明是采用基因治疗的途径，即将利钠肽基因慢病毒表达载体导入大鼠玻璃体腔，观察到目的基因的表达高，有明显的降低活体动物眼压的效果，并且不良反应少，成本低廉，效果肯定，为青光眼治疗开创新的思路。文档编号C12N15/861GK101724653SQ200810224249公开日2010年6月9日申请日期2008年10月14日优先权日2008年10月14日发明者刘旭阳,曹桂群,闫乃红,马嘉申请人:四川大学华西医院