Rag2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用

Rag2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及RAG2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是对人类威胁最大的疾病之一，相对于其它疾病，肿瘤临床治疗的有效率目 前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入，研究者 对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。基因组测序研究发现，相同病理类型的 肿瘤之间基因突变重复很少；相同类型肿瘤的不同个体之间的基因突变谱差异很大，运是 造成相同病理类型肿瘤具有不同临床表型的生物学基础，也是同类型肿瘤的不同个体对相 同治疗反应很不一样的原因，因此个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效 的手段。个体化治疗致力于寻找可预测特异性治疗应答的疾病特征W改善个体化治疗效 果，因此建立个性化的肿瘤治疗模型是一种简便而直接的手段。
[0003] 肿瘤动物模型的建立是研究致瘤机制、抗肿瘤药物检测和肿瘤分子生物学极其重 要的手段。由于伦理限制、成本高、操作不便等原因，利用与人类接近的灵长类动物进行的 试验是有限的，而且临床上的观察和研究也较为浅显。大鼠由于容易饲养、方便操作、成本 低等优点，是目前生物医学基础和应用的主要模型之一。人源化大鼠模型是指带有功能性 的人类基因、细胞或组织的大鼠模型，运种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代 模型，能够建立可用于移植人类造血组织和人体免疫的动物品系。近年来人源化大鼠模型 已被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景，成为人类疾病研究和 临床前应用研究的重要工具之一。利用大鼠建立各种个性化肿瘤治疗模型，用W具体研究 每个患者自身的情况，W便评价具有抗肿瘤功效的药物和制定有效的治疗方法，是研究发 展的趋势。
[0004] 重组激活基因（recombination-activatinggene,RAG)编码重组激活蛋白，其中 两个重组激活基因RAG1和RAG2所编码的RAG1蛋白和RAG2蛋白构成的复合体蛋白酶参与 了V(Vari油le)基因片段、D值iversity)基因片段和JCJoining)基因片段的基因重组[即 V值)J重排]过程并起着关键的作用。基因的重排是淋己细胞表面标志发生过程中的一个 重要过程，对于细胞成熟后的功能和结构有着重要的作用，因此RAG2基因对于淋己细胞分 化发育十分关键。大鼠重组激活基因2(recombination-activatinggene2,RAG2)位于大 鼠的2号染色体，由3个外显子组成，编码序列位于外显子3中。当RAG2基因被敲除后，大 鼠体内的V值)J重排丧失，T和B淋己细胞分化、发育被完全阻断，导致重度联合免疫缺陷 病。

【发明内容】
阳0化]本发明所要解决的技术问题是如何建立个性化肿瘤治疗模型，进行个性化肿瘤治 疗。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了RAG2基因敲除大鼠在构建肿瘤治疗模 型中的应用。
[0007] 上述应用中，所述RAG2基因敲除大鼠无肿瘤。
[0008] 上述应用中，所述肿瘤来源于人。
[0009] 上述应用中，所述肿瘤可为实体瘤或非实体瘤。
[0010] 上述应用中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可为肝癌、甲状腺癌、直肠癌 和胃癌中任一种。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了构建肿瘤治疗模型的方法。
[0012] 本发明所提供的构建肿瘤治疗模型的方法，包括将肿瘤接种于RAG2基因敲除大 鼠，获得接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，获 得具有所述肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，所述具有肿瘤的RAG2基因敲除大鼠为肿瘤治疗模 型。
[0013] 上述方法中，所述RAG2基因敲除大鼠无肿瘤。
[0014] 上述方法中，所述肿瘤可接种于所述RAG2基因敲除大鼠的前肢蔽窝皮下或背部。
[0015] 上述方法中，所述肿瘤来源于人。
[0016] 上述方法中，所述肿瘤可为组织和/或细胞，具体可为组织，进一步的，所述组织 为实体瘤，所述接种的实体瘤块的体积可为0. 125mm3-0. 5mm3,具体可为0. 18mm3。
[0017] 上述方法中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可为肝癌、甲状腺癌、直肠癌 和胃癌中任一种。
[0018] 上述方法中，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间为30d-90d，具 体地，当所述肿瘤为肝癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为 32d;当所述肿瘤为甲状腺癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可 为60d;当所述肿瘤为直肠癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可 为49d;当所述肿瘤为胃癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为 45d。
[0019] 上文中，RAG2基因敲除大鼠是将SD大鼠的RAG2基因敲除得到的大鼠。所述RAG2 基因敲除大鼠中没有成熟的T淋己细胞和B淋己细胞。所述RAG2基因敲除大鼠的基因型 为RAG2/。
[0020] 实验证明，利用RAG2基因敲除大鼠为载体，移植患者自身的肿瘤组织，成功建立 了具有个性化的人源化RAG2基因敲除大鼠肿瘤治疗模型。与已有的免疫缺陷的小鼠移植 肿瘤模型相比，该治疗模型建立了不同通路异常的肿瘤模型，忠实地模拟了患者自身肿瘤 疾病的情况，可通过每个患者的特点来评价抗肿瘤功效的药物和治疗方法。利用RAG2基因 敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型的方法工序简单，周期短，成瘤率高，费用低的优点，对 于不同种类的肿瘤组织均可W成瘤，接种了肝癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率 为100%，接种了甲状腺癌和直肠癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率均为66. 7%， 接种了胃癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率为33. 3%。接种肝癌肿瘤瘤块的RAG2 基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是32山接种甲状腺癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿 瘤出现的时间是60山接种直肠癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是49山 接种胃癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是45山因此可W广泛被应用于 肿瘤的个性化治疗中。
【附图说明】
[OOW 图1为四种RAG2基因敲除大鼠的测序结果。其中，rag2-WT代表野生型SD大鼠， 红框部分代表EarI酶的识别位点；#4-缺1个碱基代表4号RAG2基因敲除大鼠；#13-缺 2个碱基代表13号RAG2基因敲除大鼠；#15-缺5个碱基代表15号RAG2基因敲除大鼠； #33-缺7个碱基代表33号RAG2基因敲除大鼠。
[0022] 图2为RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的酶切鉴定结果。其中，泳道M为DNA分 子量Marker,泳道1为RAG2+/大鼠（基因型为RAG2 +/)基因组DNA的酶切产物，泳道2为 野生型SD大鼠基因组DNA的酶切产物，泳道3和4均为RAG2/大鼠（基因型为RAG2 / )基 因组DNA的酶切产物，泳道5为阴性对照。 阳02引图3为RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的表达水平的实时巧光定量PCR分析结果。 其中，WT代表野生型SD大鼠，K0代表RAG2 /大鼠（基因型为RAG2 /)。
[0024]图4为RAG2基因敲除大鼠中的T淋己细胞、B淋己细胞、NK细胞和粒细胞的相对 计数。其中，WT代表野生型SD大鼠，K0代表RAG2 /大鼠（基因型为RAG2 /)。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[00%] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 下述实施例中的SD大鼠（野生型SD大鼠）为北京华阜康生物科技股份有限公司 的产品。
[0029] 下述实施例中的AmbionmMESSAGE地継細IRI隣SP6TranscriptionKit为英潍 捷基（上海）贸易有限公司的产品。
[0030] 下述实施例中的肿瘤组织来源于人的肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌。
[0031] RAG2基因敲除大鼠在隔离环境条件下饲养，该环境设施采用无菌隔离装置W保存 无菌或无外来污染动物。隔离装置内的空气、饲料、水、垫料和设备均为无菌，动物和物料的 动态传递须经特殊的传递系统，该系统既能保证与环境的绝对隔离，又能满足转运动物时 保持内环境一致。
[0032] 下述实施例中所用试剂的配制： 阳的3]憐酸盐缓冲液：7. 9g 化C1，0. 2g KC1，0. 24g 皿2?〇4(或 1. 44g 胞2册〇4)，1. 8g K2HPO4,加蒸馈水定容至1L，抑值为7. 4,120°C高压蒸汽灭菌20min后室溫（20-30°C)保 存。
[0034] 实施例1、利用RAG2基因敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型
[0035] 一、RAG2基因敲除大鼠的获得 W36] 大鼠RAG2基因位于大鼠的2号染色体，由3个外显子组成，编码序列位于 外显子3中。RAG2基因敲除大鼠是利用TALEN技术创建，针对大鼠RAG2基因（Gene 10:295953,ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/295953)设计的TALEN勒1 点序列如 下CTAAAGATTCCTGCTACctcccacctcttcgttacCCAGCTACTTGCTCGT，其中左边TALE识别序 列如下：CTAAAGATTCCTGCTAC;右边TALE识别序列如下：ACGAGCAAGTAGCTGG;中间为间 隔序列。针对左边TALE识别序列的重复可变的双连氨基酸残基位点巧巧eatVariant Di-residue，RVD)的序列如下：皿NGNININI順NINGNG皿皿NG順皿NGNI皿。 针对右边TALE识别序列的RVD序列如下：NI皿順NI順皿NINI順NGNI順皿NG 順順。TALEN质粒组装使用化len(增强型）打祀质粒构建试剂盒（北京唯尚立德生物 科技有限公司，产品目录号VK006-05)进行，具体操作参见说明书化ttp://www.v-solid. (3〇111/1:八-3〇11(1/11；17";1^;[163/口壯/1曰16合成试剂盒说明书-2014.5.29.口壯)，获得组装的两 个TALEN表达质粒。通过AmbionmMESSAGEmMACHINE?SP6TranscriptionKit将两个 组装的TALEN表达质粒分别转录合成两条mRNA，将合成的两条mRNA通过显微操作注射到 SD大鼠的受精卵（受精卵为SD大鼠的卵细胞与SD大鼠的精子通过受精获得的），获得含 有合成的两条mRNA的受精卵。将含有合成的两条mRNA的受精卵移植到假孕SD大鼠受体 母鼠体内，待移植了含有