大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药检测领域，具体涉及一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法。
【背景技术】
[0002]糖皮质激素(glucocorticoid，GC)具有广泛的生理作用，调节机体的多种功能。临床常用于抗炎、抑制免疫反应和膜稳定等。GC通过基因组和非基因组两种途径发挥作用，其中，非基因组作用是近30年来才被慢慢认识并重视的，其效应发生迅速，不涉及基因表达和蛋白质合成，但其分子机制尚不明确。
[0003]近期研究表明，GC在伤害性信息的传递及病理性疼痛的发生中充当着重要的角色。文献资料显示，GC在疼痛的外周和中枢神经机制中均参与伤害性信息的调制。背根节神经元是感觉传入的第一级神经元，GC可通过基因组和非基因组两条途径改变初级感觉神经元的兴奋性，从而调节伤害性信息的产生传导。GC在疼痛中枢机制的研究主要集中于脊髓水平，脊髓背角感觉神经元上糖皮质激素受体(glucocorticoid reccptor，GR)可通过调节谷氨酸受体等与疼痛密切相关的神经活性物质受体的功能，增强脊髓背角神经元的兴奋性，从而促成病理性疼痛的产生与发展，这些效应发生慢，为基因组作用。GC能否通过非基因组作用途径快速影响脊髓背角神经元的兴奋性，继而影响伤害性信息的传递，尚不明确。作为重要的胞内信使，Ca2+对神经元的多种生理功能如兴奋性、突触传递以及神经元的发育分化、修复再生等产生决定性影响。GC能否通过调节脊髓背角神经元Ca2+浓度而影响其功能，尚有待实验证明。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是为提供一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，通过该方法可以观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响。
[0005]本发明提供一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，包括以下步骤:
[0006]取出生未满三日的SD乳鼠，经75%乙醇消毒后断头处死，取出脊髓，分离出脊髓背角组织，剥除脊髓外膜，将所述脊髓背角组织剪成小块，转移至离心管中，加入胰蛋白酶置于细胞培养箱内消化；然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，离心后弃上清液；加入NB/B27培养基重悬细胞，接种于激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置3h ;加入1.5ml含青霉素和链霉素的NB/B27培养基；以荧光指示剂负载，置于培养箱内孵育，NB培养基漂洗，再以NB培养基覆盖细胞，激光扫描共聚焦显微镜扫描检测。
[0007]进一步的，所述脊髓背角组织剪成Imm3小块。
[0008]进一步的，所述胰蛋白酶浓度为0.125%。
[0009]进一步的，所述细胞培养箱内消化条件为37°C、5% CO2,消化30min。
[0010]进一步的，所述离心条件为1000r/min离心5min。
[0011]进一步的，所述重悬细胞时NB/B27培养基加入量为200 μ I。
[0012]进一步的，接种的所述激光共聚焦专用皿经多聚赖氨酸和层黏连蛋白双重包被。
[0013]进一步的，所述荧光指示剂为浓度2 ymol/L的Fluo-4/AM。
[0014]进一步的，所述培养箱内的孵育条件为37°C孵育30min。
[0015]进一步的，所述扫描条件为激发波长488nm，发射波长515nm，检测15min，得到I丐荧光图像。
[0016]本发明的有益效果在于:Ca2+作为重要的胞内信使，对神经元的多种生理功能如兴奋性、神经递质的释放、突触传递等产生决定性影响，故细胞内Ca2+浓度变化是细胞功能检测的一项重要指标。本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，可用于观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响，为研究皮质酮对脊髓背角感觉神经元功能的调节及其作用机制创造了条件。
【附图说明】
[0017]图1所示为本发明实施例加入C0RT(1 μmol/L)前脊髓背角神经元的基础荧光图；
[0018]图2所示为本发明实施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神经元荧光图；
[0019]图3所示为本发明实施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神经元量效结果中钙荧光强度曲线变化图；
[0020]图4所示为本发明实施例不同剂量CORT对脊髓背角神经元Ca2+浓度影响的统计图；
[0021]图5所示为本发明实施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神经元信号通路中钙荧光强度变化曲线图；
[0022]图6所示为本发明实施例孵育液中无钙离子时加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神经元信号通路中钙荧光强度变化曲线图；
[0023]图7所示为本发明实施例RU38486(10 μπιοΙ/L)预孵育20min后加入C0RT(1 ymol/L)后的钙荧光强度曲线图；
[0024]图8所示为本发明实施例PTX(100ng/ml)预孵育24h后加入C0RT(1 ymol/L)后的钙荧光强度变化曲线图；
[0025]图9所示为本发明实施例CORT致脊髓背角神经元Ca2+浓度升高作用的药理学特征图。
【具体实施方式】
[0026]下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
[0027]实施例
[0028]本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，包括以下步骤:
[0029]I脊髓背角神经元的培养
[0030]取SD乳鼠(< 3d)，经75%乙醇消毒后断头处死，迅速取出脊髓，在解剖显微镜下眼科刀沿界沟分离出脊髓背角组织，迅速剥除脊髓外膜，将脊髓背角组织剪成小块(约1mm3)，转移至离心管中，加入0.125%胰蛋白酶置于37°C、5% CO2的细胞培养箱内消化30min ;然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，置离心机1000r/min离心5min，弃上清液；加入NB/B27培养基200 μ I重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸和层黏连蛋白双重包被的激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置3h ;加入1.5ml NB/B27培养基(含青霉素、链霉素)。
[0031 ] 2激光共聚焦技术检测神经元Ca2+浓度变化
[0032]将脊髓背角神经元接种在激光共聚焦专用皿中，实验为5组:
[0033]I)对照组；
[0034]2)皮质酮(CORT)组(0.1、1、10 μ mol/L)；
[0035]3)无钙液+CORT组:孵育液为无钙液时，给予CORT (I μ mol/L);
[0036]4)糖皮激素受体阻断剂RU38486+C0RT组:孵育液含糖皮激素受体(glucocorticoi