用于d-二聚体检测的检测卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种检测卡，其包括检测条和外壳，所述检测条包括以下部分：样品结合条，所述样品结合条上具有由两种不同粒径大小的荧光微球标记的抗D-二聚体的第一抗体；包被条，所述包被条上具有检测带和质控带，所述检测带具有抗D-二聚体的第二抗体，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体；和吸水条；所述外壳包括以下部分：卡盖，所述卡盖上设置有加样孔和检测孔，所述加样孔位于所述样品结合条的上侧以暴露出所述样品结合条的部分区域，所述检测孔位于所述包被条的上侧以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域；和底座。本实用新型的检测卡检测灵敏度高，线性范围宽且结构简单，有益于临床应用。
【专利说明】用于D- 二聚体检测的检测卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种用于D- 二聚体免疫检测的检测卡。
【背景技术】
[0002]目前临床常用的方法包括:胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫法、化学发光法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。胶乳增强免疫比浊法虽实现高通量筛选，但由于某些待测物所需的检测灵敏度要求高，导致检测时低值样品CV值过大。酶联免疫法及化学发光法虽可以定量准确，但是对于某些疾病的判定方面其检测耗时过长，大大延误了可能需要的治疗。胶体金免疫层析法操作简单，但只能实现半定量。相比之下，荧光免疫层析法既可以实现快速检测，又能够进行精确定量，为临床应用带来了极大的便利。
[0003]但目前常用的以荧光微球作为标记物的荧光免疫层析法在应用上存在一定的缺陷。大粒径荧光微球检测的线性范围不够，因此高值检测不准确。小粒径荧光微球检测的低端的测值不准确，CV值过大。此外，目前对于基于上述检测方法所开发的检测条和/或检测卡也存在工艺复杂、成本高、灵敏性和准确性差等诸多问题。
实用新型内容
[0004]抟术问题
[0005]目前现有技术中缺乏能够实现快速精确检测D- 二聚体免疫检测的检测卡。因此，需要开发一种具有高灵敏度的D- 二聚体免疫检测的检测卡。
[0006]技术方案
[0007]一方面，本实用新型提供了一种用于D-二聚体免疫检测的检测卡，其特征在于，所述检测卡包括检测条和和包覆所述检测条的外壳，
[0008]其中，所述检测条包括彼此间顺序搭接的以下部分:
[0009]I)具有由两种不同粒径大小的荧光微球标记的抗D-二聚体的第一抗体样品结合条，
[0010]2)具有检测带和质控带的包被条，其中，
[0011]2a)所述检测带具有抗D-二聚体的第二抗体，
[0012]2b)所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和
[0013]3)吸水条；
[0014]其中，所述外壳包括相互扣合的以下部分:
[0015]4)设置有加样孔和检测孔的卡盖，其中
[0016]4a)所述加样孔位于所述样品结合条的上侧，其大小足以暴露出所述样品结合条的部分区域，
[0017]4b)所述检测孔位于所述包被条的上侧，其大小足以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和
[0018]5)底座。
[0019]在一个实施方式中，所述检测条进一步包括用于布置样品结合条、包被条和吸水条的底板。
[0020]在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在10nm至400nm之间
[0021]在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为10nm和 300nm。
[0022]在一个实施方式中，所述检测带和质控带之间的间隔在0.3cm至0.5cm之间。
[0023]在一个实施方式中，所述抗D- 二聚体的第一抗体和所述抗D- 二聚体的第二抗体分别特异性结合D- 二聚体的不同抗原表位。
[0024]在一个实施方式中，所述样品结合条由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制备。
[0025]在一个实施方式中，所述包被条为硝酸纤维素膜。
[0026]有益效果
[0027]与现有技术的其它D- 二聚体免疫检测制品相比，本实用新型的D- 二聚体免疫检测卡具有以下优点:
[0028]两种不同粒径的荧光微球的设计可以同时实现高灵敏度和宽检测线性范围；
[0029]双抗体夹心法的采用进一步提高了检测灵敏度；
[0030]检测卡的结构使得其可以用在相应荧光检测仪中，以满足临床大规模样品检测分析的需要；和
[0031]检测卡结构简单，有益于生产工艺流程的简化和降低生产成本，由此可以降低临床检测的费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1本实用新型的用于D- 二聚体免疫检测的检测卡的示意图。
[0033]图2本实用新型检测卡中检测条的示意图。
[0034]附图标记:
[0035]I检测卡 2-1底板2-7大粒径荧光微球
[0036]2检测条 2-2样品结合条 2-8小粒径荧光微球
[0037]3卡盖2-3包被条
[0038]4底座 2-4吸水条
[0039]5加样孔 2-5检测带
[0040]6检测孔 2-6质控带
【具体实施方式】
[0041]下文中将参照附图来更详细地描述示例性实施方式。所述附图用于图示说明本实用新型，而非对其进行限制。
[0042]图1为本实用新型的用于D- 二聚体免疫检测的检测卡的示意图。
[0043]如图1所示，本实用新型的D- 二聚体免疫检测卡I包括检测条2和外壳，外壳包括卡盖3和底座4，卡盖3上设置有加样孔5和检测孔6。卡盖3和底座4通过彼此相互紧扣将检测条2置于外壳内部。在卡盖3上，加样孔5的大小可暴露出检测条2上样品结合条的部分区域，检测孔6的大小可暴露出检测条2上包被条中检测带和质控带的全部区域。检测条2的结构详述于图2中。
[0044]卡盖3和底座4均可由诸如塑料等材料制成。加样孔5和检测孔6可以为正方形、长方形、梯形、椭圆形、圆形、等形状。加样孔5的纵长可为0.05cm至0.6cm，优选0.1cm至0.5cm。加样孔5的横长可为0.15cm至0.45cm，优选0.2cm至0.4cm。检测孔6的纵长可为0.8cm至2.5cm，优选1.0cm至2.3cm。检测孔6的横长可为1.2cm至2.lcm，优选1.5cm至 1.9cm0
[0045]本实用新型的检测卡使得D-二聚体免疫检测可以在相应的荧光检测仪中进行，由此可实现大批量的样品快速检测，有很重要的临床意义。
[0046]图2为本实用新型的用于D- 二聚体免疫检测的检测卡中检测条的示意图。
[0047]如前所述，检测条2被卡盖3和底座4通过彼此相互紧扣于检测卡I的外壳内部。如图2所示，检测条2包括样品结合条2-2、包被条2-3和吸水条2-4，其中结合条2_2、包被条2-3和吸水条2-4被依次搭接粘贴在底板2-1上。
[0048]样品结合条2-2可同时起到接收和结合样品的作用。相比于传统采用将样品条和结合条独立设计的方法，本实用新型检测卡中的检测条采用将样品条和结合条一体化的设计，从而大大简化了生产工艺及流程。在一个实施方式中，样品结合条2-2由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制备。
[0049]样品结合条2-2上进一步包被有粒径大小不同的荧光微球标记的一种抗D- 二聚体的抗体。大粒径荧光微球2-7的粒径大小范围在300nm至500nm之间。在一个实施方式中，大粒径荧光微球2-7的粒径大小为300nm。小粒径荧光微球2_8的粒径大小范围在50nm至150nm之间。在一个实施方式中，小粒径焚光微球2_8的粒径大小为lOOnm。大粒径焚光微球2-7标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求，而小粒径荧光微球2-8标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域。因此，本实用新型的检测条可满足高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
[0050]包被条2-3上具有检测带2-5和质控带2-6。检测带2_5上具有另一种抗D- 二聚体的抗体。与样品结合条2-2上的抗体相比，检测带2-5上的抗体特异性结合不同的D- 二聚体的抗原表位。质控带2-6固定有抗鼠IgG的抗体，其用作质控和对照。检测带和质控带之间的间隔在0.2cm至0.6cm之间，优选0.3cm至0.5cm之间。包被条2_3可由诸如硝酸纤维素膜等材料制成。
[0051]吸水条2-4与包被条2-3搭接。吸水条2-4可由诸如棉绒、玻璃纤维等材料制成。
[0052]实施例
[0053]以下实施例用于说明本实用新型。
[0054]下述实施例中，所述D-二聚体第一抗体、D-—聚体第二抗体、抗鼠IgG抗体、荧光微球、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、TWeen-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
[0055]所述应用两种不同粒径荧光微球检测D- 二聚体的荧光免疫层析检测条的制备方法为:
[0056]I)样品结合条的制备
[0057]A、样品结合条的预处理
[0058]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入样品结合条处理液(含有1% BSA和0.1%Tween-20的0.1Μ，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
[0059]B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
[0060]将D- 二聚体第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为 2mg/ml-5mg/ml。
[0061 ] 使用0.05M，ρΗ4.5-5.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤50_150nm的小粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为1: 8至1: 60，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0062]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤300_500nm的大粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为1: 20至1: 80，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0063]将上述标记第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1: 10到10: I的比例进行混匀，即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
[0064]C、样品结合条的制备
[0065]将步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球混合物使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0066]2)包被条的制备
[0067]A、检测带的制备:将D- 二聚体第二抗体以0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液4°C透析过夜，使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将透析后的D- 二聚体第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0068]B、质控带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以0.8 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0069]C、包被条的制备:用封闭液(含有1-10% BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜封闭1_2小时，取出后置35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。
[0070]3)检测条的组装
[0071]在湿度小于30%，温度20_30°C条件下进行检测条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品结合垫、包被条及吸水条，重叠区域的重叠长度为1_3_。在包被条粘覆底板时，检测带的位置靠近样品结合条，质控带的位置靠近吸水条。吸水条为高强度吸水纸。组装好后进行裁剪，形成宽度为0.2cm-lcm的检测条。
[0072]4)检测卡的组装
[0073]在湿度小于30%，温度20_30°C条件下进行检测卡的组装。将上述检测条置于塑料底座的中间位置，使检测条的底板与塑料底座相连，并扣合塑料卡盖。卡盖上设置有加样孔和检测孔，加样孔开口于样品结合垫的上侧，暴露出样品结合垫的部分区域，检测孔开口于包被条的上侧，暴露出检测带和质控带的全部区域。
[0074]5)校准品及待检样品的测定
[0075]将100 μ I的标准品或者待检样品加入到检测卡的加样孔，进行免疫层析反应，10-15分钟后将检测卡置于专门的荧光检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
[0076]本实用新型所提供的应用两种不同粒径荧光微球定量检测D- 二聚体的荧光免疫层析检测条兼顾了低值灵敏度和检测的线性范围，且可以实现快速、单人份定量检测，加之体积小、易于携带和保存，为临床使用提供了极大便利。另外，相比传统的检测D-二聚体的含有样品结合条、结合条、包被条、吸水条四个部分的荧光层析检测条，本实用新型所提供的检测条仅含有样品试剂条、包被条、吸水条三个部分，因此其更加简化，制备方法更加简单，可以实现批量生产，有利于大规模推广应用，具备广阔的市场前景。
[0077]以上实施例仅仅是为了清楚地说明所做的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上做出其它改进仍处在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于D- 二聚体检测的检测卡，其特征在于，所述检测卡包括检测条和和包覆所述检测条的外壳， 其中，所述检测条包括彼此间顺序搭接的以下部分:1)具有由两种不同粒径大小的荧光微球标记的抗D-二聚体的第一抗体样品结合条， 2)具有检测带和质控带的包被条，其中， 2a)所述检测带具有抗D-二聚体的第二抗体， 2b)所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和 3)吸水条； 其中，所述外壳包括相互扣合的以下部分: 4)设置有加样孔和检测孔的卡盖，其中 4a)所述加样孔位于所述样品结合条的上侧，其大小足以暴露出所述样品结合条的部分区域， 4b)所述检测孔位于所述包被条的上侧，其大小足以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域，和 5)底座，其中所述底座与所述卡盖将所述检测条彼此扣合在内部。
2.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述检测条进一步包括用于布置样品结合条、包被条和吸水条的底板。
3.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在10nm至400nm之间。
4.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为10nm和300nm。
5.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述检测带和质控带之间的间隔在0.3cm至0.5cm之间ο
6.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述抗D-二聚体的第一抗体和所述抗D-二聚体的第二抗体分别特异性结合D- 二聚体的不同抗原表位。
7.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述样品结合条由玻璃纤维素膜或者聚酯月吴制备。
8.根据权利要求1的检测卡，其特征在于，所述包被条为硝酸纤维素膜。
【文档编号】G01N33/543GK204228713SQ201420674146
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】刘勇, 王里奇, 宋小力, 岳洋, 金凤, 李鼎锋, 戈军 申请人:江苏达骏生物科技有限公司