异二聚体蛋白结合组合物的制作方法

专利名称：：异二聚体蛋白结合组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来源于免疫球蛋白的异二聚体蛋白结合组合物，以及制备这种异二聚体蛋白结合组合物的方法及其应用。更特别地，本发明的方法涉及通过替换IgGFab结构域内的重链与轻链之间的序列，以相对于抗原结合结构域再调整(reorient)Fc结构域，并提供更多的、可用的关键性结合位点，来制备异二聚体蛋白结合组合物以最大化免疫效应因子功能，同时保持抗原结合。背景和相关技术由于抗体的特异性结合特性和高稳定性，使其在研究和诊断中应用已经几十年了，而且最近已将其用于疾病的治疗。最初是通过融合选择的B细胞系与无限增殖的骨髓瘤细胞系以生产杂交瘤来产生单克隆抗体，杂交瘤是只分泌选择的B细胞无性系的选择的抗体种类的无限增殖细胞。应用重组DNA技术能产生生产抗体的新方法以及设计新的抗体结构。在结构上，每个抗体都由两个相同的"重"链与两个相同的"轻"链的相互作用形成，其中所有的都结合以形成Y形分子(重链跨越整个Y，轻链只跨越两个臂)。免疫球蛋白G抗体分子包含决定抗原结合的互补决定区(CDR),决定效应因子功能的恒定区和构架区。各种恒定区可介导一整套的不同生物学作用。变态反应，例如，紧接着IgE结合，而IgM结合可导致补体系统的激活。根据Y单元的数量和重链的类型，抗体可以分成5类IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。任何抗体的轻链可以分为K(k)或入(l)类型(多肽的分子特征的一种描述)；但是，重链决定每个抗体的亚类。IgG,IgM,IgA,IgD和IgE的重《连分别称为y，P,a,A和&。最普通使用的抗体是IgG，其可以被蛋白水解酶木瓜蛋白酶裂解成3个部分，2个F(ab)区域和1个Fc，或被蛋白水解酶胃蛋白酶裂解成2个部分，1个F(ab')2和1个Fc。F(ab)区域包括抗体的"臂"，其对抗原结合是关键的。Fc区域包括恒定区的CH2和CH3结构域，其组成抗体的"尾巴"，并在免疫应答中起作用，而且作为有用的"把手"用于在一些免疫化学方法中对抗体进行操作。抗体中F(ab)区域的数量，与它的亚类一致，决定抗体的"价"(不严格地讲，"臂"的数量，抗体利用该臂结合它的抗原)。因此，抗体结构可包括任何蛋白质或肽，该蛋白质或肽包括含有免疫球蛋白分子的至少一部分的分子，如但是不局限于重链或轻链的至少1个CDR或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其任何部分。抗体片段可包括被称为Fab的免疫球蛋白分子的片段，其包括使用蛋白酶木瓜蛋白酶裂解抗体产生的CDR抗原结合位点，木瓜蛋白酶在Y形抗体分子的"铰链"区域切割产生2个Fab片段。抗体可包括或源自于任何哺乳动物，如但是不局限于人类，小鼠，兔，老鼠，啮齿类动物，灵长类动物，或其任何组合。结合细胞表面靶的许多治疗性IgG抗体，依赖于在邻近的细胞同时结合Fc受体(FcR)，以便实现它们的全部治疗可能性。这是因为FcR和可导致效应因子功能如抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)或抗原表达细胞的吞噬作用。然而，由于在体外ADCC分析中对更多抗体进行了评估，变得愈加明显的是，在存在FcR表达效应细胞时，一些抗体可显示与靶(抗原表达)细胞系结合较好，而不引起靶细胞的细胞毒性。虽然可以想象其他可能的解释，但是很可能，对于至少一些抗体，当这些抗体与它们的细胞表面抗原结合时，这些抗体上的FcR结合位点对于邻近细胞上的FcR可能不是物理上能到达的(图1)。目前的数据和模型表明，相对于Fab结构域，Fc结构域需要弯曲大约90。以适应绞链区中的FcR结合。对于取向与细胞表面"平行"的抗体，当与抗原结合时，假定这种显著的重新组合没有来自原生质膜或某些其它分子的位阻是不可能的，特别是如果抗原是刚性的而且不能"形成波形"。因为同样的原因，抗体上的Clq结合位点对于Clq是不可能到达的，Clq是经典补体固定通道的第一个部分，其导致缺乏补体裂解活性。IgG抗体是柔韧性分子，能在分子内的几个位点弯曲，特别是绞链区。已经报道抗体也进^"了Fab结构域相对于Fc结构域的^L曲/转向。尽管这种扭曲/转向能力可能影响邻近细胞上的FcR对FcR结合位点的可及性，这种移动性是有限的，而且因此不可能充分地提供任何FcR能到达的FcR结合位点。因此，尽管假定的抗体对想要的细胞表面抗原具有高的亲合力和特异性，它的全部治疗可能性仍然是有限的，这是由于如果它紧接着结合抗原的定位则没有促进Fc介导的募集效应因子的功能。这里描述的发明提供了解决对于这类抗体的这种问题的方法。发明概述本发明是一种异二聚体蛋白结合组合物，其具有免疫球蛋白分子的重链和轻链，其中异二聚体蛋白结合组合物具有用轻链序列替换的重链序列，和用重链序列替换的轻链序列。以下述方式结合细胞表面(或者不溶性的)抗原的抗体不具有充分利用它们固有的募集参与ADCC,FcR介导的吞噬作用和补体裂解的效应因子的功能，上述的结合方式指不能使所述抗体的FcR结合位点达到邻近细胞上的FcR，或不能使所述抗体的Clq结合位点达到可溶性Clq补体蛋白质。这里描述的发明提供了一种通过重新调整FcR结合结构域和Clq结合结构域相对于抗原结合结构域的相对位置来解决这种问题的方法。其通过替换抗体(Ab)的重链与轻链之间的氨基酸序列，在保留抗原结合结构域的结构的同时把其余的Ab分子定位于非常不同的位置。能通过重链与轻链之间替换来实现本发明的序列的例子包括a)重链的全部Fd結枸域(Vh-CHl)和全部轻链(VL画Cl),b)重链可变区(vh)和轻链可变区(VL),和c)Vh的互朴决定区(CDR)和Vl的CDR。相反地，也可用于修饰其FcR结合位点和Clq结合位点是相对容易达到的Ab，以使这些结合位点变得不易达到，例如，以便不引起效应因子发挥功能。这也通过上述的、相同类型的序列替换方法来实现。因此，根据本发明为了重新调整Fc结构域相对于抗原结合结构域的定位，将来自免疫球蛋白的重链和轻链的不同亚型的序列在特定Ab的重链与轻链之间替换。已具有替换的这些序列的、适当制备的Ab变体，将保留抗原结合亲合力和特异性，但是具有相对于抗原"翻转(flipped)"的Fc结构域。至于细胞表面抗原，Fc结构域的这种新的定位可能产生Ab的FcR结合位点的较差可及性(pooraccessibility)与FcR结合位点的较好可及性之间的差异(图2B)。可及性问题可能是由于原生质膜或相邻分子的干扰，使Ab不能呈现必要的构象以暴露FcR结合位点。此外，本发明允许通过混合和搭配来自不同IgG同种型(例如，IgGlIgG2，IgG3或IgG4)或甚至不同Ig类(例如，IgA,IgD,IgG，IgE，或IgM)的Fc结构域，来进行另外的调整(tailoring)。另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码前述的异二聚体蛋白结合构建体的多核苷酸，和至少一个指定的序列、结构域、其部分或其变体。本发明更进一步地提供了包含这种核酸分子的重组载体，含有这种核酸和/或重组载体的宿主细胞，和制备和/或使用这种核酸，载体和/或宿主细胞的方法。本发明还提供了一种用于在宿主细胞中表达这种异二聚体蛋白结合构建体的方法，包括如在这里描述的条件下培养宿主细胞，其中至少一个这种异二聚体蛋白结合构建体以可检测的和/或可回收的量表达。宿主细胞可以选自COS-1，COS-7，HEK293,BHK21,CHO,BSC-1，HepG2，Ag653,SP2/0，HeLa,骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任何衍生物，无限增殖或转化细胞。还提供了一种用于生产至少一个这种异二聚体蛋白结合构建体的方法，包括在体外，体内或原位的条件下翻译编码核酸的构建体，以便异二聚体蛋白结合构建体以可检测的和/或可回收的量表达。本发明还提供了至少一种组合物，其包含编码这里所述的核酸和/或蛋白质的本发明的分离的异二聚体蛋白结合构建体，和合适的载体或稀释剂。载体或稀释剂可以是药学上可接受的，根据已知的载体或稀释剂。组合物同时可包括至少一种另外的化合物、蛋白质或组合物。本发明更进一步地提供了一种方法或组合物，其用于施用治疗有效量的本发明异二聚体蛋白结合构建体，来在相关的状况之前，之后或期间，调节或治疗细胞，组织，器官，动物或患者中的至少一种疾病状况，如本领域已知的和/或如这里所述的。本发明还提供了至少一种用于传递治疗或预防有效量的至少一种本发明的异二聚体蛋白结合构建体的组合物、装置和/或方法。本发明更进一步地提供了至少一种异二聚体蛋白结合构建体的方法或组合物，用于诊断在相关状况之前，之后，或者期间，本领域已知的和/或这里描述的，细胞，组织，器官，动物或患者中的至少一种疾病状况。还提供了一种医学装置，其包括至少一种本发明的异二聚体蛋白结合构建体，其中该装置适于通过至少一种选自下列的模式来接触或施用抗体构建体胃肠外，皮下，肌内，静脉内，关节内，支气管内，腹内，嚢内，软骨内，腔内，体腔内，小脑内，脑室内，结肠内，子宫颈内，胃内，肝内，心肌内，骨内，盆腔内，心包内，腹膜内，胸膜内，前列腺内，肺内，直肠内，肾内，视网膜内，脊柱内，滑膜内，胸内，子宫内，膀胱内，快速注射，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，或经皮肤。还提供了一种用于人类药物或诊断应用的制品，包括包装材料和容器，该容器含有溶液或冻干形式的至少一种本发明的分离的异二聚体蛋白结合构建体。该制品任选地可包括容器作为胃肠外，皮下，肌内，静脉内，关节内，支气管内，腹内，嚢内，软骨内，腔内，体腔内，小脑内，脑室内，结肠内，子宫颈内，胃内，肝内，心肌内，骨内，盆腔内，心包内，腹膜内，胸膜内，前列腺内，肺内，直肠内，肾内，视网膜内，脊柱内，滑膜内，胸内，子宫内，膀胱内，快速注射，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，或经皮肤传递装置或系统的部分。还提供了一种用于生产至少一种本发明的分离的异二聚体蛋白结合构建体的方法，包括能以可回收的量表达抗体的宿主，转基因动物，转基因植物或植物细胞。本发明更进一步地提供了通过上述方法来生产至少一种异二聚体蛋白结合构建体。本发明更进一步地提供了这里描述的任何发明。附图简述在附图中，其构成本说明书的一部分图1描述了抗原的移动性和Ab的定位是如何影响Ab与细胞表面抗原与邻近细胞上的FcR的同时结合。图2显示了Ab的重链与轻链之间替换序列的影响。Fd=HC的VH-CH1结构域。图3显示了未经修饰的Ab的相关氨基酸序列与本发明的经修饰的Ab相比较。氨基酸以单字母代码表示。来源于HC的氨基酸以大写字母表示，来源于LC的氨基酸以小写字母表示。"X"标记了链交换(crossover)的点。图4显示了通过用涂有未经修饰的Ab或阴性对照Ab的抗原结合区特异性的mAb(C508或C585)的平板，孵育来自转染细胞的细胞上清液来荻得结合数据。用经纯化的未经修饰的Ab作为标准，使用抗人FcELISA,来预先测定细胞上清液中未修饰的与经修饰的Ab的浓度。发明详述A.定义技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文中另外要求，单数术语将包括复数，复数术语将包括单数。通常，这里描述的细胞与组织培养，分子生物学，蛋白质和寡或多核苷酸化学作用和杂交方面和技术中使用的术语是本领域熟知的而且常用的。标准技术用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养和转化(例如，电穿孔法，脂质转染法)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域普通进行的，或如这里所述。上述技术和方法通常根据本领域熟知的常规方法进行，而且描述于引用和论述的各种普通的和更特异性参考文献中。(参见，例^t口，Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989,其引入这里作为参考。)这里描述的分析，合成有机，医学和药物化学的实验方法和技术方面使用的术语，是本领域熟知和普通使用的那些术语。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备，制剂和传递以及患者的治疗。除非另作说明，本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域中通常使用的含义。如用于本申请，下列单词或短语具有以下含义"抗体"，"Ab"或"抗体肽"指完整的抗体，或其结合片段，其与完整的抗体竟争特异性结合。结合片段通过重组DNA技术，或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。结合片段包括Fab，Fab'，F(abl)2,Fv和单链抗体。除了"单特异性"或"双功能"抗体之外，抗体理解为具有它的每个等同结合位点。当过量的抗体降低至少大约20%,40%,60%或80%，而且更通常地，大于大约85%与反受体结合的受体的数量时(如体外竟争性结合分析中测定的)，抗体基本上抑制受体对反受体的结合。此处所述的"异二聚体蛋白结合组合物"；"经修饰的Ig分子"；或"替换的结构域抗体构建体"指免疫球蛋白("Ig")分子，其不同于天然存在的Ig分子，因为修饰的抗体具有一个或多个与轻链上的结构域交换的重链结构域和/或一个或多个与重链的结构域交换的轻链；其中替换的结构域可以与原始的抗体同类或者是不同的Ig种类。修饰的Ig分子可以，例如，使用以选择的阵列排列并在细胞中表达的编码Ig结构域或其部分的多核苷酸，通过常规的遗传重组产生。可选择地，修饰的Ig分子可以使用多肽合成的传统技术合成。Ig分子可以是IgA(其包括IgAl和lgA2),IgM,IgG，IgD或IgE分子。如这里使用的，"恒定区结构域"或"恒定结构域"指Ig分子的恒定部分内的结构域，包括Cl,CHI，铰链，CH2，CH和CH4。如这里使用的，"可变区结构域"或"可变结构域"指Ig分子的部分，其赋予Ig对特定抗原的特异性。如这里使用的，"抗原"指能与免疫球蛋白分子的抗原结合区结合或能引起免疫应答的物质。如这里使用的，"抗原"包括，但不限于，抗原决定簇，半抗原和免疫原。术语"抗原表位"包括能与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。抗原表位决定簇通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面组组成，而且通常具有特异性的三维结构特性，以及特异性的电荷特性。当解离常数为lmM,优选100nM,最优选10nM时，认为抗体能特异性地结合抗原。如这里使用的，"载体"指能在宿主细胞中传递，优选表达，一个或多个感兴趣的基因或多核苷酸序列的构建体。载体的例子包括，但不限于，病毒载体，棵DNA或RNA表达载体，与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体，压缩在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，如生产细胞。如这里使用的，"多核苷酸"或"核酸"指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，而且除非另外限定，包含以与天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有说明，特定的核酸序列任选地包括互补序列。多核苷酸序列可以编码免疫球蛋白的可变和/或恒定区结构域。如这里使用的术语"分离的多核香酸"将指基因组，cDNA，或合成来源的或其一些组合的多核苷酸。根据它的来源，"分离的多核苷酸"(1)与其中天然存在"分离的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分不相关，(2)可操作地与天然不连接的多核苷酸连接，或(3)不作为较大序列的的部分天然存在。如这里使用的，"药学上可接受的载体"包括任何材料其，当与Ig联合时，允许Ig保留生物学活性，而且不与个体的免疫系统反应。例子包括，但不限于，任何标准药学载体如磷酸盐緩冲盐水溶液，水，乳剂如油/水乳胶，以及各种类型的湿润剂。用于气雾剂或肠胃外给药的优选稀释剂包括磷酸盐緩沖盐水或正常(0.85%)盐水。如附带的权利要求中使用的，"a"指至少一个，而且可以包括复数。如这里使用的术语"可操作地连接"，指在容许它们以计划的方式发挥作用的关系中的位置。调控序列与编码序列"可操作地连接"，是连接。如这里使用的术语"调控序列"指影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。这种调控序列的性质根据宿主生物体而不同，在原核生物中，这种调控序列通常包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，这种调控序列通常包括启动子和转录终止序列。术语"调控序列"意图包括，至少，其存在对表达和加工必不可少的所有组件，而且还可以包括其存在是有利的另外的组分，例如，前导序列和融合伴体序列。如这里使用的，20种常规的氨基酸和它们的缩写遵循常规的应用。组成本发明的修饰抗体的氨基酸常常缩写。氨基酸命名可以如本领域熟知的，通过它的单字母代码，3字母代码，名称，或3核苷酸密码子来命名氨基酸进行命名(参见，Alberts,B.,etal.,MolecularBiologyofTheCell,3rdEd.,GarlandPublishing,Inc.,NewYork,1994)。如应用于多肽，术语"基本相同"指两个肽序列，当进行最佳序列比对时，具有至少80%序列同一性，优选至少90%序列同一性，更优选至少95%序列同一性，最优选至少99%序列同一性。优选地，不相同的残基位置由于保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的互换。例如具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺的侧链的氨基酸是天门冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和曱硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸和天门冬酰胺-谷氨酰胺。如这里讨论的，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中较少的变异是期待的，因为只要氨基酸序列中的变异保持在至少75%,更优选至少80%,90%,95%和最优选99%，都是本发明所包含的。尤其是，保守氨基酸取代是期待的。保守性取代是发生在侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。遗传编码的氨基酸通常划分成以下家族(1)酸性的=天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性的=赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性的=丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电的极性的=甘氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。更优选的家族是脂肪族-羟基=丝氨酸，苏氨酸；含酰胺的=天冬酰胺，谷氨酰胺；脂肪族=丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；芳香族的=苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸。例如，期待用异亮氨酸或缬氨酸独立的取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸是合理的，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸进行相似的取代将对得到的分子的结合或特性没有重要影响，特别是如果取代不涉及骨架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽，可以通过分析多肽衍生物的特异性活性很容易地确定。这里详细描述了分析方法。本领域的普通技术人员可以很容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基末端存在于结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过把核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或私有的序列数据库进行比较来确定。优选地，计算机化的比较法用于确定序列基元或预测蛋白质构象结构域，其存在于已知结构和/或功能的其他蛋白质中。确定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。(Bowieetal.Science253:164(1991))。因此，上述例子i正明了本领域的技术人员可以识别序列基元和结构构象，其用于限定本发明的结构和结构域。优选的氨基酸置换是那些置换，其:(l)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变结合亲合力用于形成蛋白质复合物，(4)改变结合亲合力，和(4)赋予或修饰这种类似物的其他物理各种^变蛋白。例如:可:在天然存在的^列中l优选在开;成分子间接触的结构域外的多肽部分中)进行一个或多个氨基酸置换(优选保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换基本上不会改变亲本序列的结构特性(例如，取代氨基酸将不会倾向于打断亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他种类的二级结构)。(Creighton,Ed.，Proteins,StructuresandMolecularPrinciplesW.H.FreemanandCompany,NewYork1984;C.BrandenandJ.Tooze,eds.JntroductiontoProteinStructureGarlandPublishing,NewYork,NY1991;Thorntonetat.Nature354:1051991,中描述了本领域公认的多肽的二级和S三级结构的例子，其引入这里作为参考。)术语患者包括人和兽医个体。B.抗体结构基本的抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条"轻"链(大约25kDa)和一条"重"链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括一个大约100到IIO或更多氨基酸的可变区，其基本上负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定了一个恒定区，其基本上负责效应因子功能。人轻链分为K和入轻链。重链恒定区分为w,5,y,oc和s,并把抗体的同种型分别限定为IgM,IgD，IgG，IgA和IgE。每条y重链恒定区包括cH1，铰链，ch2和ch3结构域，y-3中的铰链结构域由4个不同的外显子编码。(MorrisonandOi"ChimericIgGenes"inImmunoglobulinGenespp.259-274Honjoetal.eds.,AcademicPressLimited,SanDiego,CA1989)。在轻链和重《连中，可变区和恒定区通过一个大约12个或更多氨基酸的"J"区连接，重链还包括一个大约超过10个氨基酸的"D"区。(通常参见FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,NY1989)(以其全部内容引入这里用于各种目的)。每对轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点是相同的。链都显示相对保守的构架区(FR)的相同的通用结构，其由3个高度可变的区域，也称为互补决定区或CDR连接。来自每对的两条链的CDR通过构架区定位，使其能与特异性抗原表位结合。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包括结构域FR1，CDR1,FR2，CDR2,FR3，CD和FR4。氨基酸指派到每个结构域与ImmunologicalInterest的蛋白质的Kabat序歹'J定义一至丈(NationalInstitutesofHealthBethesda,MD1987and1991;Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196:901-9171987;Chothiaetal.Nature342:878-8831989)。双特异性或双功能抗体是人工的杂合抗体，其具有两对不同的重/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可通过各种方法产生，包括杂交瘤融合或连接Fab'片段。(参见，例如，Songsivilai&LachmannClin.Exp.Immunol.79:315-32119%;Kostelnyetal.J.Immunol.148:1547-15531992)。与常规抗体的生产相比，双特异性抗体的生产可以是相对劳动密集的方法，而且双特异性抗体的产量和纯度通常较低。双特异性抗体不以具有单个结合位点的片段的形式存在(例如，Fab,Fab和Fv)。C.本发明的抗体本发明具体地涉及对抗体分子进行基因工程操作以产生修饰的抗体，其具有与轻链上的结构域交换的一个或多个重链结构域和/或与重链结构域交换的一个或多个轻链结构域，以便相对于抗原结合结构域重新调整Fc结构域。根据本发明，提供了通过替换一个或多个免疫球蛋白恒定结构域，在抗体的恒定区形成轻链和重链，把许多天然的或修饰的免疫球蛋白(Ig)恒定结构域用于修饰抗体与Fc受体相互作用的能力方面的特性的方法。本领域的技术人员可以使用标准的重组DNA方法和/或DNA合成，来制备编码特定Ab的重链和轻链序列的任何组合的基因，只要那些Ab的氨基酸序列已经确定。有各种亚型的序列，其可以在特定Ab的重链与轻链之间进行替换，以便相对于抗原结合结构域重新调整Fc结构域。例子包括重链Fd和整个轻链(图2A)-制备一条VL-CL-hg-CH2-CH3重链与一条VH-CH1轻链将需要最小量基因工程操作。应该保留Fd与轻链之间接触的所有点。V区(图2A)-替换重链与轻链可变区以制备一条VL-CHl-hg-CH2-CH3重链与一条VH-CL轻链，将只需要较少的基因工程操作，来提供V结构域与相邻的C结构域之间新的接触面。CDRs上的这些抗原结合基序理论上可以在链之间进行替换，尽管保留抗原结合将可能需要对CDRs侧翼的序列进行大规模的工程操作。适当制备的Ab变体，其已经具有替换的这些序列，将保留抗原结合亲合力和特异性，但是具有相对于抗原"翻转"的它们的Fc结构域。至于细胞表面抗原，Fc结构域的这种新的定位可能产生Ab的FcR结合位点的较差可及性与FcR结合位点的较好可及性之间的差异(图2B)。可及性问题可能归因于，由于原生质膜或相邻分子的千扰，Ab不能呈现必要的构象以暴露FcR结合位点。这些Ab变体还可以提供抗可溶性抗原或病毒的优点，例如，大的耙，其中FcR结合位点或Clq结合位点被来自除了抗原表位以外的耙部分的位阻所封闭。这些Ab上的FcR结合位点或Clq结合位点的不可及性，将影响免疫复合物的FcR介导的清除或靶的补体介导的裂解。确定氨基酸序列中从一条链跨越到另一条链的准确点有一定程度的弹性。VL-CL-hg-CH2-CH3重链与Vh-Ch1轻链的两个例子显示于图3中。显示与胂瘤细胞较好结合而ADCC活性较弱的Ab，将是本发明的较好的候选物，因为Fc结构域的重新定位将导致增强的抗肿瘤细胞的ADCC活性。可以制备重新工程操作的基因，然后在用于常规Ab的相同细胞体系中进行表达，得到的Ab变体通过用于常规Ab的相同方法，也即，A蛋白或G蛋白色语法进行纯化。测定抗原结合能力以后，ADCC或补体裂解分析将表明重新工程操作的Ab变体是否具有比原始Ab更大的细胞杀死活性。也有比较重新工程操作Ab对原始Ab中的Fc结构域的可及性的生物物理学方法，例如，通过评估FcR+细胞结合与固定抗原连纟妄的Ab如何。本发明因此提供了一种新的方法来重新调整、并可能地在IgGAb上制备更可及的FcR结合位点与Clq结合位点。通过提供这些可接近的位点，一些Ab的功效可能被显著地增强，特别是其ADCC，吞噬作用或补体激活是它的作用机制的一部分的Ab。由于同时发生的FcR结合的影响，通过实现对它的细胞表面或者相反固定抗原较高的亲合力，没有恢复这种免疫效应因子功能作为它们的部分作用机制的其他Ab，仍然可得益于本发明。同时发生的FcR结合越大，暂时与它的抗原解离的任何Ab被非常接近于它的抗原的FcR占据的可能性越大，从而大大增加了重新结合的机会。与寻找一种抗相同抗原的完全不同的Ab相比，该抗原以更有利的方向结合，这种方法常常是更有吸引力的选择。抗体结构域的物理连接可以利用任何常规方法完成。在优选的实施方案中，结构域的物理连接通过重新组合来完成，也即，其中编码这种结构域的基因构建体，以允许正确装配的分子在此表达的方式，被引入到表达系统中。上述例子描述于图2和3中。为了构建这种修饰的Ig，通常，编码待修饰Ab的选择的HC或LC结构域的DNA可以很容易地分离，工程才乘作，并克隆到编码相同Ab的其它链的基因中的选择位点。例如，在一种方法中，可以同时PCR扩增HC的VH和CH1编码序列，并修饰成在CH1编码序列的后面紧跟着翻^奪终止密码子。编码的多肽可构成经修饰的Ab的LC。同时，相同Ab的Vl和CL编码序列可以同时PCR扩增，并进行基因工程操作以例如通过重叠PCR方法，来精确连接这种编码序列与编码HC的铰链，CH2和CH3结构域的序列。这种基因编码的多肽可构成经修饰的Ab的HC。轻链和重链的这些构建体然后转染到合适的细胞系中用于表达。用这样的方式，可以生产图2B和3中描述的分子。在下面的例子中，把编码人Vl和CL结构域的序列插入到相同Ab的重链分子上Vh和Ch1结构域的位置。同时，把Vh和Ch1结构域插入到相同Ab的Vl和Cl結枸域。其他的优选实施方案，包括使用其它Ab,或者识别与原始Ab相同的抗原或不同抗原的Ab的Vh和Ch1或VL和CL编码序列。这种策略可以改变抗原特异性，例如，通过赋予来自其他动物种类的相应抗原更大的反应性，除了改变FcR结合。替换的结构域也可以是来自另一个Ig同种型如IgD的轻链的结构域。通常重链的CH1结构域与轻链恒定区密切相关，而且这种相关掩蔽了重链与轻链上的疏水面。而且，替换的恒定区不必只限于天然抗体中存在的天然形式的恒定区。相反地，本发明中使用的替换的恒定区结构域可以通过，例如，诱变恒定区结构域，接着筛选增强的活性，或者合成制备来产生。本发明可以使用来自各种种类如人，非人灵长类动物，山羊，兔，小鸡，老鼠，仓鼠或小鼠的抗体来实施本发明。其他的可能性是插入来自非Ab蛋白质的免疫球蛋白结构域，如CD4。插入的序列可以不必是免疫球蛋白结构域。其他的序列也许能提供提高Ab效力所需的弹性或空间排列。例子包括由甘氨酸与丝氨酸残基组成的多肽接头，如(Gly-Gly-Gly-Ser)3。应当理解，本发明通常也适用于增强受体与它的配体之间的相互作用在这方面，可以对受体或配体部分进行修饰，以i"更产生具有大于一个部分的分子，其增强亲合力，抗体亲抗原性，或者简单地受体与配体相互作用的能力。换言之，本发明，通过修饰Fc受体结合结构域的空间特性，提供了一种增强分子与它的Fc靶的抗体亲抗原性的方法。最后的结果是修饰的分子将对Fc受体具有较高的亲合力。而且，由于替换免疫球蛋白结构域没有引入外源蛋白序列，修饰的分子将较少可能是免疫原性的。E.修饰抗体的设计如上所述的，用于制备本发明的优选修饰抗体构建体的基本设计，是把一个或多个重链结构域置换成抗体的轻链恒定区和/或把一个或多个轻链结构域置换成重链恒定区。本发明的一个构建体是替换重链与轻链v区，以制各Vl-Ch1-hg-CH2-CH3重链和vh-cl轻链(如图2A所示)。待修饰的抗体可以选自人，啮齿类动物或者其他的来源的任何抗体，而且可以是嵌合的，人源化的，人或合成抗体。在一个实施方案中，待修饰的抗体可以通过免疫正常或转基因小鼠产生。抗体可以本领域已知的任何方法进行更进一步的修饰。一般，修饰的抗体可以通过简单地把编码替换的恒定结构域或其他插入序列的多核苷酸置换成编码抗体。可以直接或用接头分子进行插入。可以根据需要设计插入和接头的性质，来执行想要的功能，也即，修饰抗体分子的Fc受体结合。修饰抗体免疫球蛋白分子的插入的氨基酸组成和长度，可以如本领域已知的通过测试含有各种不同序列的构建体来确定。当需要具有某些特性的修饰分子时，在恒定区插入中引入某些突变以便以某种方式修饰它的特性是合乎需要的或必要的。然而，当需要用于人类的抗体时，产生尽可能接近人序列的插入以降低免疫原性是合乎需要的。因此，引入尽可能较少的氨基酸改变到修饰分子中，以便避免产生免疫原性通常是合乎需要的。也可以使用对至少两种不同的抗原具有结合特异性的双特异性，异种特异的，复共轭对配合物或相似的单克隆，人源化抗体。在这种情况下，一种结合特异性可指定给一种抗原，另一种结合特异性可指定给任何其他的抗原。产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统地，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(MilsteinandCuello,Nature305:5371983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(quadromas)产生了10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，其通常通过亲和层析步骤完成，是相当麻烦的，而且产品产量较低。公开了相似的方法，(例如，WO93/08829,美国专利号6210668,6193967,6132992,6106833,6060285,6037453,6010902,5989530,5959084,5959083,5932448,5833985,5821333,5807706,5643759,5601819,5582996,5496549,4676980,WO91/00360,WO92/00373,EP03089,Trauneckeretal.,EMBOJ.10:36551991;Sureshetal.,MethodsinEnzymology121:2101986,每个以其全部内容引入这里作为参考)。下面的例子中，使用重组DNA方法，置换编码重链Fd区的DNA序列，产生VL誦CL1-hg-CH2CH3重链和VH-CH1-hg-CL2-CL3轻链，来制备经修饰的Ab。相较于修饰抗体来源于其的未修饰鼠抗体，修饰抗体的序列，示于图3。优选地，修饰的抗体构建体或配体结合部分或其变体结合至少一种蛋白质配体或受体，并因此提供对应蛋白质或其片段的至少一种生物学活性。各种治疗或诊断显著的蛋白质是本领域熟知的，而且这种蛋白质白质的修饰抗体可用于本发明。特别感兴趣的是结合，并因此调节TNF，leptin,任何白细胞介素(IL-1到IL-23,等等)，以及与补体激活相关的蛋白质(例如，C3b)的活性的抗体。在某些疾病状况中差异表达的靶向蛋白，也是感兴趣的，包括肺瘤中表达的蛋白质等等。所有这中描述的方法发;。、尤其优选的修饰抗体组是^些结合细胞因^受体的抗体。细胞因子最近已经根据它们的受体code进行分类(参见，Inglot1997,ArchivumImmunologiaeTherapiaeExperinientalis45:353-7,其以其全部内容引入这里作为参考)。包括修饰的恒定区的本发明的经修饰抗体，可使用来源于任何合适方法，例如杂交瘤，噬菌体展示(Katsube,Y.,etalJntJMol.Med,1(5):863-8681998)或应用转基因动物的方法的抗体制备，如本领域已知的和/或如这里所述的。本发明的修饰抗体构建体可包括一个或多个氨基酸置换，缺失或添加，来自于天然突变或人的操作，来自于它来源的亲代抗体。另一个方面，如这里所述的，修饰的抗体构建体，可以通过有机部分的共价连接进行更进一步地修饰。这种修饰可以产生具有提高的药物动力学特性(例如，增加的体内血清半衰期)的抗体或抗原结合片段。有机部分可以是线性或分支的亲水性聚合基团，脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定的实施方案中，亲水性聚合基团的分子量为大约800到大约120,000道尔顿，而且可以是聚烷烃乙二醇(例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG))，碳水化合物聚合物，氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包括大约8到大约40个碳原子。本发明的修饰抗体和抗原结合片段可以包括与抗体直接或间接共价连接的一个或多个有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段连接的每个有机部分，可独立地是亲水性聚合基团，脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如这里使用的，术语"脂肪酸"包含单羧酸类和二羧酸类。如这里使用的术语"亲水性聚合基团"，指在水中比在辛烷中的溶解度更高的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中的溶解度更高。因此，本发明包括通过聚赖氨酸的共价连接修饰的抗体。适于修饰本发明抗体的亲水聚合物可以是线性或分支的，而且包括，例如，聚烷烃乙二醇(例如，PEG,单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)，PPG等等)，碳水化合物(例如，右旋糖酐，纤维素，寡糖，多糖等等)，亲水性氨基酸的聚合物(例如，聚赖氨酸，聚精氨酸，聚天冬氨酸等等)，聚烷烃氧化物(例如，聚环氧乙烷，聚氧化丙烯等等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明抗体的亲水聚合物具有分子量为大约800到大约150,000道尔顿的独立分子实体。例如PEG5000和PEG20,000，其中下标是以Da为单位表示的可以使用的聚合物的平均分子量。亲水性聚合基团可以用1个到6个烷基，脂肪酸或脂肪酸酯基团置换。用脂肪酸或脂肪酸酯基团置换的亲水聚合物可使用合适的方法制备。例如，含有胺基的聚合物可与脂肪酸或脂肪酸酯的羰酸盐连接，脂肪酸或脂肪酸酯上激活的羰酸盐(例如，用N,N-羰基二咪唑激活的)可与聚合物上的羟基连接。适于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可含有一个或多个不饱和的单元。适于修饰本发明抗体的脂肪酸包括，例如，正十二烷酸(C12,月桂酸)，正十四烷酸(C14,肉豆蔻酸)，正十八烷酸(C18,硬脂酸)，正二十烷酸(C20,花生酸)，正二十二烷酸(C22,山嵛酸)，正三十烷酸(C30),正四十烷酸(C40)，顺式-oc9-十八烷酸(C18,油酸)，所有顺式a5,8,11,14-二十碳四烯酸(。20,花生四烯酸)，辛二酸，十四烷二酸，十八烷二酸，二十二烷二酸，等等。适合的脂肪酸酯包括含有线性或者分支低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包括1个到大约12个，优选1个到大约6个碳原子。可以使用合适的方法，例如通过与一种或多种修饰剂反应而制备修饰的人抗体和抗原结合片段。这里使用的术语"修饰剂"，指包括活化基团的适当有机基团(例如，亲水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯)。"活化基团，，指在适当的条件下，可以与第二种化学基团反应，从而形成修饰剂与第二化学基团之间的共价键的化学部分或官能团。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，如甲苯磺酸酯、甲磺酰酯、卣素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),等等。可以与疏醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、二硫吡啶、5-巯基-2-硝基-苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)，等等。可以将醛官能团与含有酰胺或酰肼的分子偶联，可以使叠氮基与三价磷酸基反应形成氨基磷酸酯或亚氨代磷酸酯键。用于将活化基团引入分子中的适当方法是本领域已知的(参见,例^口,Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego,CA1"6)。活化基团可以直接与有机基团(例如，亲水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯)结合，或通过接头部分与其结合，所述接头部分例如为二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可以被氧、氟或硫等杂原子取代。合适的接头部分包括，例如，四曱醇、-(CH2)3-，-NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-。例如，可以在l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下，使单-Boc-烷基二亚胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，在游离胺与脂肪酸羧基之间形成酰胺键，以便产生包含接头部分的修饰剂。用四氟乙酸(TFA)处理产物，从而使伯胺暴露，可以从产物取出Boc保护基，该伯胺可以与上述另一羧基偶联，或可以与马来酰胺反应，将得到的产物环化可以产生被活化的脂肪酸的马来酰亚胺衍生物。(参见，例如，Thompson,etal,WO92/16221;以其全部教导引入这里作为参考。)本发明的修饰抗体可以通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应而产生。例如，通过采用胺反应性修饰剂，例如，PEG的NHS酉旨，有机部分可以与抗体以非位点特异性方式结合。也可以通过还原抗体或抗原结合片段的二硫键(如链内二硫键)而制备修饰的人抗体或抗原结合应，以便产生本发明的修饰抗体。可以采用反向蛋白水解等适当方法制备包含与本发明抗体的特异位点结合的有机部分的修饰人抗体和抗原结合片段(Fischetal.,BioconjugateChem.,3:147-1531992;Werlenetal.,BioconjugateChem.,5:411-4171994;Kumaranetal.,ProteinSd.6(10):2233-22411997;Itohetal.,Bioorg.Chem.,24(1):59-681996;Capellasetal.,Biotechnol.Bioeng.,56(4):456-4631997;也可以采用Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego,CA1996中描述的方法)。F.修饰抗体的制备编码本发明的嵌合抗体，片段和区的恒定(C)区的人基因可以通过已知的方法来源于人胎肝脏文库。人C区基因可以来源于任何人细胞，包括表达和生产人免疫球蛋白的那些细胞。人CH区可以来源于人H链的任何已知的种类或同种型，包括Y,JLi,cc,5，s及其亚型，如Gl，G2,G3和G4。因为H链同种型负责抗体的各种效应因子功能，CH区的选择将由想要的效应因子功能如补体固定，或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)中的活性来指导。优选地，Ch区来源于Yl(IgGl)。人Cl区可来源于人L链同种型，K或入，优选K。编码人免疫球蛋白C区的基因可通过标准克隆技术从人细胞获得(Sambrook，etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY1989;Ausubeletal,eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology1987-1993)。人C区基因可以很容易地从已知的克隆获得，该克隆含有代表L链的两种类型，H链的5种类型及其亚类的基因。可以通过设计适当被截短的嵌合H链基因来制备嵌合抗体片段，如(ab"2和Fab。例如，编码F(ab1)2片段的H链部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1结构域和绞链区的DNA序列，后面是翻译终止密码子，以产生截短的分子。通常可通过克隆编码特异性抗体的H和L链抗原结合区的DNA片段，并把这些DNA片段分别与编码CH和CL区的DNA片段连接，以产生鼠，人或嵌合的免疫球蛋白编码基因，来生产本发明的鼠，人或嵌合的抗体，片段和区。因此，在一个优选的实施方案中，产生了融合的嵌合基因，其包括至少编码人或非人来源的抗体的抗原结合区的第一DNA片段，如与连接(J)片段功能性重排的V区，它与编码含有替换序列的人C区的至少一部分的第二DNA片段连接。可以通过插入，取代和缺失对可变的，恒定的或插入序列的序列进行修饰，到使嵌合抗体保持结合并抑制感兴趣的抗原的能力的程度。普通技术人员可以通过进行适用的功能性分析确定该活性的保持。可以任选地通过细胞系，混合细月包系，无限增殖的细月包或无限增殖细胞的无性群体，如本领域熟知的，来生产本发明的抗体构建体。(参见，例^口，Ausubel,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY1987-2001;Sambrook,etal.,MolecularClonmg:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,NY1989;HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY1989;Colligan,etal.,eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY1994-2001;Colliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY5NY1997-2001,每个都以其全部内容引入这里作为参考。)在一种方法中，通过融合适当的无限增殖细胞系(例如，骨髓瘤细胞系如，但不限于，Sp2/0,Sp2/0-AG14，NS/O,NS1，NS2,AE-I，L.5,>243,P3X63Ag8.653,Sp2SA3，Sp2MAI，Sp2SS1,Sp2SA5，U937，MLA144，ACTIV,M0LT4,DA-I,JUKKAT,WEHI，K-562,COS,RAH，NIH3T3,HL-60,MLA144，NAMAIWA，NEUR02A等，或异骨髓瘤，其融合产物，或由此衍生的任何细胞或融合细胞，或本领域已知的任<可其它合适的细月包系。(参见，例如，www.atcc.org,www.lifetech.com.),等等，与抗体产生细胞来产生杂交瘤，该抗体产生细胞如，但不限于，分离的或克隆的脾细胞，外周血细胞，淋巴细胞，扁桃体细胞，或其它免疫细胞或含B细胞的细胞，或其它任何表达重《连或轻链恒定区或可变区或构架区或CDR序列的细胞，这些序列可以是内源的或异源核酸，重组或内源性的，病毒，细菌，藻类，原核生物，两栖动物，昆虫，爬行动物，鱼类，哺乳动物，啮齿类，马，绵羊，山羊，羊，灵长类，真核生物的基因组DNA,cDNA,rDNA,线粒体DNA或RNA,叶绿体DNA或RNA，hnRNA,mRNA,tRNA，单链，双链或三链，杂交的等或其任何组合。(参见，例如，Ausubel,同上，和Colligan,Immunology,同上，第二章，以其全部内容引入这里作为参考。)也可以用任何其它合适的宿主细胞表达编码本发明的修饰抗体，其特定片段或变体的异源或内源核酸。可以用选择性培养条件或其它适当的已知方法分离融合(杂交瘤)或重组细胞，并且用有限稀释或细胞分拣或其它已知方法进行克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可以通过适当的分析(例如，ELISA)进行选择。工程化或人源化非人或人抗体的方法可以使用，而且是本领域熟知的。一般地，人源化或工程化的抗体具有一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些氨基酸残基一般称作"输入"残基，其一般来自于已知人序列的"输入"可变区，恒定区或其它结构域。已知的人Ig序列是公开的；(例^口，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www,abcam.com/;www,antibodyresource.com/onlinecoinp.htol;www.public.iastate*eduApedro/research—tools.html;www'mgen,uni-heidelberg.de/SD/IT/IT,html;www.whfreeman.comyimm"unology/CH05/kuby05.htm;www.library.thinkquest.org/12429/Iminune/Antibody.htol;www.hhmi,org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path,cam.ac'uk/mrc7/mikeiinages.html;www.antibodyresource，com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Inununology.html.www.iminunologylink.com/;pathbox.wustiLedu/hcenter/index.html;www.biotech.ufl.edu/hcl/;www.pebio,com/pa/340913/340913.htol;www,nal,usda,gov/awic/pubs/antibody/;www.m.ehime-u.ac'jp/yasuhito/ElisaJitinl;www.biodesign.com/table.asp;www,icnet.uk/axp/facs/davies/links.litml;www.biotech.ufleduA-fccl/protocol.html;www.isac-net.org/sites一geo.html;aximtl.imt,uni-marburg.de/rek/AEPStart,html;baserv.uci.kun.nl/jraats/linksl,htni〗；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.e(iu/;www,mrc-cpe，cam.ac,uk/imt-doc/public/INTRO.htoil;www,ibt.unam.mx/vir/V—mice.htmI;imgt,cnusc,fr:8104/;www,biochem.ucl.ac.uk/raartin/antibodies/index.html;antibody.bath.ac.uk/;abgeia.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgeu.html;www,unizh.ch/honegger/AHOseininar/Slide01,html;www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/;www.nimr.mrc,ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg*htm;www.path.cam.ac.uk/~rnrc7/humanisation/TAHHP.html;www,ibtunam,mx/vir/structure/stat—aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;Kabateta.，iSfe《we^wo/T)Mmw"o/og7'ra//w/ere^，U.S，Dept.Health1983;每个老卩以其全部内容引入这里作为参考。)这些输入序列可以用于减少免疫原性，或用于减少、增强或修饰结合，亲合力，开率(on-rate),闭率(off-rate)，亲和力，特异性，半衰期或任何其它适当的特征，如本领域已知的。保留非人或人CDR序列的大部分或全部，而用人或其它氨基酸取代可变区和恒定区的非人序列。对抗体人源化，保留抗体对抗原的高亲合力和其它有利的生物学特性。为了达到这一目的，通过采用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和各种得到的人源化产物的过程任选制备人源化抗体。三维免疫球蛋白是通常可得到的，并且是本领域技术人员公知的。说明和演示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构计算机程序是可得到的。检查这些演示结果可以分析候选免疫球蛋白序列功能中残基的可能作用，也即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原的结合能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基，并且与共有序列和输入序列结合，从而得到需要的抗体特征，如对靶抗原的亲和力增加。总而言之，CDR残基直接并最大程度参与影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程化可以采用任何已知的方法，例如，但不限于，以下文献中描述的方法，(Winter,Jonesetal.,Nature321:5221986;Riechmannetal.,Nature332:3231988;Verhoeyenetal.,Science239:15341988;Simsetal.,J.Immunol.151:22961993;CliothiaandLesk，J.Mol.Biol.196:9011987;Carteretal,Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.89:42851992;Prestaetal.,J.Immunol.151:26231993;USPatentNos:5723323,5976862,5824514,5817483,5814476,5763192,5723323,5,766886,5714352,6204023,6180370,5693762,5530101,5585089,5225539;4816567,PCT/:US98/16280,US96/18978,US91/09630，US91/05939,US94/01234,GB89/01334,GB91/01134,GB92/01755;WO90/14443,WO90/14424,WO90/14430,EP229246,每个都以其全部内容引入这里作为参考。也可以使用至少一种编码核酸的抗体构建体提供转基因动物或哺乳动物，从而制备本发明的抗体，所述动物如山羊，牛，马，绵羊，等等，它们在其乳汁中产生这些抗体。这些动物可以使用已知的方法提供。(参见,例如，但不限于美国专利号5,827,690;5，849,992;4,873,316;5,849,992;5,994,616,5,565,362;5,304,489,等等，其中每个都以其全部内容引入这里作为参考。也可以使用至少一种编码核酸的抗体构建体提供在植物部分或由其培养的细胞中产生这种抗体、特定部分或变体的转基因植物并培养植物细胞(例如，但不限于烟草和玉米)，从而制备本发明的抗体。作为一卄限制性的实例，已经成功使用表达重组蛋白的烟叶提供大量重组蛋白，例如，使用诱导型启动子。参见，例如，Crameretal.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-1181999)及其中引用的文献。同样，已经采用玉米以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物学活性等于在其它重组系统产生或从天然来源纯化的蛋白。参见，例如，Hoodetal.,Adv.Exp.Med.Biol.464:127-1471999及其中引用的文献。也已经从转基因才直物种子，包括烟草种子和马铃薯块根中大量产生了抗体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv，s)。(参见，例如，Conradetal.,PlantMol.Biol.38:101-1091998及其中引用的文献。这样，也可以根据已知方法，釆用转基因植物产生本发明的抗体。(也参见，例如，Fischeretal,Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108Oct.,1999:Maetal.,TrendsBiotechnol.13:522-7199;Maetal.,PlantPhysiol.109:341-61995;Whitelametal.,Biochem.Soc.Trans.22:940-9441994;及其中引用的文献；上述文献每个都以其全部内容引入这里作为参考。力。(参见，例^口,Berzofsky,etal.,"Antibody-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul,W.E.,Ed,RavenPressNY,NY1984;Kuby,JanisImmunology,W.H.FreemanandCompanyNY,NY1992;以及这里描述的方法。)如果在不同的条件(例如，盐浓度，pH)下进行测定，测定的特定抗体-抗原相互作用的亲和力会有变异。因此，亲合力及其他抗原结合参数(例如，KD，K3，Kd)的测定，优选用抗体和抗原的标准溶液，以及标准的緩冲液如这里所述的緩冲液进行。G.核酸分子采用这里提供的信息，可使用这里描述的方法或本领域已知的方法获得编码本发明抗体构建体的本发明核酸分子。本发明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，hnRNA，tRNA或任何其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于，通过克隆或合成产生，或其任意组合而获得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链，双链或单链，或其任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任意部分可以是编码链，也称作有义链，或可以是非编码链，也称作反义链。本发明的分离核酸分子可以包括含有开放读码框(ORF),任选具有一个或多个内含子的核酸分子，至少一种含有修饰抗体构建体的编码序列的重链或轻链核酸分子的至少一种CDR,如CDR1，CDR2和/或CDR3的至少一个特定部分，以及含有基本上不同于上述那些的核苷酸序列的核酸分子，但由于遗传密码简并性，它们仍然编码这里描述的和/或本领域已知的至少一种这种修饰的抗体构建体。当然，遗传密码是本体的简并核酸变体是常M^的。(参见，例如，Ausubel,etal.,同上)，而且这些核酸变体包括在本发明中。如此处指出的，包含编码抗体构建体的核酸的本发明的核酸分子可以包括，但不限于，自身编码抗体片段的氨基酸序列的核酸，完整抗体或其部分的编码，抗体、片段或部分的编码序列，以及其它的序列，如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，其具有或不具有前面提到的其它编码序列，如至少一种内含子，同时具有其它的非编码序列，包括但不限于，非编码5，和3，序列，如在转录，mRNA加工，包括剪接和聚腺苷酸化信号中起作用(例如，mRNA的核糖体结合和稳定性)的转录的，未翻译的序列；编码其它的氨基酸，如提供其它的功能的氨基酸的其它编码序列。因此，编码抗体的序列可以与标记序列融合，例如与编码促进包含抗体片段或部分的融合抗体纯化的肽的序列融合。核酸的构建本发明的分离核酸可以利用本领域熟知的的(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术或其组合进行制备。核酸可以方便地包含除本发明的多核苷酸的多核苷酸以外的序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸，以帮助多核苷酸的分离。也可以插入可翻if的序列以帮助本发明的被翻译的多核苷酸的分离。例如，一种六组氨酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白的方便的方法。除编码序列外，本发明的核酸任选为用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体，连接物或接头。在这种克隆和/表达序列中也可以中也可以加入其它序列，用于最佳化它们在克隆和/或表达中的功能，用于帮助多核苷酸分离，或改进多核苷酸向细胞中的引入。克隆载体，表达载体，连接物和接头是本领域公^口的。(参见，4列^口，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)构建核酸的重组方法本发明的分离核酸组合物，如RNA,cDNA,基因组DNA或其任何组合，可使用本领域技术人员已知的任何克隆方法从生物来源获得。在一些实施方案中，在严格条件下，选择性与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离，和cDNA以及基因组文库的构建是本领域普通^支术人员熟知的。(参见，例^口，Ausubel,同上；或Sambrook,同上)核酸筛选和分离方法可以采用基于本发明的多核苷酸序列的探针筛选cDNA或基因组文库，如此处所公开。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将理解，在测定中可以使用不同严格性程度的杂交，杂交或洗涤介质中的任意一个可以是严格的。当杂交条件更严格时，探针与靶之间的互补性必须更高，这样才能形成双链体。严格性程度可以由温度，离子强度，pH和曱酰胺等部分变性溶剂的存在中的一个或多个条件进行控制。例如，杂交的严可以通过例如在0%-5%的范围内操作曱酰胺的浓度而改变。可检测的结合所要求的互补性程度(序列同一性)将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而改变。互补性程度最佳为100%，或70-100%,或其中的任意范围或任意值。然而，应当理解，探针和引物中的小量序列变异可扩增RNA或DNA的方法是本领域熟知的，可以纟艮据此处的教导和指导用于本发明，而不需要过多的实验。已知的扩增DNA或RNA的方法包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR)和相关的扩增方法(参见，例如，Mullis等的美国专利4,683,195,4,683,202,4,800,159,4,965，188;Tabor等的4,795,699和4,921,794;Innis的5,142,033;Wilson等的5,122,464;Innis的5,091,310;Gyllensten等的5，066,584;Gelfand等的4,889,818;Silver等的4,994,370;Biswas的4,766,067;Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增，该扩增中使用耙序列的反义RNA作为模板用于双链DNA合成(参见，例如，Ausubel,同上；Samb腦k,同上;Malek等的美国专利5,130,238，商品名为NASBA;以其全部内容引入这里作为参考)。例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA或cDNA文库直接扩增本发明的多核苷酸序列和相关基因。PCR和其它体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码需要表达的蛋白的核酸序列，制备用于检测样品中是否存在所需mRNA的探针的核酸，用于核酸测序，或其它目的。(足够指导技术人员使用体外扩增方法的技术的例子见:Berger，同上；Sambrook,同上；Ausubel,同上；Mullis等的美国专利4,683,2021987;Innis等的PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications,Eds.,AcademicPressInc.,SanDiego,CA1990。)用于基因组PCR扩增的商品化试剂盒是本领域已知的。参见，例如，Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。此外，如T4基因32蛋白(BoehringerMannheim)可用于提高长PCR产物的产率。构建核酸的合成方法本发明的分离核酸也可以根据已知方法通过直接化学合成而制备(参见，例如，Ausubel等，同上)。化学合成一般产生单链核苷酸，该单聚合酶进行聚合而转化为双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成可以限制在约100或更多碱基的序列，也可以通过较短序列的连接获得较长的序列。H.重组表达盒本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如，编码本发明的抗体的cDNA或基因组序列可用于构建重组表达盒，该表达盒可以被导入至少一种需要的宿主细胞。重组表达盒一般包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作性连接于指导多核苷酸在目的宿主中转录的转录起始调节序列。异源性和非异源性(即内源性)启动子可用于指导本发明的核酸的表达。在一些实施方案中，作为启动子，增强子或其它元件的分离核酸可以导入本发明的多核香酸的非异源形式中的适当位置(位于内含子上游，下游或内部)，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如，可以通过突变，缺失和/取代而体内或体外改变内源性启动子。I.载体和宿主细胞本发明也涉及包含本发明的分离核酸分子的载体，用重组载体基因工程化的宿主细胞，以及通过本领域熟知的重组:技术产生的至少一种本发明的抗体构建体。(参见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上,每个都以其全部内容引入这里作为参考。多核苷酸可以任选与含有可选择标记的载体连接，用于在宿主中增殖。一般地，将质粒载体导入一种沉淀物，例如，磷酸钙沉淀，或导入具有带电脂质的复合物，如果载体是病毒，可以用适当的包装细胞系将其包装后转导至宿主细胞。DNA插入物可以操作性与适当启动子连接。表达构建体进一步包含转录起始位点、转录终止位点和转录区中位点，以及用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包含位于起始处的翻译起始密码子和位于被翻译处的mRNA末端适当位置的终止密码子(如UAA，UGA或UAG),哺乳动物或真核细胞表达优选采用UAA和UAG。表达载体优选但任选包含至少一种可选4奪标记。这些标记包括，例如，但不限于用于真核细胞培养的氨甲喋呤(MTX),二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利4,399,216;4,634,665;4,656,134;4,956，288;5,149,636;5,179,017)，氨千青霉素，新霉素(G418),霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利5,122,464;5,770,359;5,827,739)抗性基因，以及用于培养大肠杆菌和其它细菌或原核生物的四环素或氨千青霉素抗性基因(上述专利以其全部内容引入这里作为参考)。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域公知的。适当的载体是本领域技术人员很显而易见的。可以通过磷酸钩转染，DEAE-右旋糖苷介导的转染，阴离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染或其它已知方法将载体构建体导入宿主细胞。(这些方法在本领域有描述，Sambrook,同上，1-4和16-18章;Ausubel，同上l,9,13，15,16章。)本发明的至少一种抗体可以以修饰的形式，例如以融合蛋白的形式表达，并且可以包括分泌信号和其它异源功能区。例如，其它的氨基酸区域，特别是带电氨基酸区域可以添加至抗体的N端以改进纯化或随后的加工和储存过程中在宿主中的稳定性和耐受性。也可以将本发明的肽部分添加至本方面的抗体，以促进纯化。这些区域可以在抗体或其至少一个片段的最终制备之前去除。(这些方法描述于许多标准实验室手册Sambrook，同上17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上16，17和18章)。本领域普通技术人员了解，许多表达系统都可以用于表达编码本发明的蛋白的核酸。作为选择，本发明的核酸可以通过在包含编码本发明的抗体的内源性DNA的宿主细胞中打开(turningon)(通过操作)而在宿主细胞中表达。(这些方法是本领域公知的，如描述于美国专利5,580，734，5,641,670，5,5733，746,和5，733，761,以其全部内容引入这里作为参考。)用于产出抗体，其特定部分或变体的示例性的细胞培养物为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统一般是单层细胞的形式，但也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的适当宿主细胞系，包括COS-l(如ATCCCRL1650)，COSTCOATCCCRL1651),HEK293,BHK21(如ATCCCRL-10)，CHO(如ATCCCRL1610)和BSC-l(如ATCCCRL誦26)细胞系，Cos-7细胞，CHO细胞，hepG2细胞，P3X63Ag8.653,SP2/0-Agl4,293细胞，HeLa纟田胞等，它们可以容易从例如美国典型培养物保藏中心Manassas,Va(，w,atcc,org)获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC保藏号CRL-1580)和SP2/0-Agl4细胞(ATCC保藏号CRL曙1851)。在一种特别优选的实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Agl4细胞。这些细胞的表达载体可以包含一种或多种以下表达调控序列，例如，但不限于复制起点;启动子(如晚期或早期SV40启动子，CMV启动子(美国专利5,168,062;5,385,839),HSVtk启动子，pgk(磷酸甘油酶)启动子，EF-1a启动子(美国专利5，266,491)，至少一种人类免疫球蛋白启动子;增强子和或加工信号位点，例如核糖体结合点位，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点(如SV40大TAg聚腺苷酸添加位点)和转录终止子序列。见，例如Ausubel等，同上；Sambrook，等，同上。其它用于产生本发明的核酸或蛋白的细胞是已知的和/或可得到的，例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www,atcc,org)或其它已知的或商业来源获得。当使用真核宿主细胞时，一般将聚腺苷酸化或转录终止子序列掺入载体。终止子序列的一个例子是来自于牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。也可以包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个例子是SV40的VP1内含子(Sprague,etal.,J.Virol.45:773-7811983)。此外，用于调控宿主细胞中复制的基因序列可以掺入本领域公知的载体中。J.在哺乳动物细胞中克隆和表达抗体构建体典型的哺乳动物细胞表达载体含有至少一种启动子元件，其介导mRNA，抗体编码序列，以及转录终止和转录物的聚腺苷酸化所需信号的转录起始。其它元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，其侧翼具有RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒的长末端重复(LTRS),如RSV，HTLVI,HTVI和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子获得高度有效的转录。然而，也可以使用细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适当表达载体包括，例如，pIRESlneo,pRetro-Off，pRetro-On,PLXSN,或pLNCX(ClonetechLantibodies,PaloAlto,CA),pcDNA3.1(+/-),pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen),PSVLandPMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC37152),pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)等载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela293，H9和Jurkat细胞，小鼠NTH3T3和C127细胞，Cos1,Cos7和CV1,鹌鹁QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。作为选择，可以在含有整合导染色体中的基因的稳定细胞系中表达基因。用dhfr,gpt,新霉素或潮霉素等选择性标记共转染，可以鉴定和分离被转染的细胞。也可以扩增经转染的基因，使其表达大量被编码的抗体。用DHFR(二氢叶酸还原酶)标记开发携带几百或甚至几千拷贝目的基因的细胞系。另一种有用的选4奪标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy,etal.,Biochem.J.227:277-2791991;Bebbington，etal.,Bio/Technology10:169-1751992)。采用这些标记，在选择培养基中培养哺乳动物细胞，选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合导染色体中的被扩增的基因。通常用中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞产生抗体。表达载体pCl和pC4含有劳斯肉毒瘤病毒强启动子(Cullen,etal.,Molec.Cell.Biol.5:438-4471985)plusafragmentoftheCMV-enhancer(Boshart,etal.,Cell41:521-5301985)。多个克隆位点，如具有限制酶裂解位点BamHI,Xbal和Asp718的那些，促进了目的基因的克隆。这些载体除3，内含子外，还含有大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信K.在CHO细胞中克隆和表达载体pC4可用于表达抗体构建体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。该质粒含有SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。可以通过在选择性培养基(例如，a-MEM,LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)中培养细胞而选择用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞，该培养基中添加有化疗剂氨曱喋呤。抗氨曱喋呤(MTX)的细胞中的DHFR基因的扩增已经有记载(参见，例如，F.W.Alt，etal.，J.Biol.Chem.253:1357-13701978;J.L.HamlinandC.Ma,Biochem.etBiophys.Acta1097:107-1431990;andM.J.PageandM.A.Sydenham,Biotechnology9:64-681991)。在不断增加的MTX浓度下培养的细胞通过靶酶DHFR的过量产生发生了对药物的抗性，这是因为DHFR基因的扩增。如果将第二种基因连接于DHFR基因，它通常被共扩增并且过度表达。本领域公知该方法可以用于开发携带多于1000拷贝的被扩增基因的细胞系。因此，当除去氨曱喋呤时，获得了含有整合到宿主细胞的一个或多个染色体的被扩增基因。质粒pC4含有用于表达目的基因的老斯肉毒瘤病毒长末端重复(LTR)的强启动子(Cullen,etal.,Molec.Cell.Biol.5:438-4471985)和从人巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的增强子分离的基因(Boshart,etal.,Cell41:521-5301985)。启动子下游是允许基因整合的BamHI，Xbal和Asp718限制酶裂解位点。该质粒在这些克隆位点之后含有3'内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可以用于表达，例如人p肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子或来自于其它逆转录病毒，如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和相似的系统可用于在哺乳动物细胞中以经调节的途径表达修饰的抗体构建体(M.Gossen,andH.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sd.USA89:5547-55511992)。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使用例如人生长激素或球蛋白基因的其它信号。携带整合到染色体中的目的基因的稳定细胞系也可以通过用可选^^标记如gpt,G418或潮霉素共转染而进4亍选择。在开始时，使用G418加氨曱喋呤等一种以上的可选择标记是有利的。用限制酶消化pC4质粒，然后通过本领域公知的程序用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后从1%琼脂糖凝胶分离载体。根据已知的方法步骤，使用编码完整的修饰抗体构建体的DNA序列，如SEQIDNOS:7和8所示，相当于本发明的修饰抗体构建体的HC和LC可变区。该构建体中也使用编码合适的人恒定区(即HC和LC区)的分离的核酸。然后用T4DNA连接酶连接分离的可变区和恒定区编码DNA和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101或XL-lBlue细胞，并且例如用限制酶分析鉴定含插入pC4质粒的片段的细菌。用缺乏活性的DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。用0.5ngpSV2-neo质粒采用脂质转染共转染5jug表达质粒pC4。pSV2-neo质粒含有显性可选择标记，即来自于Tn5的neo基因，它编码一种酶，该酶赋予对包括G418的一组抗生素的抗性。将这些细胞种植在补加1jug/mlG418的cc-MEM中。两天后，用胰蛋白酶消化细胞并且种才直在杂交瘤克隆板(Greiner,Germany)上，置于补加10，25或50ng/ml氨曱喋呤和ljug/mlG418的oc-MEM中。大约10-14天后，用胰蛋白酶消化单个克隆，然后种植在6孔培养皿或10ml烧瓶中，使用不同浓度的氨曱喋呤(50nM,100nM,200nM,400nM,800nM)。然后将在最高浓度氨甲喋呤下生长的细胞转移到新的6孔板中，该板含有更高浓度的氨曱喋呤(lmM,2mM,5mM,10mM,20mM)。重复同样的程序，直到获得在100-200mM的浓度下生长的克隆。例如，通过SDS-PAGE和蛋白印迹或反相HPLC分析所需基因产物的表达。L.抗体的纯化可以通过/>知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化修饰抗体构建体，所述方法包括，但不限于，蛋白A纯化，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析。也可以采用高效液相层析("HPLC")进4亍纯4匕。(参见，例如，Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,1997-2001,Chapters1,4,6,8，9,10,每个都以其全部内容引入这里作为参考。)J.应用本发明的分离核酸可用于生产至少一种抗体构建体或其特定变体，其可用于测定细胞，组织，器官或动物(包括哺乳动物和人类)中的作用，用于诊断，监控，调节，治疗，减轻，帮助预防至少一种疾病的发生，或减轻至少一种疾病的症状，该疾病选自，但不限于，至少一种免疫紊乱或疾病，心血管紊乱或疾病，感染的，恶性的，和/或神经紊乱或疾病，过敏性紊乱或疾病；皮肤紊乱或疾病；血液紊乱或疾病，和/或肺部紊乱或疾病，或其它已知的或特定的疾病。这种方法可包括对需要这种调节，治疗，减轻，预防或减轻症状，影响或机制的细胞，组织，器官，动物或患者，施用有效量的含有至少一种修饰的抗体构建体的组合物或药物组合物。有效量可包括每单次(例如，丸剂)，多次或连续给药大约0.001到500mg/kg的量，或每单次，多次或连续给药获得0.01-5000mg/ml血清浓度的血清浓度，或任何有效范围或其中的任何值，如这里所述或相关领域已知的，使用已知的方法进4于或确定。K.修饰的抗体构建体组合物本发明也提供至少一种以非天然存在的组合物，混合物或形式提供的修饰抗体构建体，其中包括此处描述的和/或本领域公知的至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，至少六种或更多其抗体。这些组合物包括含有至少一种本发明的修饰抗体的非天然存在的组分，和一种药学上可接受的载体。这种抗体构建体组合物可包括40-99%中任何数量的本发明的修饰抗体构建体。这种组合物作为液体或干溶液，混合物，混悬液，乳剂或胶体的重量，体积，浓度，摩尔浓度或克分子浓度的百分比，是本领域已知的或如这里所述的。本发明的修饰抗体构建体或特定部分或变体组合物可以进一步包含至少一种任意适合的辅助物质，例如，但不限于，稀释剂，粘合剂，稳定剂，緩冲液，盐，亲脂溶剂，防腐剂，佐剂等。药学上可接受的辅助物质是优选的。这些无菌溶液的非限制性例子和制备方法是本领域熟^口的；(Gennaro,Ed.,Remington'sPharmaceuticalSciences,18<th〉EditionMackPublishingCo.Easton,PA1990.)可以常规选择药学上可接受的载体，这些载体适于本领域熟知的或如这里所述的修饰抗体构建体组合物的给药，溶解和/或稳定模式。用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白，肽，氨基酸，脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖，二糖，三糖，四糖和寡糖；衍生糖如醛醇，醛酸，酯化糖等；以及多糖和糖聚合物)，其以单个或组合存在，单独或组合占重量或体积1-99.99%。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA),重组人白蛋白(rHA),明胶，酪蛋白等等。可以起緩沖作用的代表性氨基酸/修饰的抗体构建体或特定部分或变体组合物包括丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，甜菜碱，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，曱硫氨酸，苯丙氨酸，天冬酰胺等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨醇等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖等；多糖，如棉籽糖，松三糖，麦芽糖糊精，右旋糖苷，淀粉等；以及醛醇，如甘露醇，木糖醇，麦芽糖醇，乳糖醇，木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)，肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露醇，海藻糖和棉籽糖。修饰的抗体构建体组合物也可包含緩冲液或pH调节剂；一般地，緩冲液是由有机酸或碱制备的盐。代表性的緩冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸，抗坏血酸，葡萄糖酸，碳酸，酒石酸，琥珀色，乙酸或邻苯二曱酸的盐；Tns，氨丁三醇盐酸盐或磷酸緩冲液。用于本发明组合物的优选緩冲液是有机酸盐如柠檬酸盐。此外，本发明的修饰抗体构建体或特定部分或变体组合物可包含聚合物赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮，聚蔗糖(一种聚合的糖)，葡萄糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟基丙基-P-环糊精)，聚乙二醇，调味剂，抗微生物剂，甜味剂，抗氧化剂，抗静电剂，表面活性剂(例如，聚山梨醇酯如'TWEEN20"和'TWEEN80")，脂质(例如，磷脂，脂肪酸)，类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。适用于本发明的修饰抗体构建体组合物的这些和其它的已知药物I武形剂和/或添加剂是本领域已知的，(例如，列于Remington:TheScience&PracticeofPharmacy,19thed.,Williams&Williams,1995;Physician'sDeskReference,52nded.,MedicalEconomics,Montvale,NJ1998,以其全部公开内容引入这里作为参考。)优选的载体或赋形剂物质是碳水化合物(例如，糖和醇)和緩冲剂(例如，柠檬酸盐)或聚合剂。L.制剂如前面所指出的，本发明提供了稳定的制剂，优选为含有盐或选择的盐的磷酸緩沖液，以及含有防腐剂的储存溶液和制剂，以及适于药用或兽医用途的多用途储存制剂，它包含置于药学上可接受制剂中的至少一种修饰的抗体构建体。储存制剂包含至少一种已知的防腐剂或任选选自至少一种苯酚，间甲酚，对曱酚，邻甲酚，氯曱酚，苯曱醇，亚硝酸苯汞，苯曱氧基乙醇，曱醛，氯丁醇，氯化镁(例如，六水化合物)，对羟基苯曱酸烷基酯(曱基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯铵，苯索氯铵，脱氲乙酸钠和乙基汞石克代水杨酸钠，或其在水溶性稀释剂中的混合物。可以使用本领域公知的任何适当浓度或混合物，例如，0.001-5%,或其中的任何范围或任意值，例如，但不限于0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02,0.03,0.05,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4.,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.3,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,或其中的任何范围或任意值。非限制性实例包括，无防腐剂，0.1-2%间曱酚(例如，0.2,0.3.0.4,0.5,0.9,1.0%)，0.1-3%苯曱醇(例如，0.5,0.9,1.1.,1.5，1.9,2.0,2.5%),0.001-0.5%乙基汞石克代水杨酸钠(例如，0.005,0.01),0.001-2.0%笨酚(例如，0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%),0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075,0.0009,0.001,0.002,0.005,0.0075,0.009,0.01，0.02，0.05，0.075，0.09,0.1,0.2,0.3,0.5,0.75,0.9,1.0%)等。如前面指出的，本发明提供了一种制品，包括包装材料和至少一个管形瓶，其中包含至少一种修饰的抗体构建体和规定的緩冲液和/或防腐剂，任选溶于一种水性稀释剂，其中所述包装材料包括一种标签，它指出所述溶剂可以保留1,2,3,4,5,6,9,12,18,20,24,30,36,40,48,54,60,66,72小时或更长的时间。本发明更进一步包括一种制品，包括包装材料和含有至少一种冻干的修饰抗体构建体的第一个管形瓶，和含有规定的緩沖液或防腐剂的水性稀释剂的第二个管形瓶，其中包装材料包括一种标签，它指导患者在水性稀释剂中重构至少一种修饰的抗体构建体，以便形成可以保留24小时或更长时间的溶液。本发明的产品中至少一种修饰的抗体构建体的范围包括在湿/干体系中重构时，产生约1.0yg/ml至约1000mg/ml的量，但更低或更高的浓度也是可行的，而且依赖于准备使用的传递载体，例如，溶液制剂将不同于经皮贴剂，肺，经粘膜或渗透或微泵方法。优选地，水性稀释剂任选进一步包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括选自苯酚，间甲酚，邻曱酚，氯曱酚，苯曱醇，对羟基苯甲酸烷基酯(甲基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯铵，苯索氯铵，脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物的那些。用于制剂中的防腐剂的浓度为足以产生抗微生物作用的浓度。这些浓度取决于选择的防腐剂，并且本领域技术人员很容易确定。可以任选和优选将其它赋形剂，如等渗剂，緩沖液，抗氧化剂，防腐增强剂，加入稀释剂中。甘油等等渗剂通常以公知的浓度使用。优选加入生理耐受的緩冲液以改进pH调控。制剂可以有宽范围的pH值，例如pH约4到10,优选pH范围为约5到9，最优选pH范围为约6到8。优选地，本发明制剂的pH为约6.8到7.8。优选的緩冲液包括磷酸緩冲液，最优选为磷酸盐，特别是磷酸緩冲盐水(PBS)。也可以任选向制剂或组合物中加入其它添加剂，如药学上可4妄受的增溶剂，如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇肝单月桂酸酯)，TWEEN40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单椋榈酸酯)，TWEEN80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇肝单油酸酯)，PluronicF68(聚氧乙烯聚氧嵌段共聚物)，和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂，例如，polysorbate20或80或poloxamer184或188,Pluronic多元醇或其它共聚物，以及螯合剂如EDTA和EGTA,以减少聚集。如果用泵或塑料容器施用制剂，这些添加剂是特别有用的。药学上可接受的表面活性剂的存在减少了蛋白聚集的倾向。可以通过以下方法制备本发明的制剂，包括将至少一种抗体构建体和选自苯酚，间曱酚，邻曱酚，氯甲酚，苯曱醇，对羟基苯甲酸烷基酯(曱基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯铵，苯索氯铵，脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物在一种水性稀释剂中混合。采用常规的溶解和混合步骤在一种水性稀释剂中混合至少一种抗体构建体和防腐剂。为了制备适当的制剂，例如，可以将测得量的溶于緩冲液中的至少一种抗体构建体在其量足以提供所需浓度的蛋白和防腐剂的緩冲液中混合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的顺序，是否使用其它添加剂，制备该制剂的温度和pH都是可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。可以将本发明的制剂以澄清的溶液和作为双管形瓶的形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗体构建体的管形瓶，将其用含有水，防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸緩冲剂和/或盐水和溶于水性稀释剂中的选择的盐的第二个管形瓶重构。单一溶液的管形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。本发明的制品可用于在24小时左右或更长的时间内既要。因此，本发明的制品为患者提供了显著的优势。本发明的制剂任选可以在约2-4(TC的温度下储存，并且长时间保持蛋白的生物活性，因此，包装标签指出，该溶液可以在超过6，12,18,24,36,48，72或96小时或更长时间内保留和/或使用。如果使用储存的稀释液，该标签包括可以在l-12个月，半年，一年半和/或两年的时间内用完。本发明的至少修饰的抗体构建体溶液可以通过包括在水稀释液中混合至少一种抗体的方法而制备。采用常规的溶解和混合步骤进行混合。为了制备适当的稀释液，例如，可以将测得量的溶于水或緩冲液中的至少一种抗体以足以提供所需浓度的蛋白和任选的防腐剂或緩冲液的量混合。本领域4支术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的顺序，是否使用其它添加剂，制备该制剂的温度和pH都是可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗修饰的抗体构建体的管形瓶，将其用含有水性稀释溶液的第二个管形瓶重构。单一溶液的管形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因此，比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给药店，诊所，或其它机构和设施，从而直接提供给患者，其中双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的修饰抗体构建体的管形瓶，将其用含有水稀释液的第二个管形瓶重构。在此情况下的澄清溶液最多可达1升或甚至更多，提供于大的储存容器，从中可以一次或多次取出至少一种抗体溶液的更小部分，将其转移至更小的管形瓶中，由药店或诊所提供给它们的客户和/或患者。公认的包括这些单个管形瓶体系的设备包括用于递送溶液的笔式注射器，例如，BDPens,BDAutojector,Humaject,NovoPen,B-DPen,AutoPen⑧，以及OptiPen,GenotropinPen,GenotronormPen,HumatroPen,Reco-Pen,RoferonPen,Biojector,iject,J-tipNeedle-FreeInjector,Mraject,Medi-Ject,例i口，由以下/>司生产BectonDickensen(FranklinLakes,NJ，www.bectondickenson.com),Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com;Bioject,Portland,Oregon(www.bioject.com);NationalMedicalProducts,WestonMedical(Peterborough,UK,www.weston-medical.com),Medi-JectCorp(Minneapolis,MN,www厕dije汰CQm)。公认的包括双管形瓶体系的设备包括用于在药筒中递送重构的冻千药物的笔式注射器系统，例如HumatroPen。当前要求保护的产品包括包装材料。除了管理部分要求的信息，包装材料提供了可以使用该产品的条件。本发明的包装材料为患者提供了用两个管形瓶中的湿/干产品在水稀释液中重构至少修饰的抗体构建体，以形成溶液，并且在2-24小时或更长时间内4吏用该溶液的i兌明。对于单一管形瓶中的溶液产品，该标签说明该溶液可以在2-24小时或更长的时间内使用。当前要求保护的产品可用于人类药用产品的用途。本发明的制剂可以通过以下方法制备，包括混合至少一种修饰的抗体构建体和选定的緩沖液，优选含有盐水或选定的盐的磷酸緩沖液。用常规溶解和混合步骤在水性緩冲液中混合至少一种抗体和緩冲剂。为了制备适当的制剂，可以将测得量的溶于水和緩冲液中的至少一种抗体以足以提供所需浓度的蛋白和緩沖剂的量于所需緩冲剂在水中混合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的顺序，是否使用其它添加剂，制备该制剂的温度和pH都是可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。要求保护的稳定或储存的制剂可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗修饰的抗体构建体的管形瓶，将其用含有溶于水稀释液的防腐剂或緩冲剂和赋形剂的第二个管形瓶重构。单一溶液的管形并瓦或要求重构的双管形并瓦可以重复使用多次，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。可以根据本发明提供通过各种递送方法给予患者此处描述的至少一种修饰的抗体构建体的稳定或储存制剂或溶液，所述方法包括SC或IM注射；经皮，肺部，经粘膜，植入，渗透泵，药筒，微泵，或其它本领域公知的本领域技术人员了解的方法。M.治疗用途本发明还提供了一种使用本发明的至少一种修饰的抗体构建体调节或治疗细胞，组织，器官，动物或患者中的本领域公知的或此处描述的疾病的方法。本发明还提供了一种用于调节或治疗细胞，组织，器官，动物或患者中的至少一种疾病，包括但不限于，至少一种肥胖，免疫相关的疾病，心血管疾病，传染病，恶性疾病或神经疾病的方法。一般地，病理情况的治疗受施用的至少一种修饰的抗体构建体组合物的有效量或剂量的影响，其总量，平均的，为每千克患者每剂量至少大约0.01到500毫克的至少一种抗Santibody,优选每千克患者每单次或多次给药至少大约0.1到100毫克修饰的抗体构建体，取决于组合物中所含的特定活性。作为选择，有效血清浓度可包括每单次或多次给药0.1-5000Mg/ml血清浓度。适合的剂量是医生已知的，而且,当然，取决于特别的疾病状况，被施用的组合物的特定活性,以及正在进4亍治疗的特定患者。在有些情况下，为了获得想要的治疗量，提供重复给药,也即,特定监控或计量剂量的重复单独给药也是必要的,其中重复进行单独给药直到获得所需的日剂量或作用。优选的剂量可任选包括O.l-100mg/kg/给药，或其中的任何范围，值或部份，或获得每单次或多次给药0.1-5000^^/1111血清浓度的血清浓度，或其中的任何范围，值或部份。做为选择，施用的剂量可以根据已知因素而改变，如特定试剂的药效特性，和它的给药模式和途径；接受者的年龄，健康和体重；症状的特性和程度，并行治疗的种类，治疗的频率和想要的效果。通常，活性成分的剂量可以为每公斤体重大约0.1到100毫克。一般，每公斤每给药0.1到50,优选O.l到IO毫克，或以持续释放的形式，对获得想要的结果是有效的。适于体内给药的剂型(组合物)一般包括每单位或容器大约0.1毫克到大约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，根据组合物的总重量，按重量计算活性成分一般以大约0.5-99.999%的量存在。至于肠胃外投药，抗体可以配制成溶液，混悬液，乳剂或冻干粉末，与药学上可接受的肠胃外载体一起或单独提供。这种载体的例子是水，盐水，生理盐水，右旋糖溶液和1-10%的人血清白蛋白。脂质体和非水的载体如固定油类也可以使用。载体或冻干粉末可以包含能保持等渗性(例如，氯化钠，甘露糖醇)和化学稳定性(例如，緩沖液和防腐剂)的添加剂。可以通过已知的或适用技术对制剂进行灭菌。Remington'sPharmaceuticalSciences,A.Osol的最新版本中描述了适合的药学载体，其是本领域的标准参考教科书。已经对本发明进行了大概的描述，参考下面的实施例更容易理解本发明，实施例为了例示而提供的，而不是为了进行限定。实施例1修饰抗体的制备使用PCR扩增和重组DNA方法制备编码经修饰的Ab的基因，以a)用编码相同Ab的Vl和CL结构域的DNA序列取代编码IgGl,kAb的VH和CH1结构域的DNA序列，和b)用编码相同Ab的VH和CH1结构域的DNA序列取代编码相同Ab的Vl和Cl结构域的DNA序列。为了制备编石马VL-CL画hg-CH2-CH3HC的质库立，包含原始的LCcDNA序列的质粒p3123在重叠PCR方案中用作模板，扩增从ATG翻译起始密码子延伸到信号序列，V和Ct结构域的765bp的片段。用于51导反应的下游的寡核苷酸，更进一步地用于以编码IgGlHC铰链序列的前23个碱基置换紧接着Ck编码序列的天然存在的翻译终止密码子。其后包含原始的HCcDNA序列的质粒p3122用于扩增的715bp的片段的第二个PCR反应，所述片段包括CL编码序列的最后22个碱基(整合到上游寡核苷酸引物中)，以及其后的编码铰链，Ch2和Ch3結枸域。下游的寡核苷酸引物提供了Notl限制性位点。两个PCR产物有效地加入到包含765bp和715bp的扩增产物的第三个PCR反应中，上游寡核苷酸引物来自于第一个PCR反应，下游寡核苷酸引物来自于第二个PCR反应。扩增因此取决于在它们两个都包含的22bp的重叠序列处交叉退火(cross-annealing)的两个片段。得到的扩增产物长度为1480bp,编码VL-CL-hg-CH2-CH3,而且其两翼分别为Xbal和Notl限制性位点。用Xbal和Notl消化扩增的DNA，并克隆到载体p2106的Xbal与Notl位点之间，以形成最终的表达质粒p4034，其编码新的HC。载体p2106才是供了CMV立即早期启动子和ATG起始密码子的内含子A上游区，以及SV40来源的转录终止序列。为了制备编码VH-CH1LC的质粒，包含原始的HCcDNA序列的质粒p3122在寡核苷酸引导的PCR反应中用作模板，所述的PCR反应扩增从ATG翻译起始密码子延伸到信号序列，V和CHl结构域的808bp的片段。扩增的产物包含紧跟在位于CH1结构域的C-末端的DKKV氨基酸序列后面的翻译终止密码子。还提供了寡核苷酸引物，用于克隆，ATG起始密码子的Xbal限制性位点上游区和终止密码子的Notl限制性位点下游区。用Xbal和Notl消化扩增的DNA,并将裂解DNA克隆到质粒载体p2106的Xbal与Notl位点之间，以形成最终的表达质粒p4033,其编码新的LC。为了通过共表达新的HC和新的LC质粒来制备经修饰的Ab,将人HEK293细胞用质粒p4033和p4034通过脂质转染法进行瞬时转染。简要地，在转染前一天，把生长于含有10%FBS的DMEM中的细胞，置于6孔平板中，并于5%C02培养箱中37。C孵育过夜。第二天，lng重悬于100yl无血清培养基(Opti-MEMI)中的p4033和p4034,与10M1脂质转染试剂进行混合,并室温放置10分钟。吸出培养基使其与细胞分离，并添加含有10%FBS的新鲜DMEM。孵育以后，把DNA/月旨质转染试剂复合物添加到细胞中，并轻轻地涡漩进行混合。于5%C02培养箱中37。C更进一步地醉育72小时以后，使抗体表达和分泌，收集细胞上清液并离心以除去细胞碎屑。为了测试细胞上清液中经修饰的Ab的存在，使用4种不同的捕获试剂进行ELISA分析。96孔EIA平板用下述试剂进行涂布，a)山羊多克隆抗人IgGFc片段Ab，b)原始的AbV区特异性的C508单克隆Ab,c)原始的AbV区的个体基因型部分(抗原结合)特异性的C585单克隆Ab,和d)与C508和C585(小鼠IgG2bk)相同的同种型的阴性对照单克隆Ab。在pH9.5的0.05M的碳酸盐緩冲液中进行涂布，并于4。C孵育过夜。使用溶于PBS的1%BSA封闭平板。对来自HEK293细胞瞬时转染的细胞上清液进行连续稀释，并添加到封闭的平板上。对照样品，其含有用编码原始的、未经修饰的Ab，与纯化的原始Ab的质粒p3122与p3123同时转染的HEK293细胞的细胞上清液，用于制作标准曲线。捕获的蛋白使用HRP标记的山羊抗人Fc-y抗体与TMB底物进行检测。显色反应用0.5MHC1终止。于450nm对平一反进行读数。当抗人IgGFc片^殳Ab用作捕获试剂时，获得的阳性ELISA信号显示，Ab样分子确实存在于用经修饰的HC与经修饰的LC转染的细胞的上清液中。除非与LC结合，HC通常不从细胞分泌，该结果表明经修饰的HC与LC有可能彼此结合，从而形成IgGAb典型的(HL)2四链复合物。它还表明，山羊抗人FcAb能较好的识别经修饰的Ab的Fc结构域上的抗原表位。假设利用山羊抗人FcAb与经修饰的Ab，以及未经修饰的Ab同等地反应，使用原始的Ab标准曲线对ELISA数据进行的计算显示，经修饰的Ab的表达水平(~2.7mg/ml)与未经修饰的Ab的表达水平(~2.0jug/ml)相似。利用来源于未经修饰的Ab标准的浓度，绘制了修饰的与未经修饰的Ab样品结合抗V区AbC508与C585相对于蛋白浓度的图表。结果表明，修饰与未经修饰的Ab的结合是不能区分开的。这表示经修饰的Ab中完全保留了C508与C585单克隆Ab的V区结合位点。用于制备经修饰的Ab基因的寡核苷酸引物-新的LC5，5，-TGTCTAGA八GCTGGGTAC-3，Xba丄新的LC3，5'-AAGCGGCCGCCTAAACTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3，翻.新的HC5，5'-TGTCTAGAAGCTGGGTAC-3'Xbal新的LC重叠序列5'-GAGCTTCAACM3G(;GAGAGTGTa4GCCC掘rC7TGrG^GL^L4C-3，-3，LC的3'末端4交^i的5'末端新的LC重叠序列5,_G7TrrGrc4C/WG/1)77Cj'GGCrCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3，铰链的5'末端LC的3'末端权利要求1.一种异二聚体蛋白结合组合物，其包括一种具有重链与轻链的经修饰的免疫球蛋白分子，其中所述的免疫球蛋白分子中的一个或多个轻链结构域被免疫球蛋白重链上的一个或多个重链结构域取代，和/或一个或多个重链结构域被免疫球蛋白轻链上的一个或多个轻链结构域取代。2.权利要求1的经修饰的免疫球蛋白分子，其中VL-CL轻链结构域被免疫球蛋白重链的Vh-Ch1区域取代，而且重链的Vh-Ch1结构域被免疫球蛋白轻链的VL-CL轻链区取代。3.权利要求1的经修饰的免疫球蛋白分子，其中该免疫球蛋白分子是IgGl。4.权利要求1的经修饰的免疫球蛋白分子更进一步地包含抗原结合区。5.权利要求的经修饰的免疫球蛋白分子，其中该免疫球蛋白分子是IgA，IgG,IgM，IgE或IgD分子。6.—种编码权利要求1的经修饰的免疫球蛋白分子的多核苷酸。7.—种包含权利要求6的多核苷酸的载体。8.—种用权利要求8的载体转染的宿主细胞。9.一种生产修饰的免疫球蛋白分子的方法，其包括培养权利要求8的宿主细胞，并回收所产生的修饰的免疫球蛋白分子。10.权利要求9的方法，其中该细胞是真核或原核细胞。11.权利要求10的方法，其中该细胞是哺乳动物，鸟类，爬虫类，昆虫，植物，细菌，真菌或酵母细胞。12.权利要求11的方法，其中该哺乳动物细胞是人，兔，鼠，老鼠，仓鼠或牛的细胞。13.权利要求12的方法，其中该宿主细胞是选自下述的至少一种细胞，即COS-1，COS-7,HEK293,BHK21,CHO,BSC-1,HepG2,653,SP2/0,NS/0，HeLa,其他骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或其任何衍生物，无限增殖或转化细胞。14.一种药物组合物，其包括权利要求1的经修饰的免疫球蛋白分子和药学上可接受的载体。15.—种治疗或防止个体中感染的方法，包括给个体施用权利要求14的组合物。16.—种核酸组合物，其包含权利要求6的分离的核酸与载体或稀释剂。17.权利要求7的抗体载体，其中所述的载体包含选自晚期或早期SV490启动子，CMV启动子，HSVtk启动子，pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子，人免疫球蛋白启动子或EF-1oc启动子的至少一个启动子。18.权利要求7的抗体载体，其中所述的载体包含至少一个选自氨甲喋呤(MTX),绿色荧光蛋白(GFP),二氢叶酸还原酶(DHFR),新霉素(G418)或谷氨酰胺合成酶(GS)的至少一种选择基因或其部分。19.一种生产权利要求1的经修饰的免疫球蛋白的方法，包括翻译权利要求6的核酸或在严格条件下于体外、体内或原位条件下与其杂交的内源核酸，以可检测的或可回收的量表达所述经修饰的免疫球蛋白。20.—种调节细胞、组织、器官或动物中的至少一种紊乱或疾病的方法，包括使所述的细胞，组织，器官或动物接触紊乱或疾病调节有效量的至少一种权利要求1的经修饰的免疫球蛋白，或对所述的细胞、组织、器官或动物施用紊乱或疾病调节有效量的至少一种权利要求1的经修饰的免疫球蛋白。21.权利要求20的方法，其中所述的有效量是每千克所述的细胞、组织、器官或动物0.01-100mg。22.权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述的接触或所述的施用是通过至少一种选自静脉内，肌内，colus,皮下，呼吸，吸入，阴道，直肠，口颊，舌下，鼻内或经皮的模式。23.—种制剂，其含有至少一种权利要求1的经修饰的免疫球蛋白，以及选自无菌水，无菌緩冲的水中的至少一种，或至少一种溶于水稀释液的选自苯酚，间曱酚，对甲酚，邻甲酚，氯甲酚，苯曱醇，亚硝酸苯汞，苯氧乙醇，曱醛，氯代丁醇，氯化镁，对羟基苯甲酸烷基酯，苯扎氯铵，千索氯铵，脱氢乙酸钠和乙基汞石危代水杨酸钠，或其混合物的防腐剂。24.权利要求23的制剂，其中修饰的免疫球蛋白的浓度是大约0.1mg/ml到大约100mg/ml。25.权利要求24的制剂，更进一步地包含等渗性试剂。26.权利要求25的制剂，更进一步地包含生理学上可接受的緩冲液。27.—种制剂，其含有装于第一个容器中的冻千形式的至少一种权利要求1的经修饰的免疫球蛋白，以及任选的第二个容器，其含有无菌水，无菌緩冲的水，或至少一种溶于水稀释液的选自苯酚，间曱酚，对甲酚，邻曱酚，氯曱酚，苯甲醇，亚硝酸苯汞，苯氧乙醇，曱醛，氯代丁醇，氯化镁，对羟基苯曱酸烷基酯，苯扎氯铵，千索氯铵，脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物的防腐剂。28.—种治疗患者中的疾病或不适的方法，包括对需要其的患者施用权利要求24的制剂。29.—种生产至少一种权利要求1的经修饰的免疫球蛋白的方法，包括使一种宿主细胞或转基因动物或转基因植物或植物细胞以可回收的量表达所述的抗体或特定部分或变体。30.权利要求29的方法，其中所述的宿主细胞是哺乳动物细胞，植物细胞或酵母细胞。31.权利要求30的方法，其中所述的转基因动物是哺乳动物。32.权利要求33的方法，其中所述的转基因哺乳动物选自山羊，牛，绵羊，马和非人灵长类动物。33.—种表达至少一种权利要求1的抗体的转基因动物或植物。34.通过权利要求29的方法生产的至少一种修饰的免疫球蛋白。35.—种修饰具有FcR结合结构域和Clq结合结构域的免疫球蛋白分子募集效应因子的功能的方法，所述的效应因子在诸如ADCC,FcR介导的吞噬作用和补体裂解中起作用，该方法包括用免疫球蛋白重链上的一个或多个重链结构域取代一个或多个轻链结构域，和/或用免疫球蛋白分子的免疫球蛋白轻链上的一个或多个轻链结构域取代一个或多个重链结构域，从而重新调整FcR结合结构域和Clq结合结构域相对于免疫球蛋白分子的抗原结合结构域的相对位置。全文摘要本发明涉及一种通过替换IgGFab结构域内的重链和轻链序列，以重新调整Fc结构域相对于抗原结合结构域的位置，来制备修饰的免疫球蛋白组合物，从而使抗原结合和效应因子功能最大化。文档编号C07K16/00GK101218251SQ200680014555公开日2008年7月9日申请日期2006年2月24日优先权日2005年2月28日发明者B·斯卡伦申请人:森托科尔公司