专利名称：一种用于活性电泳的高分子量蛋白标准物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于活性电泳的高分子量蛋白标准物。本发明还涉及微管蛋白作为高分子量蛋白标准物的用途。
本发明的另一个目的是提供一种微管蛋白的用途。
微管蛋白是生物细胞中一种非常保持的水溶性球状蛋白质，分子量为55kDa。人们对微管蛋白的研究主要集中在它的结构、性质与功能的基础研究上。过去一直认为，微管蛋白在体外缓冲溶液中一般以二聚体形式存在；在25℃度至37℃温度范围，当提供鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)时(或其他条件)，微管蛋白二聚体会不断聚合，最后形成长长的微管。
我们在研究中发现微管蛋白在水溶液(如纯化微管蛋白用的PEM缓冲液，或常规电泳用的样品缓冲液)中不仅有二聚体形式存在，还有单体和各种形式的寡聚体存在；而且这些不同形式的微管蛋白聚合体之间，分子量呈阶梯状增加，相邻条带差别为55kDa；微管蛋白的这些存在形式对温度和pH的变化不敏感，在pH为7-10时，无论在普通冷柜(4-8°)条件下进行电泳，还是在室温条件进行电泳，都能得到良好的结果。我们的研究证明从新鲜脑组织中纯化的微管蛋白产品，非常适宜用作非变性蛋白质电泳的分子量标准物。
用聚合-解聚的方法从新鲜脑组织中纯化微管蛋白，可参照Williams等报道的传统方法(Meth.Enzymol，1982，85，Part B，376)。所用技术为常规技术，方法很成熟，已被国内外专家、学者广泛引用。
因而，本发明提供了一种用于活性电泳的高分子量蛋白标准物，它是微管蛋白的水溶液。其中，所述的水溶液的pH值最好为7-10。可以是PEM缓冲液，磷酸缓冲液，蛋白质电泳缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。对这些缓冲液没有特别的限制，只要他们能够将溶液调节到所需要的pH值。
本发明还提供了微管蛋白作为高分子量蛋白标准物的用途。其中，所述的微管蛋白存在于水溶液中，例如，可以是PEM缓冲液，磷酸缓冲液，蛋白质电泳缓冲液或者Tris-HCl缓冲液中。
较之目前市场上的其它分子量标准物，我们的产品优势在于仅用一种材料、一套技术、一次实验，就能获得含有6种不同分子量组分以上的产品。而其它分子量标准物必须用多种材料、多套技术、多次实验才能获得。
图2显示不同pH条件下本产品的分子量分布(新制备的产品)。其中，A.用PIPES缓冲液配制的产品 B.含25％甘油的产品。MAmershamPharmacia Biotech公司高分子量蛋白标准物 1-5产品上样pH值依次为5，7，9，10，12。
图3显示-20℃保存过的产品在不同pH条件下的电泳行为。其中，A.用PIPES缓冲液配制的产品 B.含25％甘油的产品。MAmershamPharmacia Biotech公司高分子量蛋白标准物 1-5本产品在不同pH值(5，7，9，10，12)下的电泳行为。
图4显示不同温度电泳条件下本产品的电泳行为(-20℃保存过的产品)。其中，A.4℃下电泳 B.室温下电泳。MAmersham PharmaciaBiotech公司高分子量蛋白标准物 1-5pH值分别为5，7，9，10，12
1mol/L PIPES，PH6.91.5mmol/L MgCl22mmol/L GTP20％DMSO二、所需仪器天平，匀浆器，冰箱，水浴锅，高速冷冻离心机，超速离心机。三、工艺流程4℃匀浆→4℃高速离心→4℃超速离心→37℃水浴→30℃超速离心→冰浴→4℃超速离心→37℃水浴→30℃超速离心→冰浴→4℃超速离心→37℃水浴→30℃超速离心→冰浴→4℃超速离心四、操作步骤(一)天然高分子量标准物的初步纯化1.取三个新鲜猪脑(约300克)，去除表面膜、血管及脂肪，然后用预冷的重蒸水冲洗。
2.在组织匀浆机中加入240ml 4℃预冷的PEM-4M缓冲液，将猪脑剪碎后置于其中，匀浆。匀浆液在4℃放置30分钟。
3.将匀浆液在4℃下10,000g离心30分钟。取上清液，4℃下100,000g离心1小时。
4.量取上清液体积V1，加ATP至2.5mmol/L，GTP至1mmol/L，37℃水浴1小时进行聚合。
5.聚合溶液在30℃下100,000g离心1小时。
6.将沉淀溶解在1/4 V1冰冷的PEMG缓冲液中，冰水中解聚1小时(可用玻璃组织研磨器促进解聚)。
7.将解聚溶液在4℃下100,000g离心1小时。取上清液，加入等体积PEM-8M缓冲液，并加入GTP至1mmol/L，37℃水浴1小时进行二次聚合。
8.将二次聚合溶液在30℃下100,000g离心1小时。弃上清液，留沉淀。
9.将沉淀溶于4℃预冷的0.1M PEM缓冲液中，冰水中解聚1小时。
10.将解聚溶液在4℃下100,000g离心20分钟。上清液即为经过两个聚合—解聚循环的粗产品。(二)天然高分子量蛋白标准物的进一步纯化1.在粗产品中加入等体积PMGD缓冲液，37℃水浴30分钟进行聚合。
2.将聚合溶液在30℃下50,000g离心30分钟。弃上清液，量出沉淀体积(V2)3.在沉淀中加入4V2的0.1M PEM缓冲液，冰水水浴中解聚1小时。
4.将解聚溶液在4℃下50,000g离心20分钟，上清液即为高纯度终产品。(三)蛋白质浓度测定按常规方法对终产品进行蛋白质浓度测定，计算总得量。一般100克脑组织至少获得16mg纯品。五、产品保存和使用说明(一)产品保存纯化获得的产品为水溶液，根据上面测得的蛋白质浓度结果，将产品稀释为2mg/ml(稀释过程中注意加入甘油，使甘油终浓度为25％，因为甘油具有保护作用)，然后分装，-20℃保存、待售。(二)产品说明此高分子量蛋白标准物含一种蛋白，即微管蛋白，为水溶性。经聚丙烯酰胺凝胶活性电泳分离显示，该产品实际有效组分为6种以上，分子量由低到高依次为55kDa、110kDa、165kDa、220kDa、275kDa、330kDa等。相邻条带相差55kDa。(三)使用方法使用时，加入5倍的普通非变性电泳加样缓冲液(0.31MTris-HCl，pH6.8；甘油50％，溴酚兰0.05％)。使高分子量蛋白标准物浓度达1.5mg/ml。上样量10μg-20μg/道，视电泳胶大小不同。六、产品鉴定(一)产品纯度及分子量鉴定利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶变性电泳法鉴定纯度。分离胶浓度7.5％。从
图1(道2)看出，粗产品中尚有微量高分子量杂蛋白。但经过进一步纯化，终产品为电泳一条带(图1，道3)，亚基分子量为55kDa。(二)产品分子量活性电泳分析活性电泳分离胶为7.5％。
从图2(道2，道3)看出，在pH为7-9时，产品自下而上出现至少6条清晰的带，比Sigma公司产品带型分布(道M)均匀，且分子量范围适中，分别为55kDa、110kDa、165kDa、220kDa、275kDa、330kDa。此外上面还可以看到分子量为385kDa，440kDa的条带。(三)产品pH稳定性分析用pH值分别为5.0，7.0，9.0，10.0，12的0.1M PEM缓冲液溶解产品沉淀，冰水中解聚后离心，所得上清即为不同pH条件下的样品。4℃下对其进行活性电泳。从图2，3，4的道1-5看出，产品对酸碱不敏感，表现出很好的pH稳定性。因此，可以保证在常规电泳pH的情况下标准物不发生组分解离等变化。(四)产品对冷冻储存稳定性的分析一般活性蛋白质产品在25％甘油中能长期冷冻保存。本产品在没有甘油(图3，A)和有甘油的情况下(图3，B)，蛋白质分子量图谱分布不变。产品对-20℃冻存表现出良好的稳定性，证明可以-20℃冻存。(五)产品对电泳温度的稳定性分析上述结果已经证明，产品在4℃条件下电泳时，表现出很好的稳定性。在室温下电泳时，从图4B看出，产品的分子量分布没有变化，证明产品对电泳温度适应性广。七、附其它类似产品参考价格(一)Sigma(1999年)MW-ND-500KIT FOR Molecular Weights(14,000-500,000)，5mg包装，价格为80.30美元。含7种组分，分子量分别为14kDa-29kDa-45kDa-66kDa-132kDa-272kDa-545kDa。(二)Amersham Pharmacia Biotech(2001年)HMW Native Marker kit，2.5mg包装，价格为115美元。含5种组分，分子量分别为66kDa-140kDa-232kDa-440kDa-669kDa。
权利要求
1.一种用于活性电泳的高分子量蛋白标准物，它是微管蛋白的水溶液。
2.按照权利要求1所述的高分子量蛋白标准物，其中，所述的水溶液的pH值为7-10。
3.按照权利要求1所述的高分子量蛋白标准物，其中，所述的水溶液是PEM缓冲液，磷酸缓冲液，蛋白质电泳缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
4.微管蛋白作为高分子量蛋白标准物的用途。
5.按照权利要求4所述的用途，其中，所述的微管蛋白存在于水溶液中。
6.按照权利要求4所述的用途，其中，所述的微管蛋白存在于PEM缓冲液，磷酸缓冲液，蛋白质电泳缓冲液或者Tris-HCl缓冲液中。
全文摘要
本发明提供了一种用于活性电泳的高分子量蛋白标准物，它是微管蛋白的水溶液。本发明还提供了微管蛋白作为高分子量蛋白标准物的用途。
文档编号G01N33/68GK1412558SQ0113653
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月15日 优先权日2001年10月15日
发明者刘国琴, 曹勤红, 任东涛 申请人:中国农业大学