一种木薯蛋白质双向电泳凝胶的制作方法
【专利摘要】本发明提出了一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，原料配方中，30％丙烯酰胺溶液和40％丙烯酰胺溶液混合使用。本发明中的用于木薯蛋白质双向电泳的凝胶，只改变丙烯酰胺的混合方式，操作简单，等同条件下可提高凝胶的分辨率，可重复率高，符合实验要求。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术检测领域，尤其是涉及用于对木薯蛋白质双向电泳检测的凝 胶。 一种木薯蛋白质双向电泳凝胶
【背景技术】
[0002] 木薯富含淀粉，其块根可食用，可磨木薯粉等，但是木薯块根中含有少量的蛋白质 和微量营养物质；现有研究中可以通过对木薯进行遗传改造，提高其块根中蛋白质的含量。
[0003] 目前，常采用双向电泳技术对蛋白质进行分离。由于其步骤较多，要得到一张分辨 率较高的双向电泳图谱并非一件易事。安飞飞等发表在《热带农业科学》上的《影响木薯叶 片蛋白质双向电泳图谱的因素分析》就对影响木薯双向图谱的因素进行了分析，包括上样 量、pH值及过硫酸铵等因素，其中并未对凝胶成分对图谱的影响进行分析。目前对蛋白质 凝胶检测时，常采用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其配方主要为丙烯酰胺溶液、Tris溶液、 SDS溶液、APS溶液和TEMED等。然而木薯叶片中糖类多酚类物质含量较多，块根淀粉较多， 而蛋白质含量较低，淀粉等杂质会干扰传统聚丙烯酰胺凝胶对木薯蛋白质检测的准确性， 会出现凝胶分辨率较差，实验的重复率低等问题，不能满足实验需要。
【发明内容】
[0004] 本发明提出一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，解决了现有技术中木薯蛋白质检测 时，分辨率差，重复率低的问题。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种木薯蛋白质双向电泳的凝胶，原料配方中，30%丙烯酰胺溶液和40%丙烯酰 胺溶液混合使用。
[0007] 进一步优选地，所述的30%丙烯酰胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合体积比例 为 1 : (6 ?10)。
[0008] 进一步优选地，所述的30 %丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液的混合体积比例 为 1:8。
[0009] 进一步优选地，所述的30 %丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液的混合体积比例 为 1:9。
[0010] 其中，优选地，一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，原料配方如下：30%丙烯酰胺溶液、 40%丙烯酰胺溶液、SDS溶液、APS溶液、TEMED、Tris溶液和双蒸水，进一步优选地，所述的 Tris溶液pH值为8.8。
[0011] 其中，SDS为十二烷基磺酸钠，APS为过硫酸铵；TEMED(N，N，N'，N'-Tetramethylet hylenediamine)，中文名为N, N, Ν'，Ν' -四甲基乙二胺；Tris为三轻甲基氨基甲烧。
[0012] 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)配制或上述凝胶的配制中，参照《分子克隆实验指 南》关于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的关于凝胶配制方法的记载，主要步骤如下：凝胶原料 混合后，加入到成胶板中，待到凝固即可。
[0013] 本发明的有益效果如下：
[0014] 聚丙烯酰胺凝胶，是实验室常用的凝胶电泳材料，尤其应用于生命科学领域；聚丙 烯酰胺是由丙烯酰胺单体经过加成聚合反应所产生出来的，具体地，丙烯酰胺单体和交联 剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（APS和TEMED)的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长 链，相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶；本发明中 采用的原料中，采用30%丙烯酰胺溶液和40 %丙烯酰胺溶液混合使用，作为凝胶的丙烯酰 胺聚合原料，保持反应体系中（如150ml和200ml等）的丙烯酰胺溶液的使用体积不变，这 样使丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺处于较为平衡的混合比例，形成的聚丙烯酰胺凝胶的网状 结构，有效分离木薯蛋白质，分辨率高，同时重复率较好。
[0015] 本发明中的用于木薯蛋白质双向电泳的凝胶，只改变丙烯酰胺的混合方式，操作 简单，等同条件下可提高凝胶的分辨率，可重复率高，符合实验要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1和图2为实施例1中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图；
[0017] 图3和图4为实施例2中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图；
[0018] 图5和图6为实施例4中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图；
[0019] 图7和图8为实施例5中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图；
[0020] 图9和图10为对比例1中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图；
[0021] 图11和图12为对比例2中木薯块根和叶片的双向电泳凝胶结果图。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属 于本发明保护的范围。
[0023] 实施时，参照分子克隆实验指南关于聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)的记载，进行 配制原料溶液，其中，包括30%丙烯酰胺溶液、40 (%丙烯酰胺溶液、1.511^8(?!18.8)、 10% SDS溶液、10%过硫酸铵溶液和TEMED。另外传统的凝胶电泳配方中，具体配比如 下（以150ml为反应体系）：（1) 30 %丙烯酰胺（58. 5ml) ;Tris8. 8 (56. 3ml);双蒸水 (32.25ml) ;10%SDS(1. 5ml) ;10%APS(1. 5ml) ;TEMED(60 μ 1) ; (2)40%丙烯酰胺（44ml); Tris8.8(56.3ml);双蒸水（46.85ml) ;10%SDS(1.5ml) ;10%APS(1.5ml) ;TEMED(60yl); 实施时参照传统凝胶电泳配方和方法进行配比。
[0024] 实施例1 一种木薯蛋白质双向电泳凝胶
[0025] -种木薯蛋白质双向电泳凝胶，具体制备配方如下：
[0026] 30 %丙烯酰胺溶液8. 35ml、40 %丙烯酰胺溶液50. 15ml、Tris溶液 (ρΗ8· 8)56. 3ml、双蒸水 32. 25ml、10% SDS 溶液 1. 5ml、10% APS 溶液 1. 5ml、TEMED60y 1。
[0027] 制备时，将上述的原料依次混合，加入到制胶板中，待到凝固后即可使用或备用。
[0028] 木薯块根和叶片蛋白质双向电泳的步骤如下：
[0029] 木薯的块根和叶片总蛋白的提取：利用苯酚抽提法提取总蛋白；植物组织用液氮 研磨，加入1倍体积的提取缓冲液提取液[5%鹿糖（m/v)，0. 1M Tris(pH8. 0)，50mM DTT， 20% SDSOn/v)，〗1%蛋白酶抑制剂（v/v)]研磨至粉末，4°C下lOOOOrpm离心20min。取下 层液，加入等体积Tris-Hcl缓冲液饱和酚匀浆，离心，收集苯酚相以及界面，丢弃水相与沉 淀，加入5倍体积含0. 1M NH4AC (乙酸铵）的冷甲醇，-20°C过夜后离心，沉淀悬浮于含0. 1M NH4AC的甲醇，洗涤三次，冷丙酮洗涤一次，4°C真空干燥，得到粉末状蛋白。
[0030] 蛋白质的第一维等电聚焦电泳；用蛋白质溶解液[9. 5M尿素，2M硫脲，1%DDT，4% CHAPS，2. 5mM EDTA，2. 5mM EGTA]溶解上述制备的蛋白质样品；将溶解好的样品与蛋白质水 化液RB[7M尿素，2M硫脲，3% CHAPS, 0· 5% Trixon-100,7mgDTT/2. 5ml RB]混合，将制备完 毕的置于第一维等电聚焦的聚焦盘中，用IPG胶条覆盖蛋白质样品，水化12-16h后进行电 泳；电压参数：300V 梯度 5min ;300V 稳定 10min ;3500V 梯度 90min，3500V 稳定 4h40min (4 小时40分钟），300V梯度60min。
[0031] 蛋白质第二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用实施例中制备的双向电泳凝胶；将等电 聚焦后的胶条置于含有DTT的SDS平衡盐缓冲液[50mM Tris-HCl，pH8.8,6M尿素，30% (v/ v)甘油，2% (w/v)SDS]，平衡盐缓冲液和DDT的配比为10ml:0. lg中，轻轻摇动20min。胶 条随后转入含有IAA的SDS平衡盐缓冲液中（平衡盐缓冲液和IAA的配比为10ml: 0. 25g)， 轻轻摇动20min。然后将IPG胶条置于实施例制备的双向电泳凝胶（SDS-PAGE)上，100V电 泳10min，后将电压增至160V直到电泳结束。随后对电泳凝胶进行考染分析。
[0032] 木薯块根和叶片的双向电泳结果如图1和图2所示。
[0033] 实施例2 -种木薯蛋白质双向电泳凝胶
[0034] 一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，具体制备配方如下：
[0035] 30%丙烯酰胺溶液 5. 3ml、40%丙烯酰胺溶液 53. 2ml、Tris 溶液（pH8. 8)56. 3ml、 双蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0036] 木薯块根和叶片蛋白制备、电泳方法与实施例1相同，利用本实施例中制备的双 向电泳凝胶；木薯块根和叶片蛋白质双向电泳的结果如图3和图4所示。
[0037] 实施例3 -种木薯蛋白质双向电泳凝胶
[0038] -种木薯蛋白质双向电泳凝胶，具体制备配方如下：
[0039] 30%丙烯酰胺溶液 7. 3ml、40%丙烯酰胺溶液 51. 2ml、Tris 溶液（pH8. 8)56. 3ml、 双蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0040] 木薯块根和叶片蛋白质制备、电泳方法与实施例1相同利用本实施例中制备的双 向电泳凝胶。
[0041] 实施例4 一种木薯蛋白质双向电泳凝胶
[0042] -种木薯蛋白质双向电泳凝胶，具体制备配方如下：
[0043] 30%丙烯酰胺溶液6. 5ml、40%丙烯酰胺溶液52ml、Tris溶液（pH8. 8)56. 3ml、双 蒸水 32. 25ml、10 % SDS 溶液 1. 5ml、10 % APS 溶液 1. 5ml、TEMED60 μ 1。
[0044] 木薯块根与叶片蛋白质制备与电泳的制备方法与实施例1相同，利用本实施例中 制备的双向电泳凝胶，块根与叶片蛋白质双向电泳结构如图5和图6所示。
[0045] 实施例5 -种木薯蛋白质双向电泳凝胶
[0046] -种木薯蛋白质双向电泳凝胶，具体制备配方如下：
[0047] 30 %丙烯酰胺溶液5. 85ml、40 %丙烯酰胺溶液52. 65ml、Tris溶液 (ρΗ8· 8)56. 3ml、双蒸水 32. 25ml、10% SDS 溶液 1. 5ml、10% APS 溶液 1. 5ml、TEMED60y 1。
[0048] 木薯块根与叶片蛋白质制备与电泳的制备方法与实施例1相同，利用本实施例中 制备的双向电泳凝胶，块根与叶片蛋白质双向电泳结构如图7和图8所示
[0049] 对比例1利用30 %丙烯酰胺溶液配置双向电泳凝胶
[0050] 以 150ml 为体系：30%丙烯酰胺 58. 5ml ;Tris(8. 8)56. 3ml ;双蒸水 32. 25ml ;10% SDS1. 5ml ；10% APS1. 5ml ；TEMED60y l〇
[0051] 木薯块根与叶片蛋白质制备与电泳的制备方法与实施例1相同，利用本对比例中 制备的双向电泳凝胶，块根与叶片蛋白质双向电泳结构如图9和图10所示。
[0052] 对比例2利用40 %丙烯酰胺溶液配置双向电泳凝胶
[0053] 以 150ml 为体系：40% 丙烯酰胺 44ml ;Tris8. 856.3ml ;双蒸水 46. 85ml ;10 % SDS1. 5ml ；10% APS1. 5ml ；TEMED60y l〇
[0054] 木薯块根与叶片蛋白质制备与电泳的制备方法与实施例1相同，利用本对比例中 制备的双向电泳凝胶，块根与叶片蛋白质双向电泳结构如图11和图12所示。
[0055] 参照附图1-12中，实施例1-5中记载的配方中，制备的木薯蛋白质双向电泳凝胶， 分离木薯块根和叶片蛋白质时，分辨率和实验重复率明显优于对比例1和对比例2双向电 泳凝胶。尤其是实施例4和实施例5制备的双向电泳凝胶，参照附图5-8中，考染后蛋白质 点清晰度相对于对比例1和2的传统凝胶方法较好，并且分辨率和实验重复率更优。
[0056] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是，原料配方中，30 %丙烯酰胺溶液和40 % 丙烯酰胺溶液混合使用。
2. 如权利要求1所述的一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合体积比例为1 :出?10)。
3. 如权利要求2所述的一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合体积比例为1:8。
4. 如权利要求2所述的一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是：所述的30%丙烯酰 胺溶液和40%丙烯酰胺溶液的混合体积比例为1:9。
5. 如权利要求1-4任一项所述的一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是，原料配方 如下：30%丙烯酰胺溶液、40%丙烯酰胺溶液、10%SDS溶液、10%APS溶液、TEMED、Tri S溶 液和双蒸水。
6. 如权利要求5所述的一种木薯蛋白质双向电泳凝胶，其特征是：所述的Tris溶液pH 值为8. 8。
【文档编号】G01N27/26GK104101629SQ201410299101
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】安飞飞, 陈松笔, 李开绵, 陈霆 申请人:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所