用于具有原位校准的凝胶电泳的组合物和方法
【专利摘要】除其他事项外，本发明涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结合以形成最终体积，其中，该体积的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比率。该方法还包括将上样部分沉积在电泳凝胶的接收孔中，其中，所述上样部分是最终体积的一部分，并且沿着电泳凝胶的共用分离泳道分开上样部分使得测试样品的组分以及校准物沿着共用分离泳道彼此分离。该方法还包括检测共用分离泳道内的校准物以及分离的测试样品组分并且基于检测，测量校准物和分离的测试样品组分的水平，从而进行具有原位校准的电泳。
【专利说明】用于具有原位校准的凝胶电泳的组合物和方法
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年5月29日提交的美国临时专利申请第61/652,608号和于 2013年3月13日提交的美国临时专利申请第61/779, 567号的优先权，通过引用将其各自 的全部内容结合于此。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及凝胶电泳领域，并且具体地是在电泳基质内原位校准。
【背景技术】
[0004] 电泳是在大小、电荷，以及其他物理性质的基础上用来分离带电荷物质的技术。电 泳中，在电场的作用下带电荷物质通过导电电泳介质迁移，其可以是（但不要求是）凝胶。 定位在电泳介质任一端的活化的电极提供了用于迁移的驱动力。分子的性质（包括它们的 电荷和质量）决定了电场引起它们通过电泳介质迁移的快速程度。
[0005] 许多重要的生物分子，如氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸，和核酸具有可电离基团。因 为这些在任何特定pH下可电离的基团，许多重要的生物分子作为带电荷物质存在于溶液 中。该带电荷物质使得医生和科学家能够使用电泳分离核酸和蛋白质。
[0006] 使用电泳分离生物或其他类型的分子依赖于不同的力，包括电荷和质量。当生物 样品，如蛋白质或DNA在缓冲液中混合并且施加至电泳介质中时，这两种力共同作用。使用 电泳来分离是可能的，因为分子通过电场的迁移速率依赖于电场的强度、分子的电荷、大小 和形状，以及分子通过其移动的缓冲液的离子强度和温度。在电泳期间，基于分子的电荷， 施加的电场致使分子移动穿过电泳介质的孔。一个电极上的电位排斥该分子而另一电极的 电位同时吸引该分子。电泳介质的摩擦力也有助于通过尺寸分离分子。通常，解除所施加 的电场后，该分子可被染色。染色后，可以在从电泳介质的一端到另一端展开的一系列的带 中看见分离的大分子。如果这些带足够清楚，通过固定大分子以及清洗电泳介质以除去缓 冲液，可以单独检查和研究这些区域中的分子。
[0007] 电泳凝胶的灌胶，如聚丙烯酰胺或琼脂糖的灌胶，通常是通过在凝胶表面创建一 系列样品孔来完成。通常使用移液枪、注射针、电泳梳，或相似的样品递送设备将要分析的 液体混合物上样至孔中。然而，样品内条带的分辨率仅与使用样品的宽度一样好，并且由 于小样品体积受到表面张力（建立超过在特定孔中添加样品所期望的分辨率的胶束直径） 这类条带的分辨率较差并且可改变。此外，微体积通常以2-D样的方法施加，其防止体积施 力口。进一步，凝胶内的样品动力学相对于无溶液化学被限制；自由度的损害负面影响了均一 的产物或加合物的显影，除了在定位的区域（其通常在尺寸上仅有几个样品泳道）。由于这 些原因，在IuL水平下样品可再现性通常太不精确以至于不为临床或分析所接受。
[0008] 此外，不使用外部的方法确定电泳基质内分离的测试样品部分的浓度存在极大的 困难。尝试在电泳检测内结合这类内参标准都没有成功。由于可变的亲和力和染料的结合 特性，多价抗血清和多种蛋白质的传统的尝试失败。特性和位置参照的定量标记物是可用 的，但没有使用内部参考标准，其允许用于电泳分离部分的浓度不依赖外部方法绝对定量。
[0009] 在该领域不存在预测技术。电泳一直是并且仍然是"全部"化学性质的分析衍生 物，其中，样品的全部组分经受同样的处理。不通过沉淀、捕获，或其他方法除去组分；它们 在相同的基质上分离并且通过逆转该过程而重新结合。该事实限制了电泳产生绝对量值的 能力。常规的电泳测量了相对浓度，即，它计算了作为来自翻译为信号以产生电泳图的检测 条带的曲线下面积的百分数部分。具体地，电泳后染色凝胶通过光密度计的光学系统以产 生电泳图，其是分离条带的可视化图或曲线图。光密度计是特殊的分光光度计，其测量穿过 固体样品发射的光，如清晰的或者透明但染色的凝胶。使用光密度测定，光密度计将条带表 示为峰。这些峰构成了曲线图或电泳图并且打印在记录器用纸或电脑显示器上。用光密度 测定法测量吸光度和/或荧光。积分器或微处理器评估每个峰下的面积并且将每个报告为 总样品的百分数。例如，如果电泳用于血清蛋白的分离，各条带的浓度来自该百分比和总蛋 白质浓度；如果电泳用于酶的分离，各条带酶的活性来自该百分比和总的酶活性。
[0010] 因此，常规的电泳只能对样品中检测到的所有条带分配相对的百分比值。例如， 如果针对胆固醇显影多个条带，由光密度计提供的相对百分数和外部提供的总胆固醇值成 比例地分布于部分之间，以确定绝对浓度。例如由光密度计检测两个条带-第一个是检测 出的总信号的25 %以及第二个是75 %。假如总分析物浓度为200mg/mL，第一条带是50mg/ mL(0. 25x200mg/mL)，第二条带是150mg/mL(0. 75x200mg/mL)。在凝胶上和/或每个单个的 样品上不存在方法以提供校准物。
[0011] 因为电泳图案仅仅作为其分辨率是有用的，并且由于上面提到的问题，对于消除 与凝胶电泳技术相关的样品间的变化性以及样本内的误差的方法和/或系统存在极大需 要。
[0012] 本发明旨在克服本领域中的这些和其他的缺陷。
【发明内容】
[0013] 本发明的一个方面涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定 体积的（avolumeof)测试样品与一定体积或一定量的（aquantityof)校准样品结合以 形成最终体积，其中，该体积或量的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测 试样品与校准样品的已知比例。该方法还包括在电泳凝胶的上样孔中沉积上样部分，其中， 上样部分是最终体积的一部分并且沿着电泳凝胶的共同分离泳道分离上样部分，使得测试 样品的组分和校准物沿着共同分离泳道彼此分开。该方法还包括检测所述共同分离泳道内 的校准物和测试样品的分离的成分，并基于检测，测量了校准物和测试样品的分离的组分 的水平，从而进行具有原位校准的电泳。
[0014] 本发明提供了重要的和出人意料的优点。在简单的例子中，用与测试样品的未知 组分相同的报告物将待测的已知浓度的分析物（即，校准物）预标记。加标记的内标和未 知组分按体积结合并且应用校准物和未知样品二者，并且同时进行电泳。分析显示未知部 分的电泳图以计算相对于内部参考标准（即，校准物）的未知组分的浓度。因此，给定已 知浓度的内部标记校准物，以及校准物和样品的限定体积比的情况下，单点校准物的方案 可以用来计算未知分析物的浓度（如本领域技术人员所熟知的）。在本申请中公开的方法 消除了方法间的浓度变化以及对于外部检验的需要，并且提供了加强的样品内控制和置信 度，节省了时间，成本和方法间的变化。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是显示提供用于进行如本发明所描述的电泳的测试样品（例如，生物样品） 和校准样品的示例性的初始体积的示意图。该实施例的生物样品含有一种或多种感兴趣的 组分（未知物或分析物）并且校准样品包括如本发明描述的校准物。该体积的校准样品包 括已知浓度的校准物。该体积的测试样品包括未知浓度的一种或多种感兴趣的组分。测试 样品的体积和校准样品的体积各自都是已知的。如示意图示出的，所述体积的测试样品和 所述体积的校准样品结合或混合成最终已知的体积（即，校准样品的体积+测试样品的体 积）。
[0016] 图2是示出了示例性凝胶电泳仪和梳子涂布器的示意图。可以用电泳梳将混合样 品施加到凝胶。该电泳梳可以包括一维的齿阵列，每个能在一个单个的起始线上将约1微 升样品递送至凝胶用于对应于电泳梳的齿的每个电泳泳道。如图2所示，该凝胶与施加的 样品的每一侧的电极接触。该装置可以包括含有位于其体积内的如图2所示的电泳装置的 外壳，在进行凝胶电泳之前，它装有缓冲溶液。
[0017] 图3是一个示意图，显示了进行凝胶电泳后示例性的电泳凝胶，从而分离测试样 品的一种或多种组分和校准物。如该示例性实施例所示，每个泳道中的校准物和测试样品 的一种或多种组分通过凝胶电泳分离并且用荧光材料标记。
[0018] 图4A-4B是示出了进行凝胶电泳后在示例性电泳凝胶上检测荧光强度的示意图。 图4A示出了使用检测装置以检测来自电泳样品泳道内的测试样品（Iu)的组分或未知物上 的荧光材料（或荧光标记）的荧光强度（I)。图4B示出了检测来自在与图4A示出的待检 测的测试样品的组分相同的泳道中的已知的校准样品（Ic)上的荧光材料（或荧光标记） 的荧光强度。连同已知浓度的校准物和已知的体积可以使用这两个测量的强度以计算一种 或多种组分的浓度。如图4A和4B所示，检测设备可以包括计算装置，其包括，例如光学检 测软件。
[0019] 图5A-5E示出了根据本发明的一个实施方式进行具有原位校准的凝胶电泳的结 果。具体地，将含有未知浓度的脂颗粒的四种血清样品与相应的已知浓度的荧光素标记的 白蛋白混合。该样品进行凝胶电泳，然后与荧光素标记的抗apoB抗体接触。所得凝胶的图 像示于图5A，以及该图像分别对应于在图5B-5E中再产生的样品1-4的每一个。然后用荧 光计扫描该凝胶，将所得的峰绘制如图5B-5E所示。在图5B-5E中，在左侧的凝胶的图像中 LDL、VLDL、LP(a)，以及校准物可视觉上辨别并且右图示出了根据本发明的分离的组分的定 量结果。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的一个方面涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定 体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结合以形成最终体积，其中，所述一定体 积或一定量的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品和校准样品的 已知比例。该方法还包括在电泳凝胶的接收孔中沉积上样部分，其中，上样部分是最终体积 的一部分并且沿着电泳凝胶的共同分离泳道分离上样部分，使得测试样品的组分和校准物 沿着共同分离泳道彼此分开。该方法还包括检测所述共同分离泳道内的校准物和测试样品 的分离的成分，并基于检测，测量了校准物和测试样品分离的组分的水平，从而进行具有原 位校准的电泳。
[0021] 该测试样品可以是生物样品。合适的生物学样品或生物样品包括人体生物基质、 尿、血浆、血清，以及人脂蛋白部分。例如，该样品可以是新鲜的血液或储存的血液或血液部 分。该样品可以是专门针对本发明测定所获得的血液样品，或者是为了其他目的获得的血 液样品（其可以被二次取样以用于根据本发明描述的方法的应用）。例如，生物样品可以 是全血。使用标准的临床方法可以从受试者获得全血。生物样品也可以是血浆。通过抗凝 血离心可以从全血样品获得血浆。该生物样品也可以是血清。可以按照需要通过稀释于适 当的缓冲溶液中来预处理样品，如果需要的话将其进行浓缩，或将其通过任何数量的方法 进行分级，所述方法包括但不限于超速离心、通过快速高效液相层析（FPLC)进行分级、或 沉淀。可以使用多种标准水性缓冲溶液中任何一种，使用多种缓冲液中的一种，如磷酸盐， Tris等（在生理至碱性pH下）。
[0022] 如上所述，该方法包括将一定体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结 合以形成最终体积，其中，所述体积的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括 测试样品与校准样品的已知比例（如，体积比）。
[0023] 如本领域普通技术人员应该理解的，可以用一定体积的校准物或用，例如已知量 的校准物进行该方法。贯穿本文的描述，应该理解的是，提及一定体积的校准物，可以替代 已知量的校准物。例如可以在样品杯或孔的壁上干燥校准物并且在加入所述体积的测试样 品后重新溶解。特别地，在样品孔内干燥该校准物后，剩余的残余物保持校准物浓度，如荧 光标记的校准物的浓度，而不影响体积。在加入样品后，可以重新构成标记的校准物并且结 合至样品-校准物"混合物"的最终体积内而不影响脂质颗粒浓度。为了方便和简明，电泳 样品孔可以在样品沉积之前以这种方式制备。因此，本发明的另一方面涉及以这种方式制 备的电泳凝胶，以及包括这样的凝胶和用于进行本发明描述的方法的说明书的试剂盒。
[0024] 将所述体积的测试样品与所述体积的校准样品结合以形成最终体积，这可以通过 任何合适的方法进行。可以将该体积的校准样品加入到一定体积的测试样品中或可以将一 定体积的测试样品加入到一定体积的校准样品中，只要校准样品中的校准物的浓度是已知 的，并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比率（如，体积比率）。以这种方式，计算 在最终体积中的测试样品的组分的浓度是可能的。
[0025] 例如，将储备内标（校准物）与待分析样品混合（例如，按体积）（参照图1)。标 准和未知样品的报告物和化学计量可以被表征。使用，例如，光密度计扫描分离的部分。在 电泳图的相应的曲线下的面积与通过内部参照标准提供的信号对比。给定已知的体积比 (即，限定的线性），单点校准，以及因此，使用原位校准物来确定测试样品中组分的浓度的 能力是可能的。
[0026] 在一个简单的例子中，用与测试样品的未知组分相同的报告物将待测量的已知浓 度的分析物（即，校准物），预标记。该标记的校准物和未知物按体积结合并且施加校准物 和未知样品两者并且同时电泳。分析显示未知部分的电泳图以计算相对于内部参考标准 (即，校准物）的未知组分的浓度。因此，在给定已知浓度的内部标记校准物，以及校准物和 样品的限定的体积比的情况下，单点校准的方案（即用单个参考内标校准，这对于本领域 技术人员是已知的）可以用来计算未知分析物的浓度。该方法消除了方法间的浓度变化以 及消除了对外部测试的需要（例如，提供总分析物浓度），并提供增强的样品内的对照和置 信。
[0027] 因此，该方法还可以包括基于校准物的测量水平、测试样品的分离的组分的测量 水平以及测试样品和校准样品的已知比率（例如，体积比），计算最终体积中的测试样品的 组分的浓度。
[0028] 例如，试管中可以包含含有一种或多种感兴趣的生物分子的已知体积的测试样 品。第二试管可以含有具有已知体积和已知浓度的荧光标记校准物，如荧光标记的白蛋白 的校准样品。校准物的初始浓度可以表示为Cei并且校准物的初始体积或量可以表示为Va。 未知物的初始浓度（在本实施例中，感兴趣的一种或多种生物分子）可以表示为Cui以及未 知物的初始体积可以表示为Vm。
[0029] 校准样品和测试样品（包含一种或多种感兴趣的生物分子）的初始体积（或量） 可以组合以产生最终体积Vf，和最终浓度CUf使得：
【权利要求】
1. 一种用于进行具有原位校准的电泳的方法，所述方法包括： 将一定体积的测试样品与一定体积的校准样品结合以形成最终体积，其中，所述体积 的校准样品包括已知浓度的校准物并且所述最终体积包括测试样品和校准样品的已知体 积比； 在电泳凝胶的接收孔中沉积上样部分，其中，所述上样部分是所述最终体积的一部 分； 沿着所述电泳凝胶的共用分离泳道分离所述上样部分使得所述测试样品的组分和校 准物沿着所述共用分离泳道彼此分开； 在所述共用分离泳道内检测所述校准物和测试样品的分离组分；并且 基于所述检测测量所述校准物和所述测试样品的分离组分的水平，从而进行具有原位 校准的电泳。
2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括： 基于所述校准物的测定水平、所述测试样品的分离组分的测定水平、和测试样品与校 准样品的已知体积比，计算所述最终体积中的所述测试样品的组分的浓度。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品的组分和所述校准物各自结合到 能产生或引起可检测信号产生的信号产生分子。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法进一步包括：使所述测试样品的分离组 分和/或校准物与能够与所述信号产生分子相互作用的试剂接触，其中，在与所述试剂接 触后所述信号产生分子产生可检测的信号，并且其中，所述检测包括检测所述可检测的信 号。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述测试样品的组分和所述校准物结合至彼此 可区别的信号产生分子。
6. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述测试样品的组分包含至少两种不同的组分。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，至少两种组分中的每一种结合至不同的可检测 信号，每种所述可检测信号是彼此可区别的。
8. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述可检测的信号是通过辐射测量、比色测量、 发光测量、或荧光测量方法可检测的。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品中的所述一种或多种组分包括脂 蛋白颗粒或它们的部分，并且其中，所述检测包括检测所述脂蛋白颗粒或它们的部分。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述脂蛋白颗粒或它们的部分选自由以下组成 的组：载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白H、脂蛋白（a)、 高密度脂蛋白、中等密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒、脂蛋白X、它们 的氧化变体和混合物。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述沉积是用电泳梳进行。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述校准物是荧光团。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述校准物包括蛋白质。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述校准物包括白蛋白。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述白蛋白偶联至信号产生分子。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述白蛋白偶联至荧光团。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中，在凝胶电泳期间，所述校准物以比所述测试样 品的组分更快的速度在电泳凝胶上迁移。
18. 根据权利要求9所述的方法，其中，在凝胶电泳期间，所述校准物以比脂蛋白颗粒 更快的速度在电泳凝胶上迁移。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品是生物样品。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述检测之前，固定所述校准物和所述分离 组分。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中，通过免疫固定技术固定所述校准物和分离组 分，所述免疫固定技术包括： 使所述校准物和分离组分与包含第一抗体或其片段和第二抗体或其片段的抗血清接 触，使得所述第一抗体或其片段结合所述校准物以及所述第二抗体或其片段结合所述分离 组分；并且 清洗所述电泳凝胶以除去所述凝胶中未结合的物质。
【文档编号】G01N27/447GK104508473SQ201380035181
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】菲利普·瓜达尼奥, 埃琳·萨默斯 申请人:健康诊断实验室有限公司