专利名称：构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型的方法及其血清检测应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及恶性肿瘤检测领域，为一种新的非侵入性的检测方法，利用人血清在体外对肝癌进行早期发现，早期检测，其敏感性和特异性均达到90％以上。
背景技术：
原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约发生26万例，其中42％在中国。根据卫生部的统计资料，近20年来我国每年约有11万人死于该病，在部分城市中占恶性肿瘤死亡率的第二位，部分农村居第一位。由于肝癌起病多隐匿早期症状不明显，一旦出现临床症状多已属中晚期常因此而错失治疗良机。早期发现、早期诊断、早期治疗是提高肝癌治疗效果及长期生存率的有效措施。
早期诊断是在疾病的早期确定其性质、部位的过程。但肝癌早期常常没有明确的症状，病人亦不主动就诊，直至症状出现时常常已非早期。在原发性肝癌的各种治疗方法中，手术切除的疗效已得到公认。小肝癌切除后5年生存率可达50～60％；大肝癌也达到30％。然而，有80％左右的患者在发现时已经处于晚期，从而丧失了手术机会。因此，确定高危人群、寻找灵敏的筛查方法是早期发现、早期诊断、早期治疗从而改善肝癌病人预后的关键。
原发性肝癌患者绝大部分伴有肝硬化，而乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染，食物中含有黄曲霉素，长期嗜酒等目前已被公认是肝癌发生的最危险因素。我国对3631例肝癌患者统计发现，其中有乙型肝炎病史5年以上占87.9％，合并肝硬化者占85.5％，HBsAg阳性者占74.8％，因此在我国，HBsAg阳性者或有慢性肝炎病史者是发生肝癌的主要高危人群。应用灵敏度高，特异度好，经济简便的方法筛选高危人群是提高肝癌患者预后的最佳方式。
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是一种肝癌相关抗原，它的出现带动了肝癌诊断和治疗水平的改善，其临床价值已得到肯定。但是近年来由于存在以下原因，使得AFP诊断肝癌的价值似乎较以往有所下降1)近年来二级预防工作取得了可喜成果，越来越多的早期肝癌不断地被发现，而有大量研究表明PHC患者血清AFP含量一般与肿瘤大小呈正相关[5，6]。所以这些早期肝癌常常因为肿瘤体积小而血清AFP含量不高或增高不明显，造成临床上AFP阴性肝癌病例所占的比重较前增加；2)AFP产量与肝癌细胞分化程度有关。高分化级癌细胞形态和功能与正常肝细胞相近，所以不合成或少合成AFP；低分化级的肝癌细胞由于丧失了合成AFP能力，所以血清AFP常呈阴性，只有中度分化级的肝癌细胞在形态和功能上近似胚肝细胞，因而合成AFP较多[7]。这可能是临床上仍有部分中晚期肝癌患者血清AFP呈阴性的原因；3)随着检测方法灵敏度提高，在部分慢性肝炎和肝硬化等疾病患者血清中也可以检测出一定含量的AFP。尽管在肝炎、肝硬化病例中，AFP达到肝癌诊断标准(＞400μg/L)的不多，有报道仅约3％，但AFP升高(20μg/L)的则可高达30％，使AFP在肝癌与良性肝占位鉴别诊断的价值下降。前两者主要影响AFP诊断肝癌的敏感性，即假阴性增加；而后者则主要影响其特异性，即假阳性增加。由于AFP存在上述缺点，使得其在肝癌的血清学诊断价值受到了一定的限制。显然，寻找出比AFP更敏感，更特异的肝癌特异性指标成为目前迫在眉睫的问题。
20多年来肝癌其他标志物的研究曾十分活跃，都希望能找到一个可靠的标志物弥补AFP的不足。文献报道较多的有γ2谷胺酰转肽酶同工酶II(GGT II)，异常凝血酶原(DCP)，α2L2岩藻糖苷酶，α12抗胰蛋白酶及5′2核苷酸磷酸二酯酶同工酶V等。可惜这些标志物大多特异性不高。目前除GGT II、DCP等尚有应用外，其余已少问津。20世纪80年代发现AFP糖链结构在肝癌与肝炎中有所不同，可藉植物凝集素亲和电泳法加以区别，使用较多的如小扁豆凝集素(LCA)亲和电泳法，即AFP异质体的检测，若LCA结合型AFP＞25％，则可提示为肝癌产生的AFP，对肝癌与肝炎的鉴别诊断有一定的作用。惟此法检测仅适用于AFP浓度较高的患者。AFP单克隆抗体的检测虽可用于AFP低浓度患者，但方法较为复杂而未能广泛应用。
人类基因组学和蛋白质组学的发展，为肿瘤诊断提供了新的思路和手段。蛋白质组学是现代科技前沿，通过对蛋白质动态的分析可以探察出疾病早期最微小的指标和征兆。而实现这种诊断，首先要找出各种疾病的特殊标志分子，其次需要有适合于临床诊断的仪器设备。
目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术，例如双向电泳、质谱。双向电泳是一种癌症早期鉴别肿瘤标记物的新方法。双向凝胶电脉虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术，并在技术上已有了很大的改进，使其重复性和灵敏度大大提高，但这种方法不适于大规模的普查或临床检验，因为它是一种费时、费力，而且在实验室很难标准化的方法，无法将其做大量样品的常规分析。质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而无法实现高通量的蛋白质分析。
美国Ciphergen公司研发的基质辅助激光解析离子化系统(SELDI)集分离纯化和质谱检测于一身，这种技术是利用经过特殊处理的固相支持物或芯片的基质表面，根据蛋白质物理、化学性质的不同，选择性地从待测生物样品中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质表面上，经原位清洗和浓缩后，结合TOF-MS技术，对结合的多肽或蛋白质进行质谱分析。质谱分析的原理是利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解吸形成荷电离子，根据不同质荷比这些离子在仪器中飞行的时间长短不一，由此绘制出一绕质谱图来。该图经计算机软件外理还可形成模拟谱图，宇数据库中的谱图进行对照，我们还能够最终发现和捕获新的疾病异性相关蛋白及其特征。整个测定过程一般可以在几分钟内就全部完成，十分迅速，同时不会破坏所测定的蛋白质。该技术除具有质谱在分辨率和灵敏度方面的特别优势外，它还可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测。其最新型号的仪器已经实现了检测的自动化，每天可以进行近千次的标本检测，从而提供了适合于临床检验的蛋白质组研究工具。
SELDI进行蛋白质测定所使用的是一种新的蛋白质芯片技术，实际上是蛋白质芯片和质谱技术联用的蛋白质谱分析平台，其核心是一系列称为Protein chip的蛋白质芯片。蛋白质芯片是以色谱原理设计的蛋白芯片，该芯片由金属铝制成，其长度为8厘米，宽度为1厘米，上面刻有8个直径2毫米的芯片点，其上覆盖有不同性质的介质。根据芯片表面介质的不同化学成分，可将其分为化学表面芯片和生物表面芯片。其中化学表面芯片又可分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯合芯片五种，用于检测未知蛋白，并获取蛋白质表达图谱；生物表面分为抗体-抗原、受体-配体和DNA-蛋白质芯片等种类，可显示与之相结合的抗原或配体的不同分子量亚型。蛋白质芯片相当于在质谱分析前增加了一步色谱分离。在检测过程中使用不同类型的芯片对同一样品进行检测可以获得完全不同的结果，原因相当于采用了不同的分离方法处理样品。
SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片阵列结合，就可通过电离——解吸飞行时间——质谱仪检测，并根据蛋白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质(保留在芯片上的蛋白质)的图谱。
蛋白芯片在癌症相关蛋白的研究领域内进展最快，国外学者将前列腺癌、卵巢癌患者与非癌对照者的血清或排泄物的样本通过蛋白芯片仪进行了研究，Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康妇女、50例卵巢癌患者，图谱采用534、989、2 111、2 251、2 465质荷比(M/Z)蛋白峰综合分析，灵敏度100％、特异性95％、预测准确率94％，同样的标本用CA125阴性预测值只有35％，且主要反映在年轻人组中，而CA125在良性盆腔疾病中的假阳性率亦很高。Bao-Ling Adam应用SELDI蛋白芯片系统在金属表面芯片上确定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九个蛋白质用于检测前列腺癌，其灵敏度为83％，特异性为97％；而用PSA的灵敏度高于90％，但其特异性仅仅为25％。
目前，在非侵入性肝癌的诊断中常有以下几种方法1.血清学检测甲胎蛋白(AFP)由Bergstrand于1956年在人胎儿血清中首次发现，于1964年在肝细胞癌病人血清中首次测得，现已成为临床诊断肝癌方面最常用的肿瘤标记物。其通常使用的截断值为20ng/ml，其敏感性为65％，特异性为89％。AFP在临床上应用时间较长，检验方法成熟，在高危人群筛查方面有一定的优势，但同时它也存在着一些不足，其一是敏感性较低(70％左右)，容易造成漏诊。其二在一些良性肝病(病毒性肝炎，肝硬化等)、生殖性畸胎瘤、肝母细胞癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、白血病患者中也可有升高，而我国病毒性肝炎、肝硬化患者较多，容易造成误诊。其余肿瘤标志物如a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、铁蛋白(Ferritin)、CA19-9等的检测结果未得到公认。
2.B超检测肝癌早期肝癌的声像图有如下几个方面的特点(1)比较孤立的单个或两个低回声结节，结节反射明显弱于周围肝组织，形成一个类圆形低回声团，边界清晰，但边缘不规则，内部回声不均匀[2]。(2)结节周围常有(62.5％)圆环状低回声晕。(3)肝脏的其它声像图表现常无明显异常。但其对2厘米以下小肝癌无法检测。并且检测结果必须得到AFP检测验证。
由于肝癌癌从细胞发生癌变到形成临床病灶需较长时间，如果能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出肝癌前兆，将大大提高肝癌患者的生存期。由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测肝癌早期生物标志物将把肝癌的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终降低肝癌的发病率和死亡率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型，该模型为早期诊断肝癌提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。该模型能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测肝癌早期生物标志物将把肝癌的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终降低肝癌的发病率和死亡率。
本发明提供的血清蛋白质组指纹图谱模型由人血清蛋白质组质谱图谱及生物信息学-人工神经网络分析方法组成。
本发明提供的肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型，其特征是该蛋白质组指纹图谱由5个质荷比(M/Z)位于4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白质(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。
本发明的第二个目的是提供肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型构建方法，包括①血清准备；②血清标本的质谱检测和数据的收集；③质谱数据的生物信息学-人工神经网络分析。
本发明提供的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，血清准备包括取一定量临床病理确诊的肝癌患者及正常对照人员外周血，室温15℃～25℃析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃冷冻备用；或直接进行检测处理；检测时按一定浓度稀释。
本发明提供的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，血清标本的质谱检测和数据的收集包括用美国赛弗吉公司的弱阳离子蛋白质芯片WCX2；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组指纹图谱；利用表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质谱仪进行质谱数据收集，激光强度为185，检测敏感性为8。
本发明提供的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，质谱数据的生物信息学-人工神经网络分析包括采用反向传播(BP)人工神经网络的方法进行质谱数据的分析。对比分析肝癌患者及健康人员血清蛋白质组指纹图谱，获得肝癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型，采用反向传播(BP)人工神经网络的方法进行质谱数据的分析。采用肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型双盲法进行临床筛选实验，确定该图谱的灵敏度、特异度。
本发明与其他非侵入性肝癌的诊断方法比较，具有以下优点(1)本发明提供的质谱模型，为早期诊断肝癌提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。(2)与以往的传统的非侵入性方法比较具有较高的特异性与敏感性，其敏感性和特异性均达到90％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对肝癌的早期发现，早期诊断提供了新的方法和标准。(3)本发明模型的构建方法设计合理，可行，是为降低我国肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率、进一步筛查肝癌提供了一种新的方法。(4)操作简便，成本低，可重复性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期肝癌患者的检出率，使肝癌患者的生存期进一步延长，甚至治愈。便于对高危人群进行大规模的检测。
图1是利用血清蛋白质组指纹图谱模型测定的病人与正常人在质荷比为8815±20处的蛋白质含量的差别示意图。图中字母C代表肝癌患者血清，N代表正常人血清。经方差分析，肝癌组和正常人组蛋白质含量差异有显著性(P≤0.01)。
图2是利用血清蛋白质组指纹图谱模型测定的病人与正常人在质荷比为4064±20处的蛋白质含量的差别示意图。图中字母B代表肝癌患者血清，A代表正常人血清。经方差分析，肝癌组和正常人组蛋白质含量差异有显著性(P≤0.01)。
图3是为人工神经网络模型构建图。
具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1 本发明的一种检测肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型及构建方法1.血清的预处理血清标本在冰浴中解冻后3000r/min离心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混匀后冰浴30m，以WCX2结合缓冲液稀释成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的预处理用5μl 10mmol/L HCI预处理WCX-2蛋白芯片点10min，用M-Q水洗芯片3次，将芯片安装于Bioprocessor上，芯片每点加150uL结合缓冲液(50mmol/L乙酸钠，pH4.0)，振荡室温下孵育5min，弃掉液体，重复1次。
3.芯片与样品的结合加100μl稀释好的样品于芯片上，振荡孵育。加入结合缓冲液进行洗脱连续两次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗涤2次，待芯片表面自然晾干后，各点加两次0.5μl基质，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机(PBS II型)进行蛋白质谱分析。
4.数据采集和结果分析蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSII型读取数据。仪器每天用All-in-one蛋白质芯片进行分子量校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下激光强度180，检测敏感度8，优化分子质量范围3~10kD，最高分子量20kD，每个样品收集30个点，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析软件自动采集数据，结果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白质组指纹图谱差异。
5.统计学分析与正常人血清相比，对肝癌病人不表达或低表达的标志蛋白分子，其敏感性定义为无或低表达标志分子的病人数与全部肝癌病人数之百分比，特异性定义为有高表达标志分子的正常人数与全部正常人数之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0软件对数据进行统计学处理，不同组之间蛋白峰比较采用r检验，确定两组之间p值小于0.001时具有统计学意义。
6.网络参数的优化对训练集用这多个变量建立一个神经网络。神经网络采用反向传播算法(用共轭梯度学习函数改进Trainscg)。具体设置为共有4层，输入输出层，和两个隐含层，每个隐含层有20个神经元。每一层都采用正切S形传递函数(Tansig)。随机初始化。输出神经元为1个，对应健康人和肝癌患者的期望输出值，分别设为-1和1。首先对训练标本进行人工神经网络训练，得出一个模型，对模型进行检验，并利用此模型对未知血清进行盲法分析。
实施例2 部分实例
1.试剂及芯片乙腈，三氟乙酸，尿素，蛋白酶抑制剂，Hepes，Tris-HCl，CHAPS和OGP均购自Sigma公司。WCX2蛋白质芯片购于美国Ciphergen公司。蛋白标准品Aβ-(1-42)购自Sigma公司。
2.标本来源160例血清标本中，60例肝细胞癌患者的血清标本来自2002年8月～2003年8月广州市各大医院外科系统收治的初治患者；100例健康人的血清标本取自经体检的志愿健康人群，观察半年未见肿瘤发生。60例肝癌经术后病理确诊为肝细胞癌。肝细胞癌中男性85例，女性15例，年龄32～75岁，平均59.6岁。根据中国抗癌协会肝癌专业委员会《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》，Ia16例，Ib22例，Iia36例，Iib16例，IIIa10例。所有患者均于入院后第二天留取标本，全部血清标本均在清晨空腹治疗前抽取，室温放置2小时，3000r/min离心10min，吸取血清，按每管100μl分装，血清储存于-80℃低温冰箱中。所有肿瘤患者在留取标本前未接受过放化疗。
3.蛋白质芯片阅读机蛋白质芯片阅读机(美国Ciphergen公司生产)实际上是一台激光解吸电离飞行时间质谱。它可以检测IkD小分子物质以及多肽，也可检测500kD以下的大分子。它与蛋白质芯片结合在一起构成了蛋白质芯片检测系统。人工神经网络软件采用Matlab的NNTools，预先将数据进行矩阵转换后输入NNTools。
4.蛋白质芯片采用化学修饰的蛋白质芯片WCX2(弱阳离子交换芯片)芯片，其表面结合有弱型阴离子羧基，可以和被分析物表面的正电荷基团相互作用(如赖氨酸、精氛酸和组氛酸)而捕获蛋白，可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。
实验方法1.血清的预处理血清标本在冰浴中解冻后3000r/min离心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混匀后冰浴30m，以WCX2结合缓冲液稀释成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的预处理用5μl 10mmol/L HCI预处理WCX-2蛋白芯片点10min，用M-Q水洗芯片3次，将芯片安装于Bioprocessor上，芯片每点加150uL结合缓冲液(50mmol/L乙酸钠，pH4.0)，振荡室温下孵育5min，弃掉液体，重复1次。
3.芯片与样品的结合加100μl稀释好的样品于芯片上，振荡孵育。加入结合缓冲液进行洗脱连续两次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗涤2次，待芯片表面自然晾干后，各点加两次0.5μl基质，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机(PBS II型)进行蛋白质谱分析。
4.数据采集和结果分析蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSII型读取数据。仪器每天用All-in-one蛋白质芯片进行分子量校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下激光强度185，检测敏感度8，优化分子质量范围3~10kD，最高分子量20kD，每个样品收集30个点，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析软件自动采集数据，结果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白质组指纹图谱差异。
5.统计学分析与正常人血清相比，对肝癌病人不表达或低表达的标志蛋白分子，其敏感性定义为无或低表达标志分子的病人数与全部肝癌病人数之百分比，特异性定义为有高表达标志分子的正常人数与全部正常人数之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0软件对数据进行统计学处理，不同组之间蛋白峰比较采用r检验，确定两组之间p值小于0.001时具有统计学意义。取4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白质作为鉴别肝癌与健康人血清蛋白质的蛋白质组指纹图谱。
6、网络参数的优化对训练集用这5个变量建立一个神经网络，参见图3。神经网络采用反向传播算法(用共轭梯度学习函数改进Trainscg)。具体设置为共有4层，输入层2、输出层3，和两个隐含层3-2、3-2，每个隐含层有20个神经元，有3个连接权重值5、6、7，每一层都采用正切S形传递函数(Tansig)。随机初始化。输出神经元为1个，对应健康人和肝癌患者的期望输出值，分别设为健康人-1和肝癌1。首先对100例标本进行人工神经网络训练，得出一个模型，对模型进行检验，并利用此模型对60例未知血清进行盲法分析。
5、盲法分析方法对60例血清标本(包括肝癌患者与健康人)进行盲法预测，应用相同的技术路线与收集数据的方法，用已确定的聚类模型对60例血清的蛋白质的质谱进行聚类，同样得到5个分子量的峰值，将数据导出后，进行矩阵转换，再导入已建立的人工神经网络模型，输出预测值。
一结果1.血清蛋白质组指纹图谱所有芯片在PBS-II SELDI质谱仪(Ciphergen)进行数据的读取，每个标本均收集30次，共检测到160个不同质荷比(M/Z)的峰值，所有数据均保存在同一个文件中，部分图谱参见图1，在图1中共有24例样本，N代表的12例为健康人的血清蛋白质质谱图，C代表的12例为肝癌患者的。原始数据先用Proteinchip Software 3.0(Ciphergen)做校正(总离子强度及分子量的均一化)。对2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，第二次的噪音过滤值为2，以10％为最小阈值。聚类共产生54个分子量的峰值图谱。
2.人工神经网络模型对100例训练组的血清标本的蛋白质质谱图数据经矩阵转换后，输入MATLAB的NNTools中，进行训练，经过254次后模型达到我们设定的值，检验模型的误差低于1×10-8。将100例血清标本的蛋白质质谱数据用此模型进行检验，输出值为-1和1，-1为健康人，1为肝癌患者，结果所有肝癌患者和健康人都被准确地分类。(见表1)表1 100例血清标本应用人工神经网络模型的输出值
3.盲法分析结果60例未知的血清标本应用已确定的方法进行血清蛋白质质谱的测定，对每例血清蛋白质质谱数据导入已建立的人工神经网络模型中，进行预测，30例肝癌病人中28例，30例健康人中有29例被准确地预测，结果见表2表2 60例未知的血清标本应用人工神经网络模型输出值
计算该方法的敏感性为93％(28/30)，特异性为97％(29/30)。
权利要求
1.一种构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型的方法及其在肝癌患者血清检测中的应用，其特征是该血清蛋白质组指纹图谱模型由人血清蛋白质组质谱图谱及生物信息学-人工神经网络分析方法组成，可以应用于肝癌患者的血清学早期检测和筛查。
2.如权利要求1所述的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型，其特征是该蛋白质组指纹图谱由4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的5个质荷比峰的蛋白质所组成。
3.如权利要求1和2所述的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，其特征是①血清准备；②血清标本的质谱检测和数据的收集；③质谱数据的生物信息学-人工神经网络分析。
4.如权利要求3所述的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，其特征是取一定量临床病理确诊的肝癌患者及正常对照人员外周血，室温15℃～25℃析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃冷冻备用；或直接进行检测处理；检测时按一定浓度稀释。
5.如权利要求3构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，其特征是用美国赛弗吉公司的弱阳离子蛋白质芯片WCX2；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组指纹图谱；利用表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质谱仪进行质谱数据收集，激光强度为185，检测敏感性为8。
6.如权利要求3所述的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，其特征是采用反向传播(BP)人工神经网络的方法进行质谱数据的分析。对比分析肝癌患者及健康人员血清蛋白质组指纹图谱，获得肝癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型，采用反向传播(BP)人工神经网络的方法进行质谱数据的分析。采用肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型双盲法进行临床筛选实验，确定该图谱的灵敏度、特异度。
7.如权利要求1和2所述的构建肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型的方法，其特征是该模型可用于肝癌患者的血清学检测和筛查。
全文摘要
本发明提供一种对肝癌进行检测的非侵入性新方法构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型及并应用于肝癌患者的血清检测。该血清蛋白质组指纹图谱模型由人血清蛋白质组质谱图谱及生物信息学—人工神经网络分析方法组成，可以应用于肝癌患者的血清学早期检测和筛查。该蛋白质组指纹图谱由五个质荷比(M/Z)4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白质所组成。肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型构建方法包括①血清准备；②血清标本的质谱检测和数据的收集；③质谱数据的生物信息学—人工神经网络分析。该模型能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测肝癌早期生物标志物将把肝癌的早期诊断提高到一个新的水平，其对肝癌检测的敏感性和特异度均达到90％以上，从而为最终降低肝癌的发病率和死亡率提供了新的方法与标准。
文档编号G01N30/88GK1654953SQ20051003325
公开日2005年8月17日 申请日期2005年2月24日 优先权日2005年2月24日
发明者郭爱林 申请人:郭爱林