一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法
【专利摘要】本发明属于分析化学领域，涉及一种毛细管电泳涂层，特别涉及一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法。该涂层以聚合物分子刷pOEGMA为功能单体，通过化学键合方法修饰于石英毛细管内壁。应用本发明所述方法制备的pOEGMA涂层毛细管具有优异的抑制蛋白吸附的能力，从而能够有效解决毛细管电泳分离蛋白质过程中的非特异性吸附问题，能够显著提高方法对不同蛋白的分离效率。同时，该涂层物理化学性质稳定，在不影响分离效率的前提下，可以反复使用数百次。
【专利说明】一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，涉及一种毛细管电泳涂层，特别涉及一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质是生物体的主要组成物质及生命活动的基础，是一类含氮的天然高聚物，复杂生物体系中的蛋白分离分析是一项具有挑战性的任务。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳所用的石英毛细管，未经修饰的毛细管内壁表面由于与蛋白会发生静电相互作用，同时由于范德华力和氢键相互作用等的影响，在毛细管内壁产生非特异性吸附，从而对复杂体系中蛋白质的分离分析造成严重影响。特别是对于低丰度蛋白而言，这种非特异性吸附容易导致其无法与高丰度蛋白完全分离，从而造成分析结果的假阴性或假阳性，导致分离效率降低，样品回收率低，基线不稳定，结果的重复性变差，定性定量困难，因此人们一直在探索各种方法来减小毛细管电泳过程中的蛋白吸附现象，提高分离效率。
[0003]POEGMA,是OEGMA单体通过原子转移自由基聚合反应，在毛细管内壁聚合，形成分子刷聚合物，其末端是OEG的羟基基团，抗非特异性吸附能力强，同时具有物理化学性质稳定，易于修饰等优点，在分析化学领域得到了广泛的应用(Adv.Mater.,2009, 21 (23)，2441 - 2446; J.Biomater.Sc1.2009,20: 1579; Soft Matter.2010，6，2115)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，得到的POEGMA涂层具有很好的抗蛋白吸附能力。
[0005]本发明所述的制备方法包括以下步骤:
1)毛细管预处理:首先用Imol/L H2SO4W洗毛细管空柱1_2 h，然后用蒸馏水冲洗过夜，最后用无水乙醇冲洗30 min ；
2)硅烷化处理:预处理后的毛细管用体积比为8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液冲洗3h，使乙氧基与毛细管壁上的S1-OH反应，将活性端基胺基引入毛细管内壁上，之后用无水乙醇冲洗过夜，然后用氮气吹干，在120° C下烘烤2小时，进行老化处理，以使涂层固化；
3)分子刷聚合物pOEGMA涂层的制备:步骤2)制备的毛细管用4_6mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液冲洗lh，之后用二氯甲烷冲洗2h，再用甲醇冲洗过夜，然后用pOEGMA合成溶液冲洗24h，接着在氮气环境下用甲醇冲洗I h，最后用除氧的蒸馏水冲洗I h。
[0006]所述步骤3)中合成pOEGMA合成溶液的制备方法为:在圆底烧瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸馏水，氮吹10 min，称180 mg联吡啶加入上述混合物中，持续搅拌，再加Λ 75mg的溴化亚铜以及4.3ml的OEGMA单体，搅拌均匀，在移入毛细管前再次氮吹15min。
[0007]步骤I)所述毛细管指内径为5-350微米的石英毛细管。
[0008]步骤I)中以8-10 μ 1/h的流速通I mol/L H2SO4冲洗；步骤2)中以8-10 μ I/h的流速通体积比为8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液；步骤3)以10 μ 1/h的流速通4-6 mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液，以10 μ 1/h的流速通pOEGMA合成溶液。
[0009]本发明的显著优点为:
首次将POEGMA引入毛细管电泳，利用其优异的抑制蛋白吸附能力将其修饰的毛细管内壁应用于蛋白分离中。该方法操作简单，成本较低。同时，本方法制备的POEGMA涂层与毛细管内壁间是通过化学键合作用修饰上去的，比目前广泛报导的动态涂层方法具有更好的稳定性，在不影响分离效率的前提下，可以反复使用数百次。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为实施例1毛细管电泳涂层制备过程示意图，图1中A为毛细管固定示意图，B为毛细管电泳涂层制备过程示意图；其中1.氮气进口；2.氮气出口；3.通入合成溶液的毛细管4.环氧基树脂固定装置。
[0011]图2为应用毛细管对6种蛋白标准品进行分离的色谱图，图2中A为本发明所述POEGMA涂层毛细管分离六种蛋白，B为商品涂层毛细管分离六种蛋白，C为无修饰毛细管分离六种蛋白；其中，5细胞色素C，6溶菌酶，7核糖核酸酶A，8猪血红蛋白，9肌血红蛋白，10牛血清白蛋白。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:在毛细管内合成pOEGMA涂层 以下是毛细管内合成POEGMA的具体步骤:
I)准备pOEGMA合成溶液:首先，在圆底烧瓶加入6mL的甲醇以及1.5mL的二次水，氮吹10 min,称180 mg联卩比唳加入混合物中，持续搅拌。再加入75mg的溴化亚铜，以及4.3ml的OEGMA单体，在移入注射器前再次氮吹15min。
[0013]2)毛细管柱首先插入注射器针头，用环氧基树脂固定直到涂层制作完成(如图1中A所示)。
[0014]3)以10 μ 1/h的流速通2小时H2SO40
[0015]4)通二次水冲洗过夜。
[0016]5)通乙醇30分钟。
[0017]6)以10 μ Ι/h流速通10%氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液3小时，使乙氧基与毛细管壁上的S1-OH反应，将活性端基胺基引入毛细管内壁上。
[0018]7)通乙醇过夜。
[0019]8)氮气吹干。
[0020]9)在120° C下烘烤2小时，进行老化处理，以使涂层固化。
[0021]10)以10 μ 1/h的流速通6mL添加了 41 μ L三乙胺和37uL溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液I小时。[0022]11)通二氯甲烷2小时。
[0023]12)通甲醇过夜。
[0024]13)以10 μ 1/h的流速通pOEGMA合成溶液24小时，毛细管的另一端浸没在氮气环境下的甲醇中(如图1中B所示)。
[0025]14)通甲醇I小时。
[0026]15)用除氧的二次水冲洗I小时。
[0027]16)在注射针头端切断毛细管，用保鲜膜包裹好末端储存。
[0028]实施例2
一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，步骤如下:
1)毛细管预处理:首先用1mol/L H2SO4W洗毛细管空柱1_2 h，然后用蒸馏水冲洗过夜，最后用无水乙醇冲洗30 min ； 2)硅烷化处理:预处理后的毛细管用体积比为8%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液冲洗3h，使乙氧基与毛细管壁上的S1-OH反应，将活性端基胺基引入毛细管内壁上，之后用无水乙醇冲洗过夜，然后用氮气吹干，在120° C下烘烤2小时，进行老化处理，以使涂层固化；
3)分子刷聚合物pOEGMA涂层的制备:步骤2)制备的毛细管用4mL含41μ L三乙胺和37 UL溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液冲洗lh，之后用二氯甲烷冲洗2h，再用甲醇冲洗过夜，然后用pOEGMA合成溶液冲洗24h，接着在氮气环境下用甲醇冲洗I h，最后用除氧的蒸馏水冲洗I h。
[0029]合成pOEGMA合成溶液的制备方法为:在圆底烧瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸懼水，氮吹10 min,称180 mg联吡唳加入上述混合物中，持续搅拌,再加入75mg的溴化亚铜以及4.3ml的OEGMA单体，搅拌均匀，在移入毛细管前再次氮吹15min。
[0030]实施例3:三种毛细管分离6种蛋白的对比实验
电泳条件如下:分离毛细管总长度为42cm,有效长度为32cm,内径为75--m;运行缓冲液为30mmol/L, pH=3.5的PBS缓冲液；运行电压:18kV ;进样:压力进样0.5psi，5sec ;紫外检测波长为200nm。
[0031]I)无修饰毛细管分离六种蛋白:细胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，猪血红蛋白，肌血红蛋白，牛血清白蛋白，辣根过氧化物酶的分离谱图如图2中C所示，无法分离。
[0032]2)商品涂层毛细管分离六种蛋白:细胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，猪血红蛋白，肌血红蛋白，牛血清白蛋白，辣根过氧化物酶的分离谱图如图2中B所示，得到了基线分离，分离效果较好。
[0033]3)本发明所述POEGMA涂层毛细管分离六种蛋白:细胞色素C，溶菌酶，核糖核酸酶A，猪血红蛋白，肌血红蛋白，牛血清白蛋白，辣根过氧化物酶。将混合的蛋白用本发明所述的毛细管涂层进行蛋白电泳分离，本实施例1制备的POEGMA涂层的毛细管测试结果如图2中A所示。从图中可以看出，应用本发明制备的涂层毛细管对六种蛋白进行分离，所得到的分离效果最高。
[0034]本发明制备的pOEGMA涂层毛细管具有优异的抑制蛋白吸附的能力，从而能够有效解决毛细管电泳分离蛋白质过程中的非特异性吸附问题，能够显著提高对不同蛋白的分离效率。同时，该涂层物理化学性质稳定，制得的涂层毛细管重复使用300次未见明显变化。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括以下步骤: 1)毛细管预处理:首先用Imol/L H2SO4W洗毛细管空柱1_2 h，然后用蒸馏水冲洗过夜，最后用无水乙醇冲洗30 min ； 2)硅烷化处理:预处理后的毛细管用体积比为8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液冲洗3h，使乙氧基与毛细管壁上的S1-OH反应，将活性端基胺基引入毛细管内壁上，之后用无水乙醇冲洗过夜，然后用氮气吹干，在120° C下烘烤2小时，进行老化处理，以使涂层固化； 3)分子刷聚合物pOEGMA涂层的制备:步骤2)制备的毛细管用4_6mL含41 μ L三乙胺和37 μ L溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液冲洗lh，之后用二氯甲烷冲洗2h，再用甲醇冲洗过夜，然后用POEGMA合成溶液冲洗24h，接着在氮气环境下用甲醇冲洗I h，最后用除氧的蒸馏水冲洗I h。
2.根据权利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，所述步骤3)中合成pOEGMA合成溶液的制备方法为:在圆底烧瓶中加入6mL的甲醇以及1.5mL的蒸馏水，氮吹10 min,称180 mg联卩比唳加入上述混合物中，持续搅拌,再加入75mg的溴化亚铜以及4.3ml的OEGMA单体，搅拌均匀，在移入毛细管前再次氮吹15min。
3.根据权利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，其特征在于:步骤I)所述毛细管指内径为5-350微米的石英毛细管。
4.根据权利要求1所述的抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法，其特征在于:步骤I)中以8-10 μ 1/h的流速通I mol/L H2SO4冲洗；步骤2)中以8-10 μ 1/h的流速通体积比为8%-10%氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液；步骤3)以10 μ 1/h的流速通4-6 mL含41μ L三乙胺和37 μ L溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液，以10 μ Ι/h的流速通pOEGMA合成溶液。
【文档编号】G01N27/447GK103808786SQ201410067416
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】郭隆华, 黄蓉, 邱彬, 林振宇, 陈国南 申请人:福州大学