一种两性离子化羟乙基纤维素改性物及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物功能高分子材料及天然高分子改性材料技术领域，具体设及一种 两性离子化径乙基纤维素改性物及其制备方法与用途。
【背景技术】
[0002] 借助毛细管电泳分离与分析蛋白质分子，是目前生物、医学和食品工程等领域的 重要研究课题。然而，毛细管壁上娃径基对蛋白质的吸附通常会直接降低毛细管电泳分离 蛋白质的效率和重现性。虽然通过改变缓冲液pH值及组分可在一定程度上上降低蛋白质吸 附，但抑值过高或过低、小分子添加剂浓度过大则易导致蛋白质的聚集和变性。相比之下， 采用亲水性聚合物对毛细管内壁表面进行物理或化学改性处理，则能更有效地屏蔽娃径 基，进而减少蛋白质在毛细管壁上的吸附。迄今为止，已使用的亲水性聚合物包括聚丙締酷 胺(PAM)、聚乙締基化咯烧酬(PVP)、聚环氧乙烧(PEO)、聚乙二醇(阳G)、聚N'，N-二甲基丙締 酷胺（PDMA)、聚径乙基丙締酷胺（P皿A)等合成类高分子，W及壳聚糖（畑itosan)、淀粉 (Starch)、径乙基纤维素化EC)、径丙基纤维素化PC)、甲基纤维素 (MC)等天然类高分子或其 衍生物。其中，径乙基纤维素因其原材料来源丰富、产量大、生物安全性高且易生物降解，其 水溶液作为毛细管内壁表面处理剂一直倍受青睐。但不足的是，径乙基纤维素本身为不带 电荷的水溶性中性高分子，用于改性时难W通过物理吸附作用在毛细管内壁表面形成较稳 定的涂层，且所形成的涂层不具有较宽的pH适用范围，因而难W用于对不同种类、不同等电 点蛋白质大分子的高效分离。
【发明内容】
[0003] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种两性离子化 径乙基纤维素改性物的制备方法。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的径乙基纤维素与横酸甜菜 碱两性离子单体接枝共聚物化EC-g-PDMAPS)。该两性离子化径乙基纤维素改性物皿C-g-PDMAI^具有良好的涂覆性能，可通过物理吸附涂覆于烙融石英毛细管内壁。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述两性离子化径乙基纤维素改性物在毛细管电泳 分离蛋白质中的应用。
[0006] 本发明目的通过W下技术方案实现：
[0007] -种两性离子化径乙基纤维素改性物的制备方法，具体包括如下步骤：
[000引将一定量的径乙基纤维素溶于水(可优选为蒸馈水）中，在惰性气体保护下加入硝 酸姉锭、乙二胺四乙酸二钢和3-(2-甲基丙締酷氧乙基二甲胺基）丙横酸盐两性离子单体 (简称:横酸甜菜碱），在25~45°C条件下揽拌反应4~8小时，制得两性离子化径乙基纤维素 改性物。
[0009] 上述径乙基纤维素优选干燥后的径乙基纤维素，惰性气体优选氮气。
[0010] 所述的反应体系中径乙基纤维素的质量分数为1.0%~3.0%;所述的横酸甜菜碱 与径乙基纤维素的质量比为（I :1)~(4:1);所述的反应体系中硝酸姉锭的摩尔浓度为2.5 X 1〇-3~7.5 X l〇-3mol/l;所述的反应体系中乙二胺四乙酸二钢的摩尔浓度为2.5 X 1〇-3~ 7.5Xl〇-3mol/L。
[0011] 上述揽拌反应结束后，还包括用丙酬进行沉淀并过滤分离，再用甲醇萃取除去均 聚物，干燥得粗产物，将粗产物重新溶于蒸馈水中并透析，冷冻干燥后得到径乙基纤维素接 枝横酸甜菜碱单体共聚物，即所述两性离子化径乙基纤维素改性物。
[0012] 所述的干燥粗产物是将粗产物在40~60°C条件下真空干燥至恒重，优选干燥24~ 48小时;所述透析是指用截留分子量为14000截流量透析袋透析48~72小时。
[0013] 本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的两性离子化径乙基纤维素改性 物。
[0014] 本发明还提供了上述两性离子化径乙基纤维素改性物在毛细管电泳分离蛋白质 中的应用，上述两性离子化径乙基纤维素改性物可用于改善毛细管电泳分离蛋白质。
[0015] 本发明所得的两性离子化径乙基纤维素改性物有效地改善了传统的径乙基纤维 素涂层的稳定性，并提高了蛋白质的分离效率。与未改性径乙基纤维素相比，经接枝共聚得 到的两性离子化径乙基纤维素改性物更易附着在毛细管内壁表面形成稳定的涂层，进而减 少蛋白质在毛细管内壁表面的吸附、提高毛细管电泳分离蛋白质的效率;不仅如此，所形成 的改性物涂层还具有较宽的抑适用范围，可对不同种类、不同等电点蛋白质大分子进行更 有效分离。
[0016] 上述两性离子化径乙基纤维素改性物在毛细管电泳分离蛋白质中的应用，包括W 下步骤：
[0017] (1)将未经过修饰的烙融石英毛细管依次用盐酸溶液、蒸馈水、氨氧化钢溶液、蒸 馈水在一定气压下分别冲洗10~20分钟，再用空气干燥10~20分钟;将一定浓度的两性离 子化径乙基纤维素改性物水溶液注入经过预处理的毛细管中并静置，最后用缓冲液冲洗毛 细管，得到径乙基纤维素改性物毛细管涂层；
[0018] (2)将制得的径乙基纤维素改性物毛细管涂层用于电泳分离蛋白质。
[0019]所述的盐酸溶液的摩尔浓度为0.1~Imol/L，氨氧化钢溶液的摩尔浓度为0.1~ Imol/l;冲洗毛细管所用的气压为10~30psi。
[0020] 所述的两性离子化径乙基纤维素改性物水溶液质量浓度为0.1 %~0.5% ;注入和 静置的时间分别为10~20分钟;注入所用的气压为10~30psi。
[0021] 所述的缓冲溶液为憐酸氨二钢-憐酸二氨钢缓冲液、S径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲 液或乙酸-乙酸钢缓冲液中的任意一种;所述的缓冲溶液的pH为3.0~5.0;缓冲液冲洗时间 为5~15分钟，冲洗所用的气压为10~20psi。
[0022] 上述步骤(2)的具体操作步骤如下：
[0023] (A)电渗流的测定：
[0024] 电渗流化Iectroosmotic Flow,EOF)的测定采用P/ACE MDQ 3000毛细管电泳仪 (Beckman Coulter,USA)，检测器为紫外可见检测器，检测波长为214nm。毛细管内外径(ID/ OD)分别为75/375皿，有效长度/总长度化d/Lt)为30/40cm，实验溫度为25°CdW苯甲醇为中 性标记物;缓冲液是憐酸氨二钢-憐酸二氨钢缓冲液，pH值为3.0~8.0，用前经0.45WI1滤膜 过滤。
[0026]
[0025] 采用Williams的方法（Williams BA,et al.Analytical 畑emistry, 1996,68: 1174-1180)进行电渗流的测定。电渗流的数值可由下式计算得出：
[0027]
[002引
[0029]
[0030] 式中，Ld, Lt分别代表毛细管的有效长度和总长度，tNl、tN2、tN3分别是苯甲醇的电泳 迁移图中先后3个峰的迁移时间，Vprog是电泳实验时的电压（1 OkV )，tmigr为电泳时间 (1. Omin)。tramp-up是仪器设定值（0.17min)，tramp-down数值可忽略不计。tinj是进样时间 (3sec)，td是滞后时间，仪器中一般设定为1.0s。
[0031] (B)蛋白质的分离：
[0032] 蛋白质的分离采用P/ACE MDQ 3000毛细管电泳仪(Beckman Coulter,USA)，检测 器为紫外可见检测器，检测波长为214nm。毛细管内外径（ID/OD)分别为75/375皿，有效长 度/总长度化d/Lt)为30/40cm，实验溫度为25°C。缓冲液是憐酸氨二钢-憐酸二氨钢缓冲液， pH值为3.0，用前经0.45皿滤膜过滤。
[0033] 溶菌酶、牛血清白蛋白、核糖核酸酶A分别用蒸馈水配制成Img/mL，并等体积混合， 作为待测样品。将涂层毛细管管先用缓冲液在20psi气压下冲洗5min，加电压20kV于毛细管 两端预电泳5min，然后在0.5pSi的压力下注入混合蛋白质样品，进样时间为5.