本发明涉及一种美拉德产物改性聚己内酯在离子液体中的合成方法，属于聚己内酯改性技术领域。
背景技术：
聚己内酯是一种重要的医用生物可降解材料，它被广泛用作手术缝线、药物缓释材料以及医用支架材料。但是作为医用材料，聚己内酯存在疏水性过强的缺陷，这会导致聚己内酯与细胞培养基不易浸润，细胞在其表面的粘附生长比较困难，久而久之会出现异物反应等生物不相容性反应，引发无菌性炎症。因此，为了提高聚己内酯的细胞相容性，有必要对其进行改性。
已有一些报道，利用几丁质、壳聚糖、羟乙基纤维素以及淀粉等基团在脂肪酶或者其他无机金属催化剂的催化下引入到聚己内酯末端，实现了聚己内酯的功能改性。与普通的多糖类物质相比，蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白质，其细胞相容性更好，因此，若能将蛋白引入聚己内酯组织材料中，对提高其细胞亲和性和生物相容性更有利。但是没有人能够采用脂肪酶催化方法合成蛋白类改性的聚己内酯，这是因为蛋白本身缺乏足够的脂肪酶催化位点，因此采用酶法催化无法直接实现其官能化改性，如果采用金属离子催化，则由于其高温条件限制，蛋白在催化过程中会发生变性，失去改性意义。
美拉德产物是还原糖末端羰基和蛋白质上的氨基在简单加热条件下形成的一种蛋白质-糖共价复合物。由于在蛋白质分子中引入了糖链，所以经过美拉德反应后，蛋白质的性质，如：溶解性、乳化性、起泡性、热稳定性等，都较改性之前有了很大改善。目前针对美拉德反应的研究主要应用于食品领域，这是因为美拉德反应主要发生在食品的加工过程中，美拉德反应对食品香味、色泽、蛋白的溶解/乳化及食品的保鲜均有重要影响。此外，最新研究显示美拉德产物还具有特殊的抗氧化性能以及抗菌性能，因此将美拉德产物用作抗氧化剂以及其他添加剂的研究也逐渐得到重视，最近有研究显示身体内的美拉德反应对人体健康也有重要影响，但是将其应用于聚己内酯改性目前尚未有人研究。
在美拉德产物合成方面，现有方法主要分为湿法和干法，其中湿法只适合于糖和蛋白均溶于水的情况，其反应速度较慢，往往需要几十个小时以上；干法主要采用粉末状物质混合后进行加热，该法反应非常迅速，反应过程剧烈，基本无法有效控制，产物性能较差。最近，有研究者公开了一种壳聚糖-木聚糖美拉德反应产物及其制备方法和应用(CN103304682A)在该发明中，研究者利用了离子液体作为溶剂来进行美拉德反应，但是这种方法仍然是属于湿法的范畴，只能对于溶解于氯代1-丁基-3-甲基咪唑离子液体中的物质有用，而且该离子液体对蛋白类物质的溶解程度有限，所以这种应用是受限的。
在现有的聚己内酯改性方法中，利用生物合成技术将天然高分子与聚己内酯进行酶催化接枝共聚是比较有吸引力的一种绿色改性方法。在此过程中，酶必须在无水环境中进行催化，但是传统的非水相体系多以有毒溶剂为主，对酶活以及稳定性都有负面影响，很大程度上限制了该方法的应用。近年来，随着离子液体这一新型绿色溶剂的发展，该问题有望得到解决。很多研究显示，离子液体是脂肪酶催化合成的理想介质。大部分脂肪酶在离子液体中的稳定性和选择性都有增加，产物的转化率也相当有吸引力。
现有的离子液体中聚己内酯的改性研究主要集中于利用离子液体的强溶解能力对淀粉、纤维素或者壳聚糖等天然产物进行溶解后，得到均相接枝物，然后再利用传统的无机金属离子催化剂做引发剂来实现己内酯的开环聚合，最终实现聚己内酯末端官能化改性。例如：刘继延以1-丁基-3-甲基咪唑溴离子液体作为淀粉和己内酯的共溶剂，在异辛酸亚锡的催化下合成了生物可降解的淀粉/聚己内酯接枝共聚物，但是该产物分子量较低，因此可以溶于水。黄清采用室温离子液体氯代1-丁基-3-甲基咪唑作为魔芋葡甘聚糖的溶剂，以辛酸亚锡作为催化剂成功在魔芋葡甘聚糖表面接枝了聚己内酯长链；Zhaodong Wang在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体中采用异辛酸亚锡催化合成了壳聚糖/聚己内酯接枝共聚物。这些研究在本质上仍然是传统的无机金属催化开环聚合，离子液体在其中仅扮演了溶剂的角色。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提出了在离子液体中直接酶法合成一种胶原蛋白改性聚己内酯的方法，通过在聚己内酯材料中引入细胞识别性较好的胶原蛋白大分子，提高聚己内酯材料的细胞亲和性与功能性。由于胶原蛋白分子中缺乏适于脂肪酶催化的伯羟基位点，无法直接以其作为引发剂对己内酯进行酶法开环聚合。为此，本发明通过美拉德反应将含有伯羟基的小分子还原糖接枝到胶原蛋白上，提升蛋白上的伯羟基数目，得到适于脂肪酶催化的美拉德产物，再以此为引发剂，借助于脂肪酶催化己内酯单体进行开环聚合反应，最终得到美拉德产物改性聚己内酯。该法避免了传统金属催化剂开环聚合时高温对蛋白质的破坏及其金属离子残留问题，而且引入的美拉德产物是一种糖蛋白，其生物相容性更好，该产物有助于提高聚己内酯的生物相容性。本发明方法还具有高效、选择性好、作用条件温和以及环境友好等特点。
本发明的在离子液体中合成美拉德产物改性聚己内酯的方法，所述方法是将含有伯羟基的小分子还原糖的溶液和胶原蛋白缓冲溶液混合，冷冻干燥得到混合物，然后将混合物分散于离子液体中，于60～150℃下反应；反应完毕后，降温至100℃以下，加入己内酯单体和脂肪酶，在脂肪酶的催化下进行开环聚合反应，得到美拉德产物改性聚己内酯。
在本发明的一种实施方式中，所述含有伯羟基的小分子还原糖为葡萄糖、半乳糖、乳糖等中的任意一种或者多种。
在本发明的一种实施方式中，所述糖和胶原蛋白的质量比为1:1～1:3。
在本发明的一种实施方式中，所述分散是将混合物按照质量分数0.1％～5％的比例分散于离子液体中。
在本发明的一种实施方式中，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐或者1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体。
在本发明的一种实施方式中，所述的离子液体与己内酯单体之间的质量比为0.1～10。
在本发明的一种实施方式中，所述60～150℃下反应的时间为5～240分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述降温是降温至60～100℃以下。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B或者猪胰脂肪酶。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶添加量为己内酯单体质量的0.1％～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的酶活为3000U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述开环聚合反应是在温度为60～100℃下振荡反应1～144小时。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法还包括，在开环聚合反应完毕后向反应混合物中加入二氯甲烷，使目标产物完全溶解，过滤，再向滤液中加入适当体积的-20℃～-4℃冷甲醇，于-20℃～-4℃环境中静置一段时间，再过滤，得到粗产物；以丙酮为溶剂抽提上述粗产物，得到美拉德产物改性聚己内酯。
在本发明的一种实施方式中，本发明的方法具体是：
(1)分别配制1％质量分数的乳糖溶液和胶原蛋白磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，按照体积比1:3比例混合均匀，-20℃冷冻干燥48小时后，将该混合物按照质量分数0.1％～5％的比例分散于离子液体中，之后将离子液体温度升至60～150℃，反应5～240分钟；
(2)反应完毕后，将上述离子液体温度降至60℃，分别加入ε-己内酯单体和脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为60～100℃恒温振荡反应器中反应1～144小时；
(3)向上述产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；
(4)以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提24小时，得到美拉德产物改性聚己内酯。
本发明的第二个目的是提供按照上述方法得到的美拉德产物改性聚己内酯。
本发明的第三个目的是提供所述美拉德产物改性聚己内酯的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用作医用材料。
在本发明的一种实施方式中，所述应用具体是用作手术缝线、药物缓释材料或者医用支架材料。
本发明的有益效果：
(1)本发明的美拉德产物改性聚己内酯合成方法，改性过程环保无污染，通过离子液体中的美拉德反应在胶原蛋白上引入含有伯羟基的还原糖小分子，成功实现了利用脂肪酶来催化合成美拉德产物改性聚己内酯，其反应条件温和，无金属离子残留。
(2)本发明中，所选择的两种离子液体既可以作为美拉德反应的分散介质又可以作为脂肪酶的催化反应介质。一方面将离子液体作为加热介质来进行干法反应，采用这样的方法，不仅有利于反应底物的分散及其混合，而且条件相对温和且可控，得到的美拉德产物性能佳；另一方面：该类离子液体对脂肪酶基本无害，一些研究还显示离子液体对脂肪酶催化聚合反应还有促进作用，因此美拉德反应后无需移除离子液体即可进行下一步的开环聚合反应。
(3)产物细胞亲和性更好。采用本发明述及的美拉德产物对聚己内酯改性，可以获得更好的细胞亲和性，胶原蛋白与乳糖的美拉德反应产物，具有两亲性，采用该物质对聚己内酯改性可以提升其细胞亲和性，并赋予其更多功能。
具体实施方案
润湿性测试方法：
采用JC2000D4接触角测量仪进行滴液法测试。将改性聚己内酯采用压片机进行压片，制成厚约2mm的薄片。测试时，将样品平整的固定在仪器平台上。在距离样品10mm处滴下去离子水液滴，60秒后测定水滴与样品间形成的接触角，每个试样测5次，取平均值。
MTT检测即细胞毒性测定(非直接接触)：
样品经过24h紫外消毒杀菌后用DMEM浸泡36h，通过过滤器(孔径大小0.22μm)除去样品得到浸渍培养基，待用。在96孔的细胞培养板中加入100μL的NIH/3T3细胞悬浮液(5*104个/mL)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24h，使细胞完全贴壁后去除培养板中的培养基，加入浸渍培养基继续培养24h，最后加入10μL的MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液至每孔中，放入培养箱中继续孵育4h，通过ELISA酶标仪测定450nm处的吸光度，每个样品测试重复5次。
细胞毒性测定结果表示为：
细胞存活百分比(％)＝A1/A0*100
其中，A1、A0分别为样品和空白的吸光度
接枝效率:
采用称重法进行计算，接枝效率＝[接枝物单体质量/(接枝物单体质量+均聚物质量)]*100％
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
(1)分别配制1％质量分数的乳糖溶液和胶原蛋白磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，按照体积比1:3比例混合均匀，-20℃冷冻干燥48小时后，将该混合物按照质量分数0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体中，之后将离子液体温度升至150℃，反应5分钟；
(2)反应完毕后，将上述离子液体温度降至60℃，分别加入ε-己内酯单体和南极假丝酵母脂肪酶B，通氮气密封后将其置于温度为100℃恒温振荡反应器中反应1小时；
(3)向上述产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；
(4)以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提24小时，得到美拉德产物改性聚己内酯。
经上述方法得到美拉德产物改性聚己内酯，经计算其接枝效率约为70％，对其压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为45°，MTT法检测表明细胞存活率95％以上。
实施例2：
(1)分别配制1％质量分数的乳糖溶液和胶原蛋白磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，按照体积比1:3比例混合均匀，-20℃冷冻干燥48小时后，将该混合物按照质量分数0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体中，之后将离子液体温度升至60℃，反应240分钟；
(2)反应完毕后，将上述离子液体温度降至60℃，分别加入ε-己内酯单体和猪胰脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为60℃恒温振荡反应器中反应144小时；
(3)向上述产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；
(4)以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提24小时，得到美拉德产物改性聚己内酯。
经上述方法得到美拉德产物改性聚己内酯，经计算其接枝效率约为60％，对其压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为50°，MTT法检测表明细胞存活率90％以上。
实施例3：
(1)分别配制1％质量分数的乳糖溶液和胶原蛋白磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，按照体积比1:3比例混合均匀，-20℃冷冻干燥48小时后，将该混合物按照质量分数0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中，之后将离子液体温度升至150℃，反应5分钟；
(2)反应完毕后，将上述离子液体温度降至60℃，分别加入ε-己内酯单体和猪胰脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为100℃恒温振荡反应器中反应1小时；
(3)向上述产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，之后用滤纸过滤掉猪胰脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；
(4)以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提24小时，得到美拉德产物改性聚己内酯。
经上述方法得到美拉德产物改性聚己内酯，经计算其接枝效率约为63％，对其压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为50°，MTT法检测表明细胞存活率90％以上。
实施例4：
(1)分别配制1％质量分数的乳糖溶液和胶原蛋白磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，按照体积比1:3比例混合均匀，-20℃冷冻干燥48小时后，将该混合物按照质量分数0.1％的比例分散于1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中，之后将离子液体温度升至60℃，反应240分钟；
(2)反应完毕后，将上述离子液体温度降至60℃，分别加入ε-己内酯单体和南极假丝酵母脂肪酶B，通氮气密封后将其置于温度为60℃恒温振荡反应器中反应144小时；
(3)向上述产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，之后用滤纸过滤掉南极假丝酵母脂肪酶B，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；
(4)以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提24小时，得到美拉德产物改性聚己内酯。
经上述方法得到美拉德产物改性聚己内酯，经计算其接枝效率约为72％，对其压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为58°，MTT法检测表明细胞存活率85％以上。
对照实施例1：
将实施例1的步骤(1)的离子液体用水溶液替代，反应得到美拉德产物，然后再将产物分散于离子液体中，其他步骤和参数与实施例1一致。结果显示：该法得到美拉德产物颜色较浅，这说明还原糖对胶原蛋白接枝程度较低，采用该产物进一步反应得到的改性聚己内酯，经计算其接枝效率约为58％，对其压片后进行接触角测量，结果显示其润湿接触角为70°，MTT法测定的细胞存活率为75％左右，均不及离子液体中得到美拉德产物改性聚己内酯好。以上这一结果说明在离子液体中美拉德反应比水溶液中要更高效，得到的产物的润湿性和细胞亲和性能也更好。
对照实施例2：
将实施例1的步骤(1)省略，直接将乳糖分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体中，其他步骤和参数与实施例1一致。结果显示：该法得到的乳糖改性聚己内酯，其接枝效率约为47％，压片法测定的润湿接触角为60°，MTT法测定的细胞存活率为70％左右，均不及美拉德产物改性聚己内酯好。以上这一结果说明美拉德产物的润湿性和细胞亲和性能也更好。
对照实施例3：
将实施例1的步骤(1)省略，直接将胶原蛋白分散于1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体中，其他步骤和参数与实施例1一致。结果显示：该法得到胶原蛋白改性聚己内酯产物量较少，经计算其接枝效率约为4％，压片法测定的润湿接触角为74°，MTT法测定的细胞存活率为70％左右，均不及美拉德产物改性聚己内酯好。这说明在胶原蛋白分子上若不引入含有伯羟基的小分子还原糖，脂肪酶无法以胶原蛋白为底物完成对聚己内酯的催化开环聚合反应，大部分己内酯单体被催化成为聚己内酯均聚物。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。