生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺的制作方法

本发明属于生物化工领域，具体地说，涉及生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺。

背景技术：

多元不饱和脂肪酸(PUFAs)是指分子中含有多于一个双键的长链脂肪酸，属于人体必需的脂肪酸，需从食物中摄取。根据PUFA双键位置，将其分为ω-3和ω-6系列，从脂肪酸分子中距离羧基最远的甲基段的碳原子计数，第一个双键出现在第三和第四个碳原子之间的称为ω-3PUFA，如α-亚麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5)等；第一个双键出现在第六和第七个碳原子之间的称为ω-6PUFA，如亚油酸(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)等。

研究发现，很多ω-3PUFAs是具有多种生理活性的功能因子，因此被广泛应用于各领域。然而，大多数ω-3PUFA来源于深海鱼油，但含量比较低，目前ω-3PUFAs的分离方法主要集中在尿素包合法、分子蒸馏、阴离子络合法、超临界萃取、高效液相色谱法、生物酶法等几种方法。其中尿素包合法较为常用，在有机溶剂中尿素可以与直链饱和脂肪酸形成尿素包合复合物在低温下结晶析出，但该过程需要使用大量有机溶剂，增添了后续提纯步骤；分子蒸馏可在低温下汽化待分离物，严格控制温度得到不同温度的馏分，可得到较高的ω-3PUFAs，但该过程能耗大；阴离子络合法中硝酸银阴离子可与ω-3PUFAs络合，产物亲水性强，因此ω-3PUFAs可以以阴离子络合物的形式进入水相，从而实现分离，但硝酸银价格昂贵，故仅限于实验室小量制备；利用超临界CO₂萃取具有ω-3PUFA不发生氧化等优点，但对设备的要求比较高。总之，以上采用物理或者化学的方法富集ω-3PUFA存在选择性差、过程能耗高等问题，迫切需要开发具有高度选择性的环境友好的生物酶法工艺进行ω-3PUFAs的富集。但目前关于酶法工艺富集多元不饱和脂肪酸的工艺繁琐，成本高，选择性差，工业化应用前景不明朗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺。

为了实现本发明目的，本发明提供的生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺，包括以下步骤：

S1、将油脂、短链醇、水和液体脂肪酶在一级或多级酶反应器中进行反应，反应结束后，将所得反应液分成重相和轻相；

S2、将S1中的轻相转移至蒸馏塔内进行蒸馏，分离出碳链长度为C14-C18的脂肪酸酯，用作生物柴油，塔釜液用于进一步转化；

S3、将S2中的塔釜液流入装有固定化脂肪酶的一级或多级酶反应器中，并加入短链醇进行反应，得到碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸酯。

其中，S1具体为：向一级或多级酶反应器中加入油脂、油脂摩尔数4-8倍的短链醇、油脂质量2％-20％的水以及基于油脂质量200-2000个标准酶活单位的液体脂肪酶，于30℃-55℃反应3-8小时，反应结束后，所得反应液经离心或静置分层，得到重相和轻相。

S3具体为：将塔釜液和基于油脂摩尔数1-3倍的短链醇流入装有基于油脂质量200-1000个酶活单位的固定化脂肪酶的一级或多级酶反应器中，于20℃-55℃反应3-10小时。

前述的工艺，在反应全过程或部分反应步骤中采用在线脱水。例如，可用膜进行在线脱水，所用的膜包括有机膜、无机膜或陶瓷膜；可用分子筛进行在线脱水，所用的分子筛为或分子筛；可用低温短链醇进行在线脱水，即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。

前述的工艺，S1还包括回收再利用重相中脂肪酶的步骤。可以用膜分离回收重相中的脂肪酶，所用的膜包括金属膜、有机膜、无机膜或陶瓷膜等。

本发明中使用的脂肪酶包括来源于酵母、霉菌、细菌或其它微生物的脂肪酶；脂肪酶为单种脂肪酶或多种脂肪酶的组合；优选地，所述脂肪酶选自由南极假丝酵母(Candida antarctica)、嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和米根霉(Rhizopus oryzae)所产生的脂肪酶中的至少一种。

本发明中使用的油脂为含有多元不饱和脂肪酸的生物油脂，包括植物油脂、动物油脂、废食用油、酸化油、油脂精练下脚料和微生物油脂，优选鱼油和/或微藻油脂等。所述多元不饱和脂肪酸是指分子中含有多于一个双键的长链脂肪酸，包括但不限于α-亚麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(C22:6)、二十碳五烯酸(C20:5)，花生四烯酸(C20:4)等。

本发明中使用的短链醇包括甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等。所述短链醇为匀速或变速添加，从反应初始计时，3-8小时内流加完毕。

本发明提供的生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺，在液体酶催化的前段反应过程中，无需对油脂原料进行任何的预处理，即可使脂肪酸碳链长度为C14-C18的油脂有效转化为对应的脂肪酸酯(转化率达到90％以上)；进而通过蒸馏将C14-C18脂肪酸酯分离，余下的塔釜液进而用于第二阶段的固定化脂肪酶催化，通过在全过程或部分反应过程中引入在线脱水，可以将C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂有效转化为对应的脂肪酸酯，转化率达到98％以上。本工艺具有油脂原料适用性强，过程环保清洁，产品得率高等优点。

本发明具有以下优点：

在本工艺的第一阶段，将C14-C18的油脂有效转化为对应的脂肪酸酯，产生的副产物甘油在水相(重相)中，油相(轻相)进而通过蒸馏除去C14-C18脂肪酸酯，余下的塔釜液主要为含多元不饱和脂肪酸的油脂，这样过程不仅有效减少了副产物甘油对后续固酶反应的负面影响；同时，经过中间的蒸馏分离，还大大降低了产物(脂肪酸酯)对酶促反应的抑制，从而可以促进含多元不饱和脂肪酸油脂的彻底转化，显著提高了多元不饱和脂肪酸的转化效果。该工艺可以适用于各种各样的油脂，后续产品的分离纯化方便易行，能实现生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸富集酯的高效耦合，具有非常好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明生物柴油制备和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸、基于油脂质量10％的水以及基于单位油脂质量200个标准酶活(200U/g大豆油)的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温35℃，然后将基于油脂摩尔比为4.5：1的乙醇在3个小时内匀速加入。反应6小时后，脂肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)，然后对反应液进行分相，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应，控温20℃，甲醇在1小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(采用包括有机膜、无机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括或分子筛在内的吸水装置)。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例2

将10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)，基于油脂质量5％的水以及入基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的甲醇在4个小时内匀速加入。反应8小时后，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸甲酯(转化率为93％)。然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温20℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为99％。

实施例3

将10g鱼油(含有花生四烯酸，C20:4)基于油脂质量2％的水以及基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液体脂肪酶以及基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温45℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在2个小时内匀速加入。反应5小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为93％)，然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的无机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的乙醇，进行反应。控温20℃，乙醇在1小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸乙酯的转化率为98％。

实施例4

将10g鱼油、基于油脂质量3％的水以及基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶以及基于单位油脂质量300个标准酶活的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温50℃，然后将基于油脂摩尔比为4：1的甲醇在2个小时内匀速加入。反应5小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸甲酯(转化率为92％)。然后对反应液进行静置分相，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的陶瓷膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括陶瓷膜的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98％。

实施例5

将10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂质量8％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在2个小时内匀速加入。反应5小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为93％)。然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为95％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的固定化脂肪酶以及基于单位油脂质量50个标准酶活的来源于南极假丝酵母的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应。控温30℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水，即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸乙酯的转化率为98％。

实施例6

将10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸(DHA，二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂质量20％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温55℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在3个小时内匀速加入。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)，然后对反应液进行离心分离。分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的无机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器器(装有基于单位油脂质量400个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1.5倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例7

将10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂质量6％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温35℃，然后将基于油脂摩尔比为5：1的乙醇在4个小时内匀速加入。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为93％)。然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的陶瓷膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为95％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶以及基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的乙醇，进行反应。控温25℃，乙醇在2小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(采用包括有机膜、无机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括或分子筛在内的吸水装置)。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸乙酯的转化率为99％。

实施例8

将10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂质量3％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后将基于油脂摩尔比为5：1的丙醇在3个小时内匀速加入。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸丙酯(转化率为92％)，然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温35℃，甲醇在1小时内匀速加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例9

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量8％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温45℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在3个小时内匀速加入。反应6小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)，然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应。控温20℃，甲醇在2小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括无机膜的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98％。

实施例10

将10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)、基于油脂质量12％的水以及基于单位油脂质量2000个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温35℃，然后将基于油脂摩尔比为5：1的甲醇在2个小时内匀速加入。反应5小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸甲酯(转化率为92％)，然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的无机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的乙醇，进行反应。控温30℃，乙醇在2小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水，即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸乙酯的转化率为98.5％。

实施例11

将10g鱼油(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量6％的水以及基于单位油脂质量1000个标准酶活的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后将基于油脂摩尔比为5：1的乙醇在3个小时内匀速加入。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)，然后对反应液进行静置或离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的陶瓷膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于单位油脂200个标准酶活的来源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例12

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量12％的水以及基于单位油脂质量600个标准酶活的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温35℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的甲醇在3个小时内匀速加入。反应6小时，有效油脂到生物柴油的转化率为92％，然后将反应液进行静置或离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率为95％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温20℃，甲醇在2小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水，即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。反应4小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98％。

实施例13

将10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂质量8％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温45℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在4个小时内匀速加入。反应6个小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)，然后将反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的乙醇进行反应。控温25℃，乙醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括陶瓷膜的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸乙酯的转化率为98.5％。

实施例14

将10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂质量5％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温35℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇在4个小时内匀速加入。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)。反应结束后，进行静置或离心分离。分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的无机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜或无机膜陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98％。

实施例15

将10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂质量5％的水以及基于单位油脂质量500个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇变速加入。30％的乙醇在反应前2小时匀速加完，剩下的70％的乙醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)。然后将反应液进行静置，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为95％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例16

将10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂质量5％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温45℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的乙醇变速加入。40％的乙醇在反应前2小时匀速加完，剩下的60％的乙醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)。然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的陶瓷膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数1倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括无机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例17

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量5％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温50℃，然后将基于油脂摩尔比为6：1的丙醇变速加入。40％的丙醇在反应前2小时匀速加完，剩下的60％的丙醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸丙酯(转化率为92％)。然后对反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的陶瓷膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数3倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在2小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜或无机膜在内的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例18

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量10％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温40℃，然后加入基于油脂摩尔比为6：1的丁醇变速加入，30％的丁醇在反应前2小时匀速加完，剩下的70％的丁醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸丁酯(转化率为92％)。然后将反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸丁酯(丁酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量200个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数3倍的甲醇，进行反应。控温25℃，甲醇在2小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括分子筛在内的吸水装置)。反应3小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例19

将10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂质量5％的水以及基于单位油脂质量800个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温45℃，然后加入基于油脂摩尔比为3：1的乙醇。乙醇变速加入，40％的乙醇在反应前2小时匀速加完，剩下的60％的乙醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为93％)。然后将反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的无机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。分离出的重相经膜回收脂肪酶，以供重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为96％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量400个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温55℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水，即反应器一侧直接与装有无水短链醇的罐体相连，无水短链醇的温度为20-40℃，反应器的另一侧与真空泵连接，然后真空泵与冷凝器连接，将反应器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器温度为5-15℃。反应3小时，链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为98.5％。

实施例20

将10g鱼油、基于油脂质量20％的水以及基于单位油脂质量300个标准酶活的来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的液体脂肪酶和基于单位油脂质量600个标准酶活的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液体脂肪酶，置于适于酶催化的一级或多级酶反应器中。控温50℃，然后加入基于油脂摩尔比为5：1的乙醇，乙醇变速加入。40％的乙醇在反应前2小时匀速加完，剩下的60％的乙醇在随后2个小时内匀速加完。反应8小时，肪酸碳链长度为C14-C18的油脂转化为对应的脂肪酸乙酯(转化率为92％)。然后将反应液进行离心分离，分离出含酶的重相和轻相(油相)。重相进一步利用膜分离回收酶蛋白，选取截留分子量为15000的有机膜进行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高达95％，回收的酶液中副产物甘油的残存量小于5％，回收的酶可以重复使用。轻相经过蒸馏(170-220℃,10mmHg)，分离出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率为95％)，余下塔釜液进而装入第二阶段的固酶反应器(装有基于单位油脂质量100个标准酶活的来源于南极假丝酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶和装有基于单位油脂质量900个标准酶活的来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同时加入基于油脂摩尔数2倍的甲醇，进行反应。控温40℃，甲醇在1小时内加完。在该反应过程中，进行如图1所示的在线脱水(包括有机膜、无机膜或陶瓷膜在内的膜脱水装置以及包括或分子筛在内的吸水装置)。反应2小时，体系中碳链长度为C19及以上的多元不饱和脂肪酸油脂到对应脂肪酸甲酯的转化率为99％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。