专利名称：一种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及ー种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法。
背景技术：
吸烟引起的危害是当今世界最严重的公共卫生问题之一。如何深入研究烟碱在体内的代谢情况，发展高效、高选择性的分离手段，分离烟碱代谢物(降烟碱、降可替宁、3-羟 基可替宁、N-氧化可替宁、N-氧化烟碱、可替宁糖苷)，对于客观反应烟气感受量是很有必要。目前，烟碱及其代谢产物含量的測定主要采用放射免疫法、气相色谱或气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用技术等方法。放射免疫法需要使用两种放射性同位素125I和3H,方法特异、灵敏且易于操作，但放射免疫法不仅需要烟碱的抗体，还需要烟碱各种代谢物的抗体，而制备抗血清是个技术瓶颈。色谱法技术特异性好且灵敏度高，可以同时測定体液中的烟碱和可替宁等，与放射免疫法相比，色谱法不易受其它因素的影响。由于气质联用仪器只能监控烟碱和可替宁等少数代谢物，且质谱仪的成本昂贵，不利于推广；高效液相色谱法洗脱时间较长，且使用大量对人体有毒有害的有机溶齐U，并易对环境造成污染。因此，创新发展高效、高选择性分离手段和灵敏的检测模式，已成为测定烟碱及其结构相似的代谢物，准确判定人体实际烟气感受量的关键问题。毛细管电色谱(CEC)技术作为新兴分析技术，为提高分离效率和分离选择性提供了极好的契机。在CEC中，烟碱化合物在适当的条件下带有正电荷，带电荷的烟碱物质在CEC中的输运不仅在固定相和流动相间分配，而且受到电渗流驱动作用，在分离综合了 CE和HPLC的分离机制，电泳迁移对整体输运过程的贡献也占有非常重要的地位。毛细管电色谱柱作为ー种柱内原位聚合或填充的固定相，毛细管电色谱整体柱基质表面性质多样化、多孔性能优越，柱容量高，具有分离快速、高效、高容量的特点，是应复杂生物样品高通量分析需要而发展起来的ー种新型色谱微分离手段。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法。本发明的研究机理在于针对碱性烟碱及其代谢物在硅胶基团上的不可逆吸附问题，将功能化的整体柱引入CEC分离模式，在毛细管柱中修饰内盐两性表面活性剤、或引入有机无机杂化多面体倍半硅氧烷、或对常规无机硅胶进行端基动态修饰，抑制极性烟碱的吸附作用，在功能化毛细管硅胶柱的基础上，发展ー种用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱方法。本发明所述的毛细管硅胶功能柱由三甲铵こ内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱、端基封尾的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱或多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟こ酯聚合柱中的ー种组成,通过在毛细管柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，实现电泳分离和毛细管液相色谱分离的双重作用，实现烟碱及其代谢物(包括烟碱、降烟碱、N-氧化烟碱、去甲基可替宁、3-羟基可替宁、可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、N-氧化可替宁)的连续分离。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法，包括毛细管电色谱分离测定中使用的毛细管硅胶功能柱，其中毛细管硅胶功能柱为经过处理的特定毛细管硅胶功能柱，所述特定毛细管硅胶功能柱由三甲铵こ内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱、端基封尾的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱或多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟こ酯共聚聚合柱中的任意一种组成；同时在毛细管硅胶功能柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，在电泳分离和毛细管液相色谱分离的双重作用下实现烟碱及其代谢物 的分离。所述烟碱及其代谢物化合物包括烟碱、降烟碱、N-氧化烟碱、去甲基可替宁、3-羟基可替宁、可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、N-氧化可替宁。本发明将功能化的整体柱引入CEC分离模式，筛选适合于烟碱及其代谢产物分离的分离柱，针对碱性烟碱在硅胶基团上的不可逆吸附问题，在毛细管柱中修饰内盐两性表面活性剤、或引入有机无机杂化多面体倍半硅氧烷、或对常规无机硅胶进行端基动态修饰，抑制极性烟碱的吸附作用，同时，強化整体柱电渗流，加快分离速度。该技术综合应用了电泳和色谱模式分离待测物，快速、高效。本发明的显著优点在于本发明所述的毛细管硅胶功能柱(包括三甲铵こ内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱、端基封尾的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱或多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟こ酯共聚聚合柱)，通过修饰内盐两性表面活性剤、或引入不含硅羟基的有机无机杂化多面体倍半硅氧烷、或通过三こ胺修饰屏蔽常规无机硅胶硅羟基端基，抑制负电荷性的硅羟基基团和正电荷烟碱及其代谢物的静电吸附作用，消除商品化硅胶柱和常规硅胶柱分离碱性物质存在的拖尾和柱吸附问题，加快分离速度。该方法同传统的基于反相色谱作用的电色谱技术比较，大幅度降低了阳离子电荷的烟碱物质在硅胶基质或硅羟基基团上的不可逆作用，而且通过在毛细管柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，大幅度提高了烟碱及其代谢物的色谱洗脱效率和分离柱效，使得该电色谱技术能够实现烟碱及其代谢物(包括烟碱、降烟碱、N-氧化烟碱、去甲基可替宁、3-羟基可替宁、可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、N-氧化可替宁)的连续分离。
具体实施例方式本发明以下结合实施例做进ー步描述，但并不限制本发明。实施例I
应用三甲铵こ内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱，以こ腈三こ胺磷酸盐缓冲液(5. Ommol/L,pH 7. 0)=50:50为流动相,分离电压_20kV,反压阀IOOpsi,在毛细管柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，对烟碱代谢物进行毛细管电色谱分离，洗脱峰依次为N-氧化可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、可替宁、3-羟基可替宁、去甲基可替宁、N-氧化烟碱、降烟碱。实施例2:
应用O. 01%三こ胺进行端基封尾处理的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱，以こ腈磷酸盐缓冲液(7. O mmol/L,pH 3. 5)=80:20为流动相，分离电压_10kV，反压阀IOOOpsi，在毛细管柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，对烟碱代谢物进行毛细管电色谱分离，洗脱峰依次为降烟碱、N-氧化烟碱、去甲基可替宁、3-羟基可替宁、可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、N-氧化可替宁。实施例3:
应用多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟こ酯共聚聚合柱，以こ腈磷酸盐 缓冲液(2. O mmol/L, pH 3.5)=90:10为流动相，分离电压_10kV，反压阀250psi，在毛细管柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压カ，对烟碱代谢物进行毛细管电色谱分离，洗脱峰依次为N-氧化可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、可替宁、3-羟基可替宁、去甲基可替宁、N-氧化烟碱、降烟碱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法，包括毛细管电色谱分离测定中使用的毛细管硅胶功能柱，其特征在于毛细管硅胶功能柱为经过处理的特定毛细管硅胶功能柱，所述特定毛细管硅胶功能柱由三甲铵乙内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱、端基封尾的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱或多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟乙酯共聚聚合柱中的任意一种组成；同时在毛细管硅胶功能柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，在电泳分离和毛细管液相色谱分离的双重作用下实现烟碱及其代谢物的分离。
2.根据权利要求I所述的适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法，其特征在于所述烟碱及其代谢物化合物包括烟碱、降烟碱、N-氧化烟碱、去甲基可替宁、3-羟基可替宁、可替宁、可替宁-葡(萄)糖苷、N-氧化可替宁。
全文摘要
一种适用于烟碱及其代谢物分离的毛细管电色谱测定方法，包括毛细管电色谱分离测定中使用的毛细管硅胶功能柱，其特征在于毛细管硅胶功能柱为经过处理的特定毛细管硅胶功能柱，所述特定毛细管硅胶功能柱，由三甲铵乙内酯修饰的杂化硅胶毛细管柱、端基封尾的十八烷基硅烷键合硅胶毛细管柱或多面体倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羟乙酯共聚聚合柱中的任意一种组成；同时在毛细管硅胶功能柱末端施加负电荷高压和进样端上施加液相泵辅助压力，在电泳分离和毛细管液相色谱分离的双重作用下实现烟碱及其代谢物的连续分离。本发明综合应用了电泳和色谱模式分离待测物，大幅度提高了烟碱及其代谢物的色谱洗脱效率和分离柱效。
文档编号G01N30/60GK102967675SQ20121054835
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者刘绍锋, 刘惠民, 谢复炜, 张晓兵 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院