专利名称：一种细胞荧光标记方法
一种细胞荧光标记方法
技术领域：
本发明涉及生物荧光标记领域，具体涉及一种利用点击化学对细胞进行荧光标记的方法。
背景技术：
探索和发现生物体内及生命过程中蛋白质、核酸、多肽等重要生物分子的高灵敏分析检测方法，是生物医学领域研究的热点和难点。生物标记技术是该领域不可或缺的研究手段。通用的生物标记方法可以分为放射性标记、显色标记、酶标记和荧光标记等。其中，荧光标记备受科研人员关注，而其检测灵敏度很大程度上取决于荧光标记探针的发光强度和光化学稳定性。荧光半导体纳米材料量子点具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、发光效率高、光化学稳定性好、不易发生光漂白、发射光颜色与粒径大小关联等优点，作为一种新型突光标记物被广泛应用于蛋白质及DNA检测、细胞标记成像、活细胞生命动态过程示踪、活体动物体内肿瘤细胞祀向示踪等生物医学领域。现有技术已存在使用荧光量子点标记DNA的方法，稳定荧光标记肝癌细胞的方法，由纳米或胶体微粒与亲和素、链霉亲和素或抗生物素构成的纳米探针，以及通过在病毒宿主细胞的培养基中添加生物素磷脂，而发展的囊膜病毒的生物素标记方法。然而，现有的生物标记技术主要基于生物素与亲和素之间的非共价相互作用，虽然具有简便、快捷的优点，但是标记产物不稳定。另一种采用基于羧基与氨基的缩合反应的标记方法往往需要添加催化剂，并且由于生物体本身存在大量氨基与羧基，因此反应效率不高，特异性也不好。点击化学(click c hemistry)是2001年由诺贝尔化学奖获得者K.BarrySharpless首次提出的一个模块化合成概念。它是一种选用易得原料，通过模块化的、可靠、高效率、高选择性的化学转变来实现碳杂原子连接，以低成本快速合成各类新化合物的组合化学新方法。目前点击化学应用最为广泛的是铜离子催化的端基炔和叠氮化物Huisgen偶极环加成反应。而新型的基于环炔基-叠氮连接的不含铜的新型点击化学方法更为其生物医学应用奠定了良好基础。将点击化学与荧光纳米量子点结合起来可以构建一种稳定的纳米标记探针。
发明内容本发明要解决的技术问题在于现有生物标记产物不稳定、效率低、特异性差的缺点，提供一种基于点击化学的生物标记方法。具体地，本发明提供一种细胞荧光标记方法，包括以下步骤:A.使细胞与点击化学修饰连接剂结合:在含有细胞的培养液中，添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，室温反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍；B.使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记:将叠氮-荧光量子点复合物加入步骤A得到的培养液中，室温孵育，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-突光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。一些实施方案中，步骤A中的反应可以进行30-60分钟。一些实施方案中，步骤B中也可以孵育30-60分钟。一些实施方案中，步骤A还可以包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，及/或离心收集细胞的操作。一些实施方案中，步骤B还可以包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的叠氮-突光量子点复合物，及/或离心收集突光量子点标记的细胞的操作。一些实施方案中，所述缓冲液可以为PBS缓冲液或者HEPES缓冲液。一些实施方案中，所述点击化学修饰试剂可以为下式的化合物:
[0018
权利要求
1.一种细胞荧光标记方法，包括以下步骤: A.使细胞与点击化学修饰连接剂结合:在含有细胞的培养液中，添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，室温反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍； B.使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记:将叠氮-荧光量子点复合物加入步骤A得到的培养液中，室温孵育，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。
2.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤A中反应30-60分钟。
3.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤B中孵育30-60分钟。
4.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤A还包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，及/或离心收集细胞的操作。
5.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤B还包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的叠氮-荧光量子点复合物，及/或离心收集荧光量子点标记的细胞的操作。
6.根据权利要求4或5所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液或者HEPES缓冲液。
7.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述点击化学修饰试剂为下式的化合物:
8.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述叠氮-荧光量子点复合物中的量子点选自 CdSe, CdTe, CdS, ZnS, CuInSe, CuInS, InP、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe，或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述叠氮-荧光量子点复合物采用下式的叠氮修饰剂对量子点进行修饰:
10.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述培养液为DMEM培养液 。
全文摘要
本发明公开了一种细胞荧光标记方法，将点击化学与荧光量子点技术相结合，通过点击化学修饰连接剂，使用纳米量子点对细胞进行荧光标记。该方法由于使用点击化学，使量子点与生物体共价连接，快速简便，且标记产物稳定，特异性好。
文档编号G01N21/64GK103076312SQ20121054797
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者蔡林涛, 张鹏飞, 刘淑慧, 高笃阳, 盛宗海, 胡德红, 龚萍 申请人:深圳先进技术研究院