通过使用抗骨硬化蛋白抗体治疗牙槽骨流失的方法

通过使用抗骨硬化蛋白抗体治疗牙槽骨流失的方法
【专利摘要】本发明提供一种治疗牙槽骨流失的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用骨硬化蛋白抑制剂。
【专利说明】通过使用抗骨硬化蛋白抗体治疗牙槽骨流失的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年12月28曰提交的美国临时申请第61/580，964号的优先权益。所述优先权申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
[0003]发明【技术领域】
[0004]本发明总体上涉 及使用骨硬化蛋白抑制剂治疗牙槽骨流失的方法。
[0005]以电子方式提交的材料的引入并入
[0006]以全文引用的方式并入的是与此同时提交且鉴别如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表:ASCII (文本)文件名称“46570_SeqListing.txt”，805, 989个字节，2012年12月7曰创建。
[0007]以引用方式并入
[0008]以下申请特此以全文引用的方式并入:2006年4月25曰提交的美国专利申请第11/410, 540号，其要求2006年4月17曰提交的美国临时专利申请第60/792，645号、2006年3月13日提交的美国临时专利申请第60/782，244号、2006年2月24日提交的美国临时专利申请第60/776,847号以及2005年5月3日提交的美国临时专利申请第60/677,583号的优先权；以及2006年4月25日提交的美国专利申请第11/411，003号(以美国专利第7，592，429号颁布)，其要求2006年4月17日提交的美国临时专利申请第60/792,645号、2006年3月13日提交的美国临时专利申请第60/782,244号、2006年2月24日提交的美国临时专利申请第60/776,847号以及2005年5月3日提交的美国临时专利申请第60/677，583号的优先权。以下申请特此也以引用的方式并入:2008年9月17日提交的美国专利申请第12/212,327号，其要求2007年9月17日提交的美国临时专利申请第60/973，024号的优先权；以及2010年6月29日提交的美国专利申请第12/811，171号，其根据美国法典第35篇371条为2008年12月15日提交的国际专利申请第PCT/US08/86864号的美国国家阶段申请，其要求2007年12月14日提交的美国临时专利申请第61/013，917号的优先权。
[0009]发明背景
[0010]已知牙周感染和牙龈发炎为牙周疾病的主要原因。两者皆为慢性发炎性疾病，且随着其进展，牙周组织损坏且牙槽骨因在一些状况下引起牙齿支撑物损失的骨吸收而减少。另外，牙槽骨可能因由外科治疗引起的穿孔或所进展的龋齿的顶端病变而变得缺损。
[0011]发明概述
[0012]本发明是针对使用骨硬化蛋白抑制剂来增强牙槽骨的方法。在一方面，本文描述一种治疗受试者牙槽骨流失的方法，所述方法包括施用有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离的量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)，剂量任选地为每周约5mg至约l，000mg。在一个实施方案中,在整个治疗期内，每周两次施用骨硬化蛋白抑制剂。在另一实施方案中，在整个治疗期内，每周一次施用骨硬化蛋白抑制剂。
[0013]治疗期可为至少约I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、25周、26周、27周、28周、7个月、29周、30周、31周或更长(例如8个月、9个月、10个月、11个月、I年、15个月、18个月或更长)。在一些实施方案中，治疗期为约6-12周。在一些实施方案中，治疗期为4-12周或约1-3个月。在一些实施方案中，治疗期为约12-20周或约3-5个月。在一些实施方案中，治疗期为约20-32周或约5_8个月。在一些实施方案中，治疗期为约24-36周或约6-9个月。在一些实施方案中，治疗期至多为约28周。在一些实施方案中，治疗期为约I年。在一些或任何实施方案中，治疗期至多为约18个月。
[0014]在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前距离相比，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离减小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少7 0%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离减小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离恢复至疾病前状态。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离小于或等于约2mm(例如约2mm、约1.9mm、约1.8mm、约
1.7mm、约 1.6mm、约 1.5mm、约 1.4mm、约 1.3mm、约 1.2mm、约 1.1mm 或约 1mm)。
[0015]在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨高度相比，牙槽骨高度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙槽骨高度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨高度恢复至牙槽骨高度的疾病前状态。
[0016]在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨高度相比或与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙槽骨高度增加了至少0.1mm(例如至少约0.1_、约0.2mm>约0.3mm>约0.4mm、约0.5mm>约0.6mm>约
0.7_、约 0.8_、约 0.9_、约 1_、约 1.5_、约 2_、约 2.5_、约 3_、约 3.5_、约 4mm、约
4.5_、约 5_、约 5.5_、约 6_、约 6.5_、约 7_、约 7.5_、约 8_、约 8.5_、约 9_、约 9.5或约1mm)或更多。
[0017]在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨密度相比或与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙槽骨密度增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨密度恢复至疾病前状态。
[0018]在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨体积分数(BVF)相比或与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙槽BVF增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。[0019]在一些或任何实施方案中，本文所述的方法可以进一步包括在施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)之前测量牙槽骨的骨骼矿物密度以鉴别需要用骨硬化蛋白抑制剂治疗的受试者。牙槽骨密度测量值小于约750亨斯菲尔德单位(Hounsfield Unit)(例如为约 750HU、约 700HU、约 650HU、约 600HU、约 550HU、约 500HU、约450HU、约400HU或更小)的受试者被鉴别为需要用抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段治疗的受试者。
[0020]本文所述的方法治疗的牙槽骨流失包括但不限于与以下状况相关的牙槽骨流失:牙周炎(例如晚期牙周病)、牙齿损失、拔牙、戴假牙、口腔外科、骨髓炎、放射性骨坏死、发育畸形(例如出生时缺陷，如牙齿、面颅骨或颌的缺失部分)、窦不足、未对准、或外伤(例如牙齿撕脱或颌骨折)。在一些实施方案中，欲治疗的受试者患有晚期牙周炎。
[0021]在一些实施方案中，牙槽骨流失因去除含有肿瘤(例如良性肿瘤)的骨骼部分而产生。示例性良性骨肿瘤包括但不限于骨瘤、骨样骨瘤、骨母细胞瘤、骨软骨瘤、内生软骨瘤、软骨粘液样纤维瘤、动 脉瘤样骨囊肿、单房性骨囊肿、骨纤维性发育异常及骨骼巨细胞瘤。
[0022]在一些或任何实施方案中，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)，并且组合使用支持骨骼的再生长的材料，所述材料如骨移植物、骨粉、骨碎片、去矿化骨基质、骨骼支架、修复体、金属稳定剂或骨骼支架物质，包括一或多种聚合物、陶瓷、牙骨质及基于磷酸钙的骨骼移植物取代物。本领域中已知所述材料的许多变化形式。
[0023]在一些或任何实施方案中，所述方法包括在施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)之前向受试者施用用于治疗牙周病的标准护理疗法。例如，在一些实施方案中，用于治疗牙周病的标准护理疗法为治疗剂，包括但不限于Per1stat?和/或化学改性的四环素-3 (CMT-3)。在一些实施方案中，标准护理疗法包括口冲洗法和/或刮牙术以及受试者感染区域的牙龈上和/或牙龈下清创术(例如去除微生物牙菌斑和牙垢)。在一些实施方案中，标准护理包括在施用骨硬化蛋白抑制剂之前进行口冲洗法和/或刮牙术以及感染区域清创术与Per1stat和/或CMT-3的组合。在一些实施方案中，所述方法包括与施用骨硬化蛋白抑制剂并行施用标准护理疗法。在其它实施方案中，标准护理疗法相继施用。例如，标准护理疗法可在向受试者施用骨硬化蛋白抑制剂之前I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周或更长时间来施用。在优选实施方案中，在施用骨硬化蛋白抑制剂之前，受试者的牙周病进展减缓、停止或逆转。
[0024]在一些或任何实施方案中，所述方法进一步包含施用抗生素，如选自由以下组成的组的抗生素:阿莫西林(amoxicillin)、盐酸四环素、多西环素(doxycycline)、米诺霉素、阿奇霉素(azithromycin)、罗红霉素、莫西沙星(moxif1xacin)、环丙沙星以及甲硝咕唑。在一些实施方案中，所述方法包括在向受试者施用骨硬化蛋白抑制剂之前或施用之后向受试者施用抗生素。在其它实施方案中，所述方法包括与施用骨硬化蛋白抑制剂并行向受试者施用抗生素。
[0025]在一些或任何实施方案中，所述方法进一步包括施用第二骨骼增强治疗剂以治疗骨骼矿物密度减小或骨折。本领域中已知许多此类型的治疗剂。在一些实施方案中，骨骼增强治疗剂选自由以下各物组成的组:抗再吸收药物、成骨剂、雌激素受体调节剂(包括但不限于雷诺昔芬(raloxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)以及拉索昔芬(Iasofoxifene))以及对破骨细胞具有抑制作用的药物。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂选自由以下组成的组:双膦酸盐(包括但不限于阿仑膦酸钠(alendronate sodium ； FOSAMAX?.)、利塞勝酸盐(risedronate)、伊班勝酸钠(ibandronate sodium ； BONIVA? )以及
唑来膦酸(zoledronic acid ； RECLAST? ))、雌激素或雌激素类似物、钙来源、替勃龙
(Tibolone)、降钙素、骨化三醇以及激素替代疗法。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂包括但不限于副甲状腺素(PTH)或其肽片段、PTH相关蛋白质(PTHrp)、骨骼形态发生蛋白、成骨素、NaF, PGE2激动剂、士他汀(statin)、抗DKKl抗体或抑制剂、抗RANK配体(RANKL)抗体(例如PR0LIA? )或RANKL抑制剂、雷奈酸银(strontium ranelate)、维生素D、或维生素D衍生物或其模拟物。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂为Forteo⑩(特立帕肽(Teriparatide)或重组人副甲状腺素类似物(1-34))或Preotact? (副甲状腺素)。在一些或任何实施方案中，骨骼增强剂为Protelos?。 [0026]在一些实施方案中，与骨硬化蛋白抑制剂(例如，持续治疗期内一段时间)并行施用第二骨骼增强剂。在其它实施方案中，一旦骨硬化蛋白抑制剂治疗期结束，就施用第二骨骼增强剂持续一段时间(即，持续一段维持期)。在此类实施方案中，施用第二骨骼增强剂持续约I周至约5年的一段维持期。
[0027]所述方法可以进一步包括随后施用一或多个有效维持骨骼矿物密度的量的骨硬化蛋白抑制剂，维持期任选地为在治疗期结束后至少约12周、6个月、I年、2年、3年、4年、5年或更长时间(例如受试者一生)。
[0028]牙周病治疗计划还可包括积极治疗完成后的支持性跟踪疗法。支持性跟踪疗法包括但不限于机械清创术、口腔卫生增强(例如定期专业清洁、日常刷洗及清牙垢)以及施用抗生素。
[0029]在任何本文公开的实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂任选地为骨硬化蛋白结合剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。尤其涵盖美国专利公布号2007/0110747中所公开的骨硬化蛋白结合剂在本文公开的任何方法中的使用或用于制备根据本文公开的任何方法施用的药剂的用途。一个或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂以可有效治疗牙槽骨流失的一定量和一段时间来施用。在不同实施方案中，每周向受试者(例如人受试者)施用包含约50毫克至约1，000毫克骨硬化蛋白抑制剂的一个或多个剂量。例如，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的剂量可包含至少约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约 80mg、约 90mg、约 lOOmg、约 120mg、约 150mg、约 200mg、约 240mg、约 250mg、约 280mg、约 300mg、约 350mg、约 400mg、约 420mg、约 450mg、约 500mg、约 550mg、约 600mg、约 650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg或高达约1，OOOmg的骨硬化蛋白抑制剂。还涵盖任何和所有这些终点之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约 75mg 至约 lOOmg、约 10mg 至约 150mg、约 140mg 至约 210mg、或约 150mg 至约 200mg、或约280至约410mg。剂量以任何间隔施用，如一周多次(例如每周两次或三次)、每周一次、每两周一次、每三周一次，或每四周一次。在一些或任何实施方案中，每周两次施用约120mg至约210mg范围内的剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。在一些或任何实施方案中，每周两次施用约140mg的剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。
[0030]在一些实施方案中，所述一或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂可以包含每公斤体重约0.1与约50毫克之间(例如约5与约50毫克之间)、或约I至约100毫克(mg/kg)的骨硬化蛋白抑制剂。例如，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的剂量可以包含至少约 0.lmg/kg、0.5mg/kg、lmg/kg、约 2mg/kg、约 3mg/kg、约 4mg/kg、约 5mg/kg、约 6mg/kg、约 7mg/kg、约 8mg/kg、约 9mg/kg、约 10mg/kg、约 20mg/kg、约 25mg/kg、约 26mg/kg、约 27mg/kg、约 28mg/kg、约 29mg/kg、约 30mg/kg、约 3lmg/kg、约 32mg/kg、约 33mg/kg、约34mg/kg、约 35mg/kg、约 36mg/kg、约 37mg/kg、约 38mg/kg、约 39mg/kg、约 40mg/kg、约 41mg/kg、约 42mg/kg、约 43mg/kg、约 44mg/kg、约 45mg/kg、约 46mg/kg、约 47mg/kg、约 48mg/kg、或约 49mg/kg、或约 50mg/kg、约 55mg/kg、约 60mg/kg、约 65mg/kg、约 70mg/kg、约 75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、或高达约100mg/kg。还涵盖任何和所有这些终点之间的范围，例如约lmg/kg至约3mg/kg、约lmg/kg至约5mg/kg、约lmg/kg至约1mg/kg、约 lmg/kg 至约 20mg/kg、约 lmg/kg 至约 40mg/kg、约 5mg/kg 至约 30mg/kg、或约 5mg/kg至约 20mg/kg。
[0031]本文还描述有效量的抗骨硬化蛋白抑制剂用于治疗受试者牙槽骨流失的用途，所述抗骨硬化蛋白抑制剂是例如按上述任何量，如每周约50mg至约1，OOOmg，其中在一段治疗期内进行骨硬化蛋白结合剂的一次或多次施用，所述治疗期持续至少I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、25周、26周、27周、28周、7个月、29周、30周、31周或更长时间(例如8个月、9个月、10个月、11个月、I年、15个月、18个月或更长时间)。
[0032]在一些或任何实施方案中，皮下施用骨硬化蛋白抑制剂。在其它实施方案中，对受试者颌局部施用骨硬化蛋白抑制剂。在一些或任何实施方案中，对受试者的患病牙龈区域局部施用骨硬化蛋白抑制剂。在一些或任何实施方案中，对受试者牙周袋施用骨硬化蛋白抑制剂。
[0033]骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)还可用于制备使用本文所述的任何给药和/或时机方案施用给牙槽骨流失受试者的药剂。因此，本发明还涵盖根据本文所述的任何给药和/或时机方案使用的骨硬化蛋白抑制剂。任选地，骨硬化蛋白抑制剂存在于容器中，如单次剂量或多次剂量小瓶或注射器。本发明包括一种包含抗骨硬化蛋白抗体或其片段以及根据本文所述的任何给药和/或时机方案施用抗体或其片段以治疗牙槽骨流失的说明书的容器。
[0034]在不同实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂为骨硬化蛋白结合剂，例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段。任选地，所述抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段交叉封闭以下抗体中至少一者与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B、Ab-C,Ab-D、Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab_24，和/或被以下抗体中至少一者交叉封闭与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab_l、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab_5、Ab_6、Ab_7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab-24。[0035]在一些实施方案中，所述抗骨硬化蛋白抗体包含SEQ ID NO:245的⑶R-Hl、SEQID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的 CDR-LU SEQ ID NO:79 的CDR-L2、以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
[0036]在一个实施方案中，所述抗骨硬化蛋白抗体包含含SEQ ID NO:378的重链以及含SEQ ID NO:376的轻链。在另一实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体具有SEQ ID NO: 145或SEQ IDNO:392的重链以及SEQ ID NO: 141的轻链。
[0037]在另一实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体包含国际专利公布号WO 2008/115732的SEQ ID NO:20-25 的 CDR(SEQ ID N0:416_421)、国际专利公布号 TO 2008/115732 的 SEQ IDNO:26-31 的 CDR(SEQ ID N0:422_427)、国际专利公布号 WO 2008/115732 的 SEQ ID NO:32-37的 CDR(SEQ ID NO:428-433)或国际专利公布号 WO 2009/047356 的 SEQ ID NO:4、15、26、37、48以及59的CDR(分别 为SEQ ID NO:443、454、465、476、487以及498)。在另一实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体包含国际专利公布号WO 2010/130830的SEQ ID NO: 135-143、153-161或171-179中的至少一者的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:745-753、763_771、781_789)。
[0038]还涵盖包含本文所述的抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)的牙齿植入物、基质、凝胶剂以及伤口敷料。在一些实施方案中，牙齿植入物、基质、凝胶剂以及伤口敷料用抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)涂布。在其它实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)与本文所述的载体一起配制且施加至目标区域(即受试者的患病牙龈区域或患病牙周袋)，任选地在施加牙齿植入物、基质或伤口敷料之前(或之后)。抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)可通过本领域已知的任何方式施加。在一些实施方案中，在施加牙齿植入物、基质或伤口敷料之前，通过皮下注射向目标区域施用骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)。在其它实施方案中，在施加牙齿植入物、基质或伤口敷料之前，通过刷涂或以其它方式涂布受感染区域向受感染区域施用骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)。
[0039]另外，尤其涵盖抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)在本文公开的任何方法中的用途或用于制备根据本文公开的任何方法施用的药剂的用途。在此方面，本发明包括一种用于在治疗受试者牙槽骨流失的方法中使用的抗骨硬化蛋白抗体，所述方法包括施用有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离的量的抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)，剂量任选地为每周约5mg至约1，OOOmg0
[0040]本发明还包括抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)的用途，其用于制备供治疗受试者牙槽骨流失用的药剂，其量有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离，其中所述抗骨硬化蛋白抗体(或抗体片段)的剂量任选地为每周约5mg至约1，OOOmgo
[0041]上述概述不意欲限定本发明的每个方面，并且在其它部分(如详述)中描述了其它方面。整个文件意欲作为统一的公开内容联系起来，且应理解涵盖本文所述的特征的所有组合，即使特征的组合未能在此文件的同一句子或段落或部分中找到。就本发明的用“一(a或an) ”描述或要求的方面来说，应理解除非上下文明显地需要更具限制性的含义，否则这些术语意指“一个或多个”。除非上下文明显地需要其它意思，否则术语“或”应理解涵盖替代性项目或联合项目。如果本发明的方面描述为“包含”特征，则还涵盖实施方案“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”。
[0042]附图简述
[0043]图1为列出本文所述的不同抗骨硬化蛋白抗体的氨基酸序列和氨基酸序列的序列标识符的图表。序列标识符指同时提交的序列表中所提供的氨基酸序列。氨基酸序列还阐述于美国专利公布号2007/0110747或国际专利公布号WO 2008/115732,WO 2009/047356或TO 2010/130830中，所述公布特此以引用的方式并入。
[0044]图2A和2B为描绘实验牙周炎期间全身性施用抗骨硬化蛋白抗体对骨骼体积分数(图2A)和骨骼矿物密度(图2B)的作用(2周及4周研究终点时进行测量)的曲线。
[0045]图3A和3B为描绘实验牙周炎诱发之后全身性施用抗骨硬化蛋白抗体对骨骼体积分数(图3A)和骨骼矿物密度(图3B)的作用(4周、7周以及10周研究终点时进行测量)的曲线。
[0046]图4A和4C为描绘实验牙周炎诱发后施用抗骨硬化蛋白抗体对牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离的作用(图4A)以及7周(图4B)和10周(图4C)时上颌第二磨牙的位点特异性测量的曲线。
[0047]发明详述
[0048]本发明至少部分地基于如下发现:骨硬化蛋白抑制剂可治疗与例如牙周病相关的牙槽骨流失。在此方面，本发明提供一种治疗牙槽骨流失的方法。所述方法包括在治疗期期间以有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离的量向受试者(例如哺乳动物，如人)施用一个或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂，如骨硬化蛋白结合剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。本发明的材料和方法优于现有疗法，所述现有疗法的治疗功效依赖于侵袭性手术方法(例如骨移植物)来将受试者牙槽骨恢复至疾病前状况(例如高度和/或密度和/或三维骨骼质量)。
[0049]通过本文所述的方法治疗的牙槽骨流失包括但不限于与以下状况相关的牙槽骨流失:牙周炎、牙齿损失、拔牙、戴假牙、口腔外科、骨髓炎、放射性骨坏死、发育畸形(例如出生时缺陷，如牙齿、面颅骨或颌的缺失部分)、窦不足、未对准、或外伤(例如牙齿撕脱或颌骨折)。在一些实施方案中，欲治疗的受试者患有晚期牙周炎。
[0050]如本文所用的术语“牙周病”意欲涵盖一系列临床病状。牙周病的临床诊断基于视觉和放射照相评价牙周组织并且基于牙齿与牙龈之间的间隙的测量。在人中，这些间隙的深度通常为1_3_，并且在支撑结缔组织与骨骼损失时加深。在综合临床检查期间，在每个牙齿周围的不同位置(例如4-6个位置)处测量袋深度和组织支撑物，并且记录牙菌斑、牙垢、牙龈出血以及分泌液的量。牙齿放射照相通常用于评估牙齿骨骼支撑物的量。
[0051]牙周病的严重性通常基于由牙骨质-牙轴质接面或顶边缘测量的临床附着损失(CAL),且可被视为轻度(l-2mm)、中度(3_4mm)、或重度(≥5mm)。术语“临床附着损失”(CAL)是指牙骨质-牙轴质接面(即顶边缘)至顶端牙龈缘的距离(以毫米测量)。牙周病的特征也可在于袋探测深度，其中轻度疾病的特征在于牙周袋探测深度为约4-5mm，中度疾病的特征在于袋探测深度为约6-7mm，并且重度疾病的特征在于袋探测深度为约> 8mm。术语牙周的“袋探测深度”(PPD)是指牙骨质-牙轴质接面(即顶边缘)至牙槽骨嵴的距离(以毫米测量)。PH)与CAL测量用牙周探针在各牙齿周围的不同部位(例如近中颊部位或中颊部位)进行。其提供牙周病严重性的度量。或者，PH)与CAL可获自具有一些解剖学标志的标准数字放射照相。
[0052]牙周病包括但不限于牙菌斑诱发及非牙菌斑诱发的牙龈疾病；慢性牙周炎(分类为轻度(l-2mm CAL)、中度(3_4_ CAL)、或重度(≥5mm)系统化或局部化牵涉；侵袭性牙周炎(分类为(l-2mm CAL)、中度(3_4mm CAL)、或重度(> 5mm)系统化或局部化牵涉)；作为与血液学病症和遗传性病症相关的全身性疾病的表现的牙周炎；坏死性牙周疾病，包括坏死溃疡性牙龈炎和坏死性溃疡性牙周炎；牙周组织脓肿(包括牙龈、牙周和冠周脓肿)；与牙髓病变相关的牙周炎；以及发育或后天性畸形和病症，例如改变或易感染牙菌斑诱发的牙龈疾病或牙周炎的局部化牙齿相关因子、牙齿周围的粘膜牙龈畸形和病状、以及缺齿脊和咬合面外伤的病状。所有这些病状可局限于一个或几个特定牙齿或更系统化(即牵涉>30%的部位)。
[0053]如本文所用的术语“晚期牙周病”是指呈现CAL≥5mm或牙周PB)≥8mm的受试者。牙龈回缩、牙齿移动、活动性以及化脓为通常与归因于牙槽骨进行性破坏的晚期牙周病相关的病征。
[0054]在一些实施方案中，牙 槽骨流失因移除含有良性肿瘤的骨骼部分而产生。示例性良性骨肿瘤包括但不限于骨瘤、骨样骨瘤、骨母细胞瘤、骨软骨瘤、内生软骨瘤、软骨粘液样纤维瘤、动脉瘤样骨囊肿、单腔骨囊肿、骨纤维性发育异常以及骨骼巨细胞瘤。
[0055]施用骨硬化蛋白抑制剂增加牙槽骨的一或多个参数(例如牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨密度、牙槽骨体积、牙槽骨矿物含量以及改善的牙齿稳定性中的一或多个)。在此方面，“治疗”牙槽骨流失包括例如牙槽骨高度、牙槽骨质量以及牙槽骨密度的任何增加以及牙槽骨修复的加速。类似地，“治疗”牙槽骨流失包括调节牙槽骨修复的程度超出(即大于)未施用骨硬化蛋白抑制剂的受试者(即对照受试者)(例如哺乳动物，如人)中所经历的牙槽骨修复的程度。牙槽骨修复通过例如与治疗之前的此类参数相比，牙槽骨高度增加、牙槽骨体积增加、牙槽骨矿物含量和密度增加、牙齿稳定性增加或受感染区域的患者使用改善来证明。牙槽骨的任何一或多个参数的增加可为测量参数完全或部分回复至例如(a)基线程度(例如在疾病发作之前的程度)，(b)本领域中所用的规范化数据库或临床标准中所提供的值，或(C)对侧的功能程度(例如完全或部分地回复至例如受试者非患病牙槽骨的功能能力)。在一些情况中，增加可为超出基线程度的改善。需要时，施用一或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂的受试者的测量参数可与未施用骨硬化蛋白抑制剂的呈现牙槽骨流失的其它受试者(任选地年龄和性别匹配)的相同参数进行比较以进一步分析本文所述的方法的功效。
[0056]牙槽骨参数(例如牙槽骨高度、牙槽骨质量和/或牙槽骨密度)可以使用放射照相术(例如放射照相吸光光度法)、单一和/或双重能量X射线吸光光度法、定量计算机断层摄影术(QCT)、超声波扫描术、放射照相术(例如放射照相吸光光度法)以及磁共振成像来测量。在一些实施方案中，牙槽骨流失的量通过牙周袋探测深度测量来鉴别及/或定量。
[0057]在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的剂量和时间段有效使牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离与治疗前距离或对照受试者(即未接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的具有类似疾病病况的受试者)相比减小了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离恢复至疾病前状态。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离小于或等于约2mm(例如约 2_、约 L 9_、约 L 8_、约 L 7_、约 L 6_、约 L 5_、约 L 4mm、约 1.3_、约1.2mm、约1.1mm或约1mm)。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离与受试者口中的非患病区域(例如邻接或对侧牙齿)中的距离可比。
[0058]在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的剂量和时间段有效使牙槽骨高度与治疗前牙槽骨高度或对照受试者(即未接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨高度恢复至牙槽骨高度的疾病前状态。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨高度相比，牙槽骨高度增加了至少0.1mm (例如至少约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6_、约 0.7_、约 0.8_、约 0.9_、约 1_、约 L 5_、约 2_、约 2.5_、约 3_、约 3.5mm、约 4_、约 4.5_、约 5_、约 5.5_、约 6_、约 6.5_、约 7_、约 7.5_、约 8_、约 8.5_、约9mm、约9.5或约1mm)或更多。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨高度与受试者口中的非患病区域(例如邻接或对侧牙齿)中的距离可比。
[0059]在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的剂量和时间段有效使牙槽骨密度与治疗前牙槽骨密度或对照受试者(即未接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或更多)。在一些实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨密度恢复至疾病前状态牙槽骨密度(例如受试者口中的非患病牙龈区域的可比密度)。在人中，骨骼矿物密度通常使用双重X射线吸收测量法(DXA)在临床上测定。其它技术包括定量计算机断层摄影术(QCT)、超声波扫描术、单一能量X射线吸光测定法(SXA)、磁共振成像、放射照相术以及放射照相吸光测定法。除超声波扫描术以外，美国医药协会注意到BMD技术典型地包括使用X射线且基于辐射衰减取决于辐射路径中组织的厚度和组成的原理。所述技术通常包括将结果与规范化数据库作比较。
[0060]适用于评估成功的骨硬化蛋白抑制剂治疗的另一参数为牙槽骨体积分数(BVF)。如本文所用的术语“骨骼体积分数”是指每单位体积骨骼样品的矿化骨骼体积(BV/TV，% )且可例如通过微计算机断层摄影术(miCTo-CT)测量。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，与治疗前牙槽骨BVF相比或与对照受试者(即不接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的晚期牙周病受试者)相比，牙槽骨BVF增加了至少10% (例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多)。在一些或任何实施方案中，截至治疗开始后六周，牙槽骨BVF与受试者口中的非患病区域(例如邻接或对侧牙齿)中的牙槽骨BVF可比。
[0061]牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨密度以及牙槽骨体积分数中的一个或多个的增加和/或牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离减小(或任何其它牙槽骨参数的改进)可在最初施用骨硬化蛋白抑制剂后I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间时确定。或者，牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨体积分数以及牙槽骨密度中任一个或多个的增加(和/或牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离减小)可在治疗期结束后确定(例如治疗期结束后I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或I
年)。在一个方面，所述方法减少建立牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨密度及/或牙槽骨体积分数的所需程度和/或牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离减小所需的时间量，与未接受骨硬化蛋白抑制剂的年龄和性别匹配患者相比，例如本文所述的牙槽骨高度、牙槽骨质量或牙槽骨密度和/或牙槽骨体积分数和/或牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离的任何增加％，从而减少受试者恢复时间。例如，在一个实施方案中，与未接受骨硬化蛋白抑制剂的受试者相比，骨硬化蛋白抑制剂使增加牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨密度和/或牙槽骨体积分数和/或减小牙骨质-牙轴质接面与骨骼嵴之间的距离所需的时间量减少了至少约10% (例如至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、或至少约50% )。
[0062]指示牙槽骨增强的功能性生活质量参数包括但不限于牙齿损失风险减小；牙龈出血减少、牙周袋深度减小、牙龈组 织附着程度增加、发音改善；味觉改善；食用某些食品的能力增加；张力减小；进食改善及刺激性减小。如本文所述施用一个或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂在测试的患者群体中以统计学上显著的方式加速与牙槽骨流失相关的功能性生活质量参数的改进。
[0063]在一些实施方案中，在一段治疗期时程内对人施用一或多个剂量的骨硬化蛋白抑制剂(如骨硬化蛋白结合剂)(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)，所述治疗期包含1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31周、8个月、9个月、10个月、11个月、I年、18个月或更长时间。“治疗期”在施用第一剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)时开始且在施用最后剂量的骨硬化蛋白抑制剂之后结束。涵盖在治疗期期间施用骨硬化蛋白抑制剂任何次数。例如，在治疗期内，为受试者提供骨硬化蛋白抑制剂的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20个剂量或施用。在一个实施方案中，治疗期包含至少6周。在一些实施方案中，治疗期持续至少28周。在其它实施方案中，治疗期持续至少I年。或者或另外，治疗期持续至多18个月。实际上，在至多18个月、少于I年、至多8个月、至多28周或至多20周的治疗或治疗期内可以进行一或多次施用包含骨硬化蛋白抑制剂的医药组合物。在一个实施方案中，治疗期为约28周且与具有牙槽骨流失的未治疗的受试者相比，牙槽骨参数，如(但不限于)牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨体积分数以及牙槽骨密度显著改善。
[0064]施用促进、增强或加速牙槽骨修复的量的骨硬化蛋白结合剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。在任何实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂可施用给受试者(例如人受试者)，其量为每周约5毫克至约1，000毫克骨硬化蛋白抑制剂。例如，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的量可包含至少约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约 80mg、约 90mg、约 lOOmg、约 120mg、约 140mg、约 150mg、约 170mg、约 180mg、约 200mg、约 210mg、约 240mg、约 250mg、约 270mg、约 280mg、约 300mg、约 350mg、约 400mg、约 420mg、约 450mg、约 500mg、约 550mg、约 600mg、约 650mg、约 700mg、约 750mg、约 800mg、约 850mg、约900mg、约950mg或高达约1，OOOmg骨硬化蛋白抑制剂。还涵盖任何和所有这些终点之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约210mg、约75mg至约lOOmg、约 10mg 至约 150mg、约 120mg 至约 270mg、约 140mg 至约 210mg、或约 150mg 至约 200mg、或约280至约410mg。剂量以任何间隔施用，如一周多次(例如每周两次或三次)、每周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次。在一些或任何实施方案中，每周两次施用约120mg至约210mg范围内的剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。在一些或任何实施方案中，每周两次施用约140mg剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。在一些或任何实施方案中，治疗期为12周，并且在治疗期的第2周、第6周以及第12周施用骨硬化蛋白，剂量任选地为约140mg。本文所述的任何剂量可以作为分次剂量施用。例如，140mg剂量的骨硬化蛋白抑制剂可在牙科医生诊视期间以两次70mg骨硬化蛋白抑制剂的注射液或7次20mg骨硬化蛋白抑制剂的注射液施用。
[0065]在一些实施方案中，向受试者(例如哺乳动物，如人)施用的骨硬化蛋白结合剂的剂量范围可为约0.lmg/kg至约100mg/kg体重或约10mg/kg至约50mg/kg体重。例如，骨硬化蛋白抑制剂(例如骨硬化蛋白结合剂)的剂量范围可为约0.lmg/kg、约0.5mg/kg、约 lmg/kg、约 2mg/kg、约 3mg/kg、约 4mg/kg、约 5mg/kg、约 6mg/kg、约 7mg/kg、约 8mg/kg、约9mg/kg、约 10mg/kg、约 20mg/kg、 约 25mg/kg、约 26mg/kg、约 27mg/kg、约 28mg/kg、约 29mg/kg、约 30mg/kg、约 3lmg/kg、约 32mg/kg、约 33mg/kg、约 34mg/kg、约 35mg/kg、约 36mg/kg、约37mg/kg、约 38mg/kg、约 39mg/kg、约 40mg/kg、约 41mg/kg、约 42mg/kg、约 43mg/kg、约 44mg/kg、约 45mg/kg、约 46mg/kg、约 47mg/kg、约 48mg/kg、约 49mg/kg、或约 50mg/kg、约 55mg/kg、约 60mg/kg、约 65mg/kg、约 70mg/kg、约 75mg/kg、约 80mg/kg、约 85mg/kg、约 90mg/kg、或约95mg/kg、高达约 100mg/kg 体重。
[0066]另外，有利的可能是施用多次剂量的骨硬化蛋白结合剂或各剂量的施用隔开，这取决于针对特定患者而选择的治疗方案。例如，骨硬化蛋白抑制剂的剂量可每四周一次、每三周一次、每两周一次、每周一次或一周多次(例如每周两次、每周三次、每周四次或更多次)施用，这取决于疾病状态的严重性、患者的年龄和身体健康以及其类似因素。
[0067]在一些实施方案中，受试者任选地患有选自由晚期牙周病、软骨发育不全、经绝后骨质流失、口骨质流失、颌骨坏死以及与老化相关的颌骨流失组成的组的骨骼相关病症。受试者任选地正经受或已经受口或上颌面手术。
[0068]在一些实施方案中，受试者任选地患有选自由以下组成的组的继发性病状--幼年型佩吉特氏病(juvenile Paget’s disease)、肢骨纹状肥大、代谢骨骼疾病、肥大细胞增多症、镰刀型细胞贫血症/疾病、器官移植相关骨质流失、肾移植相关骨质流失、全身性红斑狼疮、强直性脊椎炎、癞痫症、幼年型关节炎皮疹、地中海贫血、粘多糖症、法布里疾病(Fabry Disease)、托纳综合症(Turner Syndrome)、唐氏综合症(Down Syndrome)、克兰菲特尔综合症(Klinefelter Syndrome)、麻疯病、帕瑟氏疾病(Perthe’s disease)、青春特发性疫柱侧凸、婴儿的发作多系统发炎性疾病、威彻斯特综合症(Winchester Syndrome)、曼克斯疾病(Menkes Disease)、威尔逊氏疾病(Wilson’s Disease)、局部缺血骨骼疾病(如雷卡佩氏病(Legg-Calve-Perthes disease)和区域性迁移骨质疏松症)、贫血状态、由类固醇引起的病状、糖皮质激素诱发的骨质流失、肝素诱发的骨质流失、骨髓病症、坏血病、营养不良、钙缺乏症、骨质疏松症、骨质减少、酒精中毒、慢性肝病、经绝后状态、慢性发炎性病状、类风湿性关节炎、发炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、发炎性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、月经过少、经闭、怀孕、糖尿病、甲状腺机能亢进、甲状腺病症、甲状旁腺病症、库欣氏病(Cushing’s disease)、肢端肥大症、性腺低能症、固定化或废弃、反射性交感神经营养不良综合症、区域性骨质疏松症、骨软化、与关节移位相关的骨质流失、HIV相关骨质流失、与生长激素损失相关骨质流失、与囊肿性纤维化相关骨质流失、化学疗法相关的骨质流失、肿瘤诱发的骨质流失、癌症相关的骨质流失、激素易消融骨质流失、多发性骨髓瘤、药物诱发的骨质流失、神经性厌食、疾病相关面骨损失、疾病相关颅骨损失、疾病相关颌骨质流失、疾病相关颅骨骨质流失、与老化相关骨质流失、与老化相关面骨损失、与老化相关颅骨损失、锁骨颅骨发育不全、软骨发育不良、纤维性结构不良、高雪氏病(Gaucher’sDisease)、血磷酸盐 过少拘偻病、马氏综合症(Marfan’s syndrome)、多发性遗传性外生骨疣、多发性神经纤维瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、巩膜病变、假关节、化脓性骨髓炎、牙周病、抗癞痫药物诱发的骨质流失、原发性和继发性甲状旁腺机能亢进、家族性甲状旁腺机能亢进综合症、失重诱发的骨质流失、男性骨质疏松症、骨关节炎、肾病性骨营养不良、骨骼渗透性病症、与老化相关颅骨骨质流失、以及与航天飞行相关的骨质流失。
[0069]在一些实施方案中，受试者任选地患有(或已患有)癌症。术语“癌症”是指与不受控制的细胞增殖、无限制的细胞生长、以及降低的细胞死亡/细胞凋亡相关的增殖病症。癌症包括但不限于乳癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、P53突变癌、以及激素依赖性肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经母细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、骨母细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、卵巢癌、白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴球性白血病、急性髓细胞性白血病，包括成髓细胞、前髓细胞、粒单核细胞、单核细胞以及红白血病)和慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病以及慢性淋巴细胞白血病)、骨髓发育不良综合症真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、万达斯曲姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链疾病，以及实体肿瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌瘤、乳头状腺癌、囊腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少枝胶质瘤以及脑膜瘤(menang1ma)。术语“转移”和“癌转移”本文互换使用来指癌细胞扩散至其它组织的能力。例如，“转移至骨骼”是指某些类型的癌症转移至骨骼的能力，所述类型的癌症包括但不限于乳腺、前列腺、肺、肾、甲状腺以及黑色素瘤。
[0070]本文所述的方法还适用于其它形式的牙周病，包括与以下全身性病症相关的牙周病:如心血管疾病、中风、肺病、发炎性疾病以及全身性红斑狼疮；与以下代谢障碍相关的牙周病:如糖尿病；以及与与例如绝经期相关的激素变化相关的牙周病。使用某些药物(如抗惊厥药、钙离子通道封闭剂以及环孢素)也可升高牙龈增生或牙周病风险，包括由例如HIV引起的免疫系统病症的某些血液学病症也如此。尤其涵盖用本文所述的骨硬化蛋白抑制剂治疗患有上述病症或有风险患上述病症的受试者。
[0071]在一些实施方案中，受试者任选地患有溶骨病症。如本文所用的术语“溶骨病症”是指由破骨细胞活性增加引起的任何病状，破骨细胞为造成骨吸收的细胞。术语“骨质溶解”和“溶骨骨质流失”互换使用来指破骨细胞介导的骨吸收或与溶骨病症相关的骨质流失。溶骨病症发生在具有发展溶骨病症倾向的受试者中，或其发生在患有因刺激破骨细胞活性而导致或促成溶骨病症的疾病的受试者中。在一些实施方案中，溶骨病症为溶骨骨质流失。在其它实施方案中，溶骨病症为癌症转移诱发的溶骨骨质流失。在其它实施方案中，溶骨病症为代谢骨骼疾病，包括但不限于内分泌病(例如皮质醇过多症、性腺低能症、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进、以及甲状腺机能亢进)；营养缺乏，包括但不限于佝偻病、骨软化、坏血病以及营养不良；骨质疏松症；药物使用，包括糖皮质激素(糖皮质激素诱发的骨质疏松症)、肝素以及酒 精；慢性疾病，包括吸收不良综合症；慢性肾衰竭，包括肾病性骨营养不良；慢性肝病，包括肝骨营养不良；遗传性疾病，包括成骨不全和高胱氨酸尿症；以及与关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、纤维性结构不良、牙周病以及佩吉特氏病相关的骨骼发炎。
[0072]术语“转移诱发的溶骨骨质流失”和“癌症转移诱发的溶骨骨质流失”本文互换使用来指由癌细胞转移至骨骼产生的骨质溶解或溶骨骨质流失。术语“癌症转移诱发的破骨细胞活化”本文用来指已转移至骨骼的癌细胞诱发破骨细胞活化的能力。
[0073]本文所述的方法包括施用一定量的“骨硬化蛋白抑制剂”。如本文所用的术语“骨硬化蛋白抑制剂”意指抑制骨上的骨硬化蛋白的生物活性的任何分子，如由以下各项的变化所测量:骨骼矿化、骨骼密度、骨骼高度、对骨母细胞和/或破骨细胞的作用、骨形成标记物、骨吸收标记物、骨母细胞活性标记物和/或破骨细胞活性标记物。此类抑制剂可通过结合骨硬化蛋白或其受体或结合搭配物来起作用。这个类别中的抑制剂包括“骨硬化蛋白结合剂”，例如像抗体或基于肽的分子。“骨硬化蛋白抑制剂”还指结合骨硬化蛋白并且抑制其活性的任选地分子量小于约1000道尔顿的小有机化学化合物。抑制剂或者可通过抑制骨硬化蛋白的表达起作用。这一类别中的抑制剂包括结合骨硬化蛋白DNA或mRNA且抑制骨硬化蛋白表达的多核苷酸或寡核苷酸，包括但不限于反义寡核苷酸、抑制性RNA、DNA酶(脱氧核糖酶)、核糖酶、适体或抑制骨硬化蛋白表达的其医药学上可接受的盐。
[0074]“骨硬化蛋白结合剂”结合骨硬化蛋白或其一部分以便封闭或减弱人骨硬化蛋白与一种或多种配体的结合。骨硬化蛋白，SOST基因的产物，不存在于硬化性骨化病中，硬化性骨化病为一种特征在于骨骼过度生长和强密度骨的骨骼疾病(Brunkow等人，Am.J.Hum.Genet.，68:577-589 (2001) ；BaIemans 等人，Hum.Mol.Genet.，10:537-543(2001))。人骨硬化蛋白的氨基酸序列由Brunkow等人报告且以SEQ ID NO:1公开于美国专利公布号20070110747(所述专利公布的骨硬化蛋白结合剂的描述和序列表全部并入)。重组人骨硬化蛋白 /SOST 可购自 R&D Systems (Minneapolis, Minn., USA ；2006 目录号 1406-ST-025)。另外，重组小鼠骨硬化蛋白/SOST可购自R&D Systems (Minneapolis, Minn., USA ；2006目录号1589-ST-025)。研究级骨硬化蛋白结合单克隆抗体可购自R&DSystems (Minneapolis, Minn.,USA ;小鼠单克隆:2006 目录号 MAB1406 ;大鼠单克隆:2006目录号MAB1589)。美国专利号6，395，511和6，803，453以及美国专利公布号20040009535和20050106683总体上涉及抗骨硬化蛋白抗体。适合用于本发明的上下文的骨硬化蛋白结合剂的实例还描述于美国专利公布号20070110747和20070072797中，所述公布特此以引用的方式并入。关于产生骨硬化蛋白结合剂的材料和方法的另外的信息可见于美国专利公布号20040158045 (特此以引用的方式并入)。
[0075]本发明的骨硬化蛋白结合剂优选为抗体。术语“抗体”是指完整抗体或其结合片段。抗体可包含完全抗体(免疫球蛋白)分子(包括具有全长重链和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化和/或人形式)，或包含其抗原结合片段。抗体片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fe以及Fd片段,并且可并入单结构域抗体(例如奈米抗体)、单链抗体、最大抗体、微型抗体、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR以及bis-scFv(参见例如Hollinger和 Hudson, Nature B1technology, 23 (9): 1126-1136 (2005))。抗体多肽，包括纤连蛋白多肽单抗体，也公开于美国专利号6，703，199中。其它抗体多肽公开于美国专利公布号20050238646中。美国专利号6，395，511 和6，803，453以及美国专利公布号20040009535和20050106683(其抗骨硬化蛋白抗体的公开内容以引用的方式全部并入)总体上涉及抗骨硬化蛋白抗体。人骨硬化蛋白的氨基酸序列阐述于序列表的SEQ ID NO:1中且以美国专利公布号20070110747的SEQ ID NO:1提供(所述专利公布的骨硬化蛋白和骨硬化蛋白结合剂的描述和序列表全部并入)。关于产生抗骨硬化蛋白抗体的材料和方法的另外信息可见于美国专利公布号20040158045(特此以引用的方式全部并入)。
[0076]抗体片段可为合成或基因工程化蛋白质。例如，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及轻链与重链可变区经由肽连接子连接的重组单链多肽分子(scFv蛋白质)。
[0077]抗体片段的另一形式为包含抗体的一个或多个互补决定区(OTR)的肽。⑶R(还称为“最小识别单位”或“高变区”)通过例如构筑编码所关注的⑶R的多核苷酸获得。此类多核苷酸例如通过利用聚合酶链反应使用抗体产生细胞的mRNA作为模板合成可变区来制备(参见例如 Larrick 等人，Methods: A Compan1n to Methods in Enzymology, 2:106 (1991)；Courtenay-Luck, “Genetic Manipulat1n of Monoclonal Antibodies，，，见 MonoclonalAntibodies Product1n, Engineering and Clinical Applicat1n, Ritter 等人(编)，第 166 页,Cambridge University Press (1995);以及 Ward 等人，“Genetic Manipulat1nand Express1n of Antibodies”， 见 Monoclonal Antibodies: Principles andApplicat1ns, Birch 等人(编)，第 137 页，ffiley-Liss, Inc.(1995))。
[0078]抗骨硬化蛋白抗体可结合SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白或其天然存在的变异体，亲和力(Kd)为小于或等于1χ10_7Μ、小于或等于1χ10_8Μ、小于或等于1χ10_9Μ、小于或等于ΙχΙΟ,Μ、小于或等于1χ10_ηΜ、或小于或等于1χ10_12Μ。亲和力利用多种技术测定，所述技术的一个实例为亲和力ELISA分析。在不同的实施方案中，亲和力通过BIAcore测定来测定。在不同的实施方案中，亲和力通过动力学方法测定。在不同的实施方案中，亲和力通过平衡/溶液法测定。美国专利公布号20070110747含有适于测定抗体对骨硬化蛋白的亲和力(Kd)的亲和力测定的其它描述。
[0079]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段结合包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽，并结合SEQ ID NO: 6 (CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC ；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸86-111)的序列。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸57-146的骨硬化蛋白多肽。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸89-103和/或SEQ ID NO:1的氨基酸137-151的骨硬化蛋白多肽。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体结合包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽并且结合SEQ ID NO:1内的以下中至少一者的序列:SEQ ID NO: 2 (DVSEYSCRELHFTR ；对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 51-64)、SEQ ID NO: 3 (SAKPVTELVC SGQCGPAR ;对应于 SEQ IDNO:1 的氨基酸 73-90)、SEQ ID NO:4 (WWRPSGPDFRCIPDRYR ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸101-117) ；SEQ ID NO: 5 (LVASCKCKRLTR ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 138-149)、SEQ IDNO: 70 (SAKPVTELVCSGQC ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸73-86)、SEQ ID NO: 71 (LVASCKC ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 138-144)、SEQ ID NO: 72 (ClRE LHFTR ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 57-64)、或 SEQ IDNO:73(CIPDRYR ;对应于 SEQ ID NO:1 的氨基酸 111-117)。例如，在一个方面，抗骨硬化蛋白抗体结合包含SEQ ID NO: 2-5 (和/或SEQ ID NO: 70-73)(任选地呈其天然三维构形)的SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的亚区。任选地,抗骨硬化蛋白抗体结合由SEQID NO:2, SEQ I D NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73中的一个或多个组成的肽(例如由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 以及 SEQ IDNO:5 组成的肽或由 SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72 以及SEQ ID NO: 73组成的肽)。
[0080]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体结合具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:5的氨基酸序列的骨硬化蛋白多肽，其中SEQ IDN0:2与4在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键连接，并且SEQ ID N0:3与5通过以下中的至少一者连接:(a)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144处的二硫键；所述多肽可保留SEQ ID NO:1的人骨硬化蛋白的相应多肽区的三级结构。或者或另外，骨硬化蛋白结合剂(例如抗骨硬化蛋白抗体)结合具有 SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72 以及 SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO: 72与73在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键连接，并且SEQ ID NO: 70与71通过以下中的至少一者连接:(a)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。
[0081]任选地，抗骨硬化蛋白抗体结合基本上由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDN0:4以及SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的肽，其中SEQ IDN0:2与4在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键连接，并且SEQ ID N0:3与5通过以下中的至少一者连接:(a)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。
[0082]任选地，抗骨硬化蛋白抗体结合基本上由SEQ ID NO:1的多截断人骨硬化蛋白组成的多肽，其中(a)所述多肽无SEQ ID NO:1的氨基酸1-50、65-72、91_100、118-137以及 150-190，或(b)所述多肽无 SEQ ID NO:1 的氨基酸 1_56、65-72、87_110、118-137 以及145-190。
[0083]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体结合具有SEQ ID NO:70, SEQ IDN0:71、SEQ ID NO: 72以及SEQ ID NO: 73的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO: 72与73在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键连接，并且SEQ ID NO: 70与71通过以下中的至少一者连接:(a)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。
[0084]在一些或任何实施方案中，多肽保多留SEQ ID NO:1的人骨硬化蛋白的相应肽区的
三级结构。
[0085]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体结合:[0086](i)人骨硬化蛋白的包含 SEQ ID NO:1 的 51_64、73_90、101-117 以及 138-149 的一部分，其中所述部分具有以下至少一者、至少两者或所有三者:
[0087](a)氨基酸57与111之间的二硫键；
[0088](b)氨基酸82与142之间的二硫键；以及
[0089](c)氨基酸86与144之间的二硫键；或
[0090](ii)人骨硬化蛋白的包含 SEQ ID NO:1 的 57_64、73_86、111-117 以及 138-144 的一部分，其中所述部分具有以下至少一者、至少两者或所有三者: [0091 ] (a)氨基酸57与111之间的二硫键；
[0092](b)氨基酸82与142之间的二硫键；以及
[0093](c)氨基酸86与144之间的二硫键。
[0094]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体还结合SEQ ID NO:6的表位。
[0095]本文所述的方法中使用的抗骨硬化蛋白抗体优选在美国专利公布号2007/0110747中所述的基于细胞的测定中和/或在美国专利公布号20070110747中所述的体内分析中调节骨硬化蛋白功能，和/或结合美国专利公布号2007/0110747中所述的一个或多个表位和/或交叉封闭美国专利公布号2007/0110747中所述的抗体中的一个的结合和/或通过美国专利公布号2007/0110747中所述的抗体中的一个交叉封闭结合骨硬化蛋白(其表征抗骨硬化蛋白抗体的测定的描述以引用的方式全部并入)。
[0096]在不同的方面，当与每孔的骨硬化蛋白摩尔数相比，每孔存在少于6倍过量的摩尔数的骨硬化蛋白结合位点时，在基于MC3T3细胞的矿化测定中，所述抗骨硬化蛋白抗体能够中和人骨硬化蛋白。使用培养物中的骨母细胞谱系细胞(原代细胞或细胞系)矿化作为骨形成的体外模型。示例性基于细胞的矿化测定描述于美国专利公布号20070110747的例如实施例8(特此以引用的方式并入)中。MC3T3-E1细胞(Sudo等人，J.Cell B1l., 96:191-198(1983))和原始细胞系的亚克隆在分化剂存在下生长之后可形成培养物中的矿物。此类亚克隆包括MC3T3-El-BF(Smith等人，J.B1l.Chem.，275:19992-20001(2000))。对于 MC3T3-E1-BF 亚克隆以及原始 MC3T3-E1 细胞，骨硬化蛋白可抑制一个或多个导致且包括矿物沉积的一系列事件(即骨硬化蛋白抑制矿化)。能够中和骨硬化蛋白抑制活性的抗骨硬化蛋白抗体允许培养物在骨硬化蛋白存在下矿化，以致例如磷酸钙(作为钙加以测量)沉积与仅骨硬化蛋白(即无抗体)治疗组中所测量的钙量相比统计上显着增加。
[0097]当以测定特定抗骨硬化蛋白抗体(或其它骨硬化蛋白抑制剂)是否可以中和骨硬化蛋白为目标进行测定时，测定中所用的骨硬化蛋白的量理想地为与无骨硬化蛋白组中所测量的钙量相比，在仅骨硬化蛋白组中引起统计上显著的至少70%的磷酸钙(作为钙加以测量)沉积减少的骨硬化蛋白的最低量。抗骨硬化蛋白中和抗体定义为与仅骨硬化蛋白(即无抗体)治疗组中测量的钙量相比引起磷酸钙(作为钙加以测量)沉积统计上显著增加的抗体。为测定抗骨硬化蛋白抗体是中和性的还是非中和性的，用于测定中的抗骨硬化蛋白抗体的量需要使得，与每孔骨硬化蛋白摩尔数相比每孔骨硬化蛋白结合位点的摩尔数为过量的。取决于抗体效能而定，可能需要的倍数过量可为24、18、12、6、3或1.5，并且所属领域的技术人员熟悉测试超过一个浓度的结合剂(抗体)的常规实践。例如，当与每孔的骨硬化蛋白摩尔数相比，每孔存在少于六倍过量的摩尔数的骨硬化蛋白结合位点时，极有效的抗骨硬化蛋白中和抗体将中和骨硬化蛋白。不太有效的抗骨硬化蛋白中和抗体将仅在
12、18或24倍过量下中和骨硬化蛋白。
[0098]在基于细胞的分析如骨骼特异性碱性磷酸酶测定(例如国际专利公布号WO2008/115732和美国专利7，744，874(基于细胞的测定和抗骨硬化蛋白抗体的描述以引用的方式全文并入本文中)中描述的骨骼特异性碱性磷酸酶测定)中，抗骨硬化蛋白抗体中和人骨硬化蛋白的IC5tl任选地为10nM或更小，或75nM或更小，或50nM或更小，或25nM或更小。骨骼特异性碱性磷酸酶测定基于骨硬化蛋白降低多潜能鼠类细胞系C2C12中BMP-4和Wnt3a刺激的碱性磷酸酶含量的能力。根据WO 2008/115732，中和抗骨硬化蛋白抗体在此测定中介导碱性磷酸酶活性的剂量依赖性增加。基于细胞的测定的示例性方案提供于实施例I中。
[0099]或者或 另外，在HEK293细胞系中在基于细胞的Wnt信号传导测定如国际专利公布号TO 2009/047356中描述的STF报告基因的牵涉Wntl介导诱发的Wnt测定(基于细胞的测定和抗骨硬化蛋白抗体的论述以引用的方式并入)中，抗骨硬化蛋白抗体中和人骨硬化蛋白的IC5tl为10nM或更小(例如75nM或更小，或50nM或更小)。或者或另外，在MC3T3细胞中的BMP2诱发的矿化测定如描述于例如国际专利公布号WO 2009/047356中的矿化测定中，抗骨硬化蛋白抗体中和人骨硬化蛋白的IC5tl为500nM或更小(例如250nM或更小、150nM或更小、10nM或更小、或50nM或更小)。示例性方案提供于实例I中。
[0100]适合用于本发明的上下文的抗骨硬化蛋白抗体的实例描述于美国专利公布号2007/0110747和2007/0072797中，所述公布特此以引用的方式并入。在本发明的一个实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭至少一种以下抗体与骨硬化蛋白结合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2, Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab-12、Ab-13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 以及Ab-24(全部描述于美国专利公布号20070110747中)。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体被至少一种以下抗体交叉封闭与骨硬化蛋白的结合:Ab_A、Ab-B> Ab-C> Ab-D> Ab-1> Ab_2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24 (全部描述于美国专利公布号20070110747 中)。术语“交叉封闭(cross-block>cross-blocked 以及 cross-blocking) ”本文互换使用以意指抗体干扰其它抗体与骨硬化蛋白的结合的能力。抗体能够干扰另一者与骨硬化蛋白结合的程度且因此是否可认为其交叉封闭可使用竞争结合测定来确定。在本发明的一些方面，交叉封闭抗体或其片段使参考抗体的硬化蛋白结合减少了约40 %至约100%、如约60%至约100%、尤其70%至100%、且更尤其80%至100%。检测交叉封闭的尤其适合的定量测定使用利用表面等离子体共振技术测量相互作用程度的Biacore机器。另一适合的定量交叉封闭测定使用基于ELISA的方法测量抗体之间结合骨硬化蛋白的竞争。
[0101]在一些或任何实施方案中，抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭包含全长重链和轻链的免疫球蛋白与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合和/或被包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉封闭与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合，其中所述包含全长重链和轻链的免疫球蛋白包含本文公开的⑶R序列，如以下三组⑶R序列中的一者:a)SEQ ID NO:284的⑶R_L1、SEQID NO:285 的 CDR-L2、SEQ ID NO:286 的 CDR_L3、SEQ ID NO:296 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:297 的CDR-H2、以及 SEQ ID NO:298 的 CDR-H3 ；b)SEQ ID NO:48 的 CDR-Ll、SEQ ID NO:49 的 CDR-L2、SEQ IDN0:5(^3CDR-L3、SEQ ID NO:45 的 CDR-Hl、SEQ ID NO: 46 的 CDR-H2、以及 SEQ ID NO:47的 CDR-H3 ;或 c)SEQ ID NO:42 的 CDR-LU SEQ ID NO:43 的 CDR_L2、SEQ ID NO:44 的 CDR-L3、SEQ ID NO:39 的 CDR-HU SEQ ID NO:40 的 CDR-H2、以及 SEQ ID NO:41 的 CDR-H3。或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭包含全长重链和轻链的免疫球蛋白与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合和/或被包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉封闭与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合，其中所述包含全长重链和轻链的免疫球蛋白包含以下⑶R:SEQ ID NO:245的CDR-HU SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的 CDR-LU SEQID NO:79 的 CDR-L2 以及 S EQ ID NO:80 的 CDR-L3。
[0102]或者或另外，抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭包含全长重链和轻链的免疫球蛋白与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合和/或被包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉阻断与SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白的结合，其中所述包含全长重链和轻链的免疫球蛋白包含以下CDR:SEQ ID NO:269 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:270 的 CDR-H2、SEQ ID NO:271 的 CDR-H3、SEQ IDNO: 239 的 CDR-Ll、SEQ ID NO: 240 的 CDR-L2 以及 SEQ ID NO: 241 的 CDR-L3。
[0103]适合的抗骨硬化蛋白抗体和其片段的实例包括具有本文特定公开且美国专利公布号 20070110747 中所公开的 CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3 中的一或多个的抗体和抗体片段。⑶R-H1、⑶R-H2、⑶R-H3、⑶R-L1、⑶R-L2以及⑶R-L3的区中的至少一者可具有至少一个氨基酸取代，其限制条件为抗体保留未经取代的CDR的结合特异性。示例性抗骨硬化蛋白抗体包括但不限于美国专利公布号20070110747的Ab_A、Ab_B、Ab-C、Ab-D、Ab-1、Ab-2、Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
[0104]另外，抗骨硬化蛋白抗体可包含至少一个与选自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR序列:SEQ ID NO: 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、78、79、80、81、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、351、352、353、358、359以及360，其提供于序列表中且公开于美国专利公布号20070110747中。抗骨硬化蛋白抗体优选包含至少一个与选自以下的⑶R具有至少75%—致性的⑶R序列:SEQ ID NO:245,246、247、78、79、80、269、270、271、239、240以及241，其全部提供于序列表中且描述于美国专利公布号20070110747中。如美国专利公布号20070110747所述，抗骨硬化蛋白抗体可包含:a) SEQ ID N0:54、55 以及 56 的 CDR 序列和 SEQ ID N0:51、52 以及 53 的 CDR 序列；b)SEQID N0:60、61 以及 62 的 CDR序列和 SEQ ID NO: 57、58 以及 59 的 CDR序列；c) SEQ ID NO: 48、49以及50的CDR序列和SEQ ID NO: 45、46以及47的CDR序列；d) SEQ ID NO: 42、43以及44的CDR 序列和 SEQ ID NO: 39,40 以及 41 的 CDR 序列；e)SEQ ID N0:275、276 以及 277 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 287、288 以及 289 的 CDR序列；f) SEQ ID NO: 278、279 以及 280 的 CDR序列和SEQ ID NO: 290、291 以及 292 的 CDR 序列；g) SEQ ID NO: 78、79 以及 80 的 CDR 序列和 SEQ IDNO: 245、246 以及 247 的 CDR序列;h) SEQ ID NO: 81、99 以及 100 的 CDR序列和 SEQ ID NO: 248、249 以及 250 的 CDR 序歹Ij ；i)SEQ ID NO: 101、102 以及 103 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:251、252以及 253 的 CDR 序歹Ij ；j)SEQ ID NO: 104、105 以及 106 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:254、255 以及 256 的 CDR 序歹Ij ；k) SEQ ID NO: 107、108 以及 109 的 CDR 序列和 SEQ ID NO:257、258 以及259 的 CDR序歹Ij ；1)SEQ ID NO: 110、111 以及 112 的 CDR序列和 SEQ IDN0:260、261 以及 262的 CDR 序歹Ij ；m) SEQ ID NO: 281、282 以及 283 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 293、294 以及 295 的CDR 序歹Ij ；n) SEQ ID NO: 113、114 以及 115 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 263,264 以及 265 的 CDR序歹Ij ；o)SEQ ID NO: 284,285 以及 286 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 296,297 以及 298 的 CDR 序列；p)SEQ ID N O: 116、237 以及 238 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 266、267 以及 268 的 CDR 序列；q) SEQ ID NO: 239,240 以及 241 的 CDR 序列和 SEQ ID NO: 269,270 以及 271 的 CDR 序列；)SEQ ID NO: 242、243 以及 244 的 CDR 序列以及 SEQ ID NO: 272、273 以及 274 的 CDR 序列；或s)SEQ IDNO:351、352 以及 353 的 CDR 序列和 SEQ IDNO:358、359 以及 360 的 CDR 序列。
[0105]抗骨硬化蛋白抗体可包含至少一个与选自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR 序列:CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 245中给出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 246中给出的序列，CDR-H3具有SEQ ID NO:247中给出的序列，CDR-Ll具有SEQ ID NO:78中给出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 79中给出的序列，并且CDR-L3具有SEQ ID NO:80中给出的序列，全部提供于序列表中并且描述于美国专利公布号20070110747中。在不同的方面，抗骨硬化蛋白抗体包含两个⑶R或六个⑶R。任选地，抗骨硬化蛋白抗体包含含有SEQ ID NO: 378的重链(例如两个重链)的全部或一部分以及含有SEQ ID N0376的轻链(例如两个轻链)的全部或一部分。
[0106]抗骨硬化蛋白抗体可包含至少一个与选自以下的⑶R具有至少75%—致性(例如 100%—致性)的 CDR 序列:CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 269中给出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 270中给出的序列，CDR-H3具有SEQ IDNO:271中给出的序列，CDR-Ll具有SEQ ID NO:239中给出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 240中给出的序列，并且CDR-L3具有SEQ ID N0241中给出的序列，全部提供于序列表中并且描述于美国专利公布号20070110747中。在不同的方面，抗骨硬化蛋白抗体包含至少两个⑶R或六个⑶R。任选地，抗骨硬化蛋白抗体包含含有SEQ ID NO: 366的重链(例如两个重链)的全部或一部分以及含有SEQ ID N0364的轻链(例如两个轻链)的全部或一部分.[0107]或者，抗骨硬化蛋白抗体可具有重链，所述重链包含⑶R的H1、H2以及H3并且包含具有SEQ ID NO: 137、145或392中所提供的序列或其变体的多肽，其中⑶R分别与SEQ IDNO: 245,246以及247具有至少75%—致性(例如100%—致性)；以及轻链，所述轻链包含⑶R的L1、L2及L3并且包含具有SEQ ID NO: 133或141中所提供的序列或其变体的多肽，其中CDR分别与SEQ ID N0:78、79以及80具有至少75%—致性(例如100%—致性)(如美国专利公布号20070110747中所述)。
[0108]抗骨硬化蛋白抗体可具有重链，所述重链包含⑶R的H1、H2以及H3并且包含具有SEQ ID NO: 335、331、345或396中所提供的序列或任何上述者的变体的多肽，其中⑶R分别与SEQ ID NO:269,270以及271具有至少75%—致性(例如100%—致性)；以及轻链，所述轻链包含⑶R的L1、L2以及L3并且包含具有SEQ ID NO:334或341中所提供的序列或任何上述者的变体的多肽，其中⑶R分别与SEQ ID NO:239,240以及241具有至少75% —致性(例如100%—致性)(如美国专利公布号20070110747中所述)。涵盖重链与轻链序列的所有组合(例如包含SEQ ID NO:335的重链和包含SEQ ID NO:334的轻链；包含SEQ IDNO: 331的重链和包含SEQ ID NO: 334或341的轻链；以及包含SEQ ID NO: 345或396的重链和包含SEQ ID NO: 341的轻链)。
[0109]或者，抗骨硬化蛋白抗体具有包含具有SEQ ID NO: 137中提供的序列的多肽的重链、以及包含具有SEQ ID NO: 133中提供的序列的多肽的轻链；包含具有SEQ ID NO: 145或392中提供的序列的多肽的重链、以及包含具有SEQ ID NO: 141中提供的序列的多肽的轻链；包含具有SEQ ID N0:335中提供的序列的多肽的重链、以及包含具有SEQ IDN0:334中提供的序列的多肽的轻链；包含具有SEQ ID NO: 331中提供的序列的多肽的重链、以及包含具有SEQ ID NO:341中提供的序列的多肽的轻链；包含具有SEQ ID NO:345或396中提供的序列的多肽的重链、以及包含具有SEQ IDN0:341中提供的序列的多肽的轻链(如美国专利公布号200701107 47中所述)。
[0110]抗骨硬化蛋白抗体的实例还包括但不限于国际专利公布号WO 2008/092894、WO2008/115732、WO 2009/056634、WO 2009/047356、WO 2010/100200、WO 2010/100179、WO2010/115932以及WO 2010/130830中所公开的抗骨硬化蛋白抗体(各以引用的方式全部并入本文中)，如包含国际专利公布号WO 2008/115732的SEQ ID NO: 20-25 (本文中的SEQ IDN0:416-421)的CDR的抗骨硬化蛋白抗体、包含国际专利公布号WO 2008/115732的SEQ IDN0:26-31(本文中的SEQ ID NO:422-427)的CDR的抗骨硬化蛋白抗体、包含国际专利公布号WO 2008/115732 的 SEQ ID NO: 32-37 (本文中的 SEQ ID NO:428-433)的 CDR 的抗骨硬化蛋白抗体、包含国际专利公布号WO 2009/047356的SEQ ID NO:4、15、26、37、48以及59(分别为本文中的SEQ ID N0:443、454、465、476、487以及498)的CDR的抗骨硬化蛋白抗体、或包含国际专利公布号 WO 2010/130830 的 SEQ ID NO: 135-143、153-161、或 171-179 中的至少一者(分别为本文中的SEQ ID NO: 745-753、763-771、781-789)的氨基酸序列的抗骨硬化蛋白抗体。
[0111]或者，本文所述的方法包括施用除抗骨硬化蛋白抗体以外的骨硬化蛋白抑制剂。此类药剂可对SOST或骨硬化蛋白直接或间接起作用。涵盖用于本文所述的方法的骨硬化蛋白抑制剂包括美国专利公布号2003/0229041(特此整个公开内容以引用的方式并入，尤其着重地描述了骨硬化蛋白抑制剂)中所述的骨硬化蛋白抑制剂。例如，适用于调节SOST表达和骨硬化蛋白活性的药剂包括但不限于类固醇(如对应于美国专利公布号2003/0229041的式I的那些)、生物碱、萜类化合物、类肽以及合成化学物质。在一些实施方案中，SOST拮抗剂或激动剂可结合糖皮质激素受体。例如，地塞米松倾向于消除BMP-4和BMP-6对SOST表达的刺激作用。其它化学实体，包括糖皮质激素类似物、胆盐(如对应于美国专利公布号2003/0229041的式3的那些)以及前列腺素(如对应于美国专利公布号2003/0229041的式2的那些)也调节骨骼形态发生蛋白对SOST表达的作用，且涵盖使用于本文所述的方法中。
[0112]可根据本文所述的方法使用的骨硬化蛋白表达抑制剂包括但不限于抑制核酸，包括其药学上可接受的盐，例如钠盐。在一些实施方案中，如本文别处描述的抑制核酸选自由以下组成的组:反义寡核苷酸、核糖酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、SiRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物如siRNA化合物、修饰的碱基/锁定核酸(LNA)、拮抗分子(antagomir)、肽核酸(PNA)、以及与目标核酸的至少一部分杂交且调节其功能的其它寡聚化合物或寡核苷酸模拟剂。在一些实施方案中，抑制剂核酸为单链或双链的。在一些实施方案中，抑制核酸为反义寡核苷酸、修饰的碱基/锁定核酸(LNA)、肽核酸(PM)、阿拉伯糖核酸(ANA)(如例如PCT公布号W099/67378中所述)；2’ -氟-D-阿拉伯糖核酸(FANA)(如例如 Lon 等人，B1chem.，41:3457-3467，2002 以及 Min 等人，B10rg.Med.Chem.Lett.，12:2651-2654，2002中所描述；其公开内容以全文引用的方式并入本文中)；磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)(例如 Iverson, Curr.0pin.Mol.Ther.，3: 235-238，2001 ；以及Wang等人，J.Gene Med.，12:354-364, 2010中所描述；其公开内容以引用的方式全部并入本文中)；乙烯桥联 核酸(如例如国际专利公布号WO 2005/042777 ;Morita等人，NucleicAcid Res.，增刊 1:241-242，2001 ；Surono 等人，Hum.Gene Ther.，15:749-757，2004 ；Koizumi, Curr.0pin.Mol.Ther., 8:144-149，2006 ；以及 Horie 等人，Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf), 49:171-172, 2005中所描述；其公开内容以引用的方式全部并入本文中)；2’ -O, 4’ -C-乙烯桥联核酸、核糖酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、微RNA(miRNA)、小的临时RNA (StRNA)、以及单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物或siRNA。在一些实施方案中，抑制核酸包含至少一个核苷酸和/或核苷修饰(例如具有修饰的骨架或修饰的糖部分的寡聚核酸)。
[0113]用于本文所述的方法中的特定骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的活性可以多种方式测量，包括上述用于检测骨骼矿物含量或骨骼密度增加的方法。骨硬化蛋白抑制剂调节骨骼质量的能力可由体重或利用其它方法计算(参见 Guinness-Hey, Metab.Bone Dis.Relat.Res., 5:177-181 (1984))。本领域中使用动物和特定的动物模型测试医药组合物和方法对例如骨质流失、骨吸收、骨形成、骨骼强度或骨矿化参数的作用。此类模型的实例包括切除卵巢的大鼠模型(Kalu，Bone andMineral, 15:175-192(1991) ；Frost 以及 Jee，Bone and Mineral, 18:227-236(1992);以及Jee 以及 Yao, J.Musculoskel.Neuron.1nteract., 1:193-207 (2001))。本文所述的测量骨硬化蛋白结合剂活性的方法还可用于测定其它骨硬化蛋白抑制剂的功效。
[0114]或者，可基于调节骨骼标记物含量的能力选择骨硬化蛋白抑制剂。骨骼标记物为骨骼重塑过程中产生的产物且由骨骼、骨母细胞和/或破骨细胞释放。骨吸收和/或骨形成“标记物”含量的波动暗示骨骼重塑/塑造的变化。国际骨质疏松症基金会(1F)推荐使用骨骼标记物监测骨骼密度疗法(参见例如Delmas等人，Osteoporos Int.,增刊.6:S2-17(2000)，以引用的方式并入本文中)。指示骨吸收(或破骨细胞活性)的标记物包括例如C-端肽(例如I型胶原蛋白的C末端端肽(CTX)或血清交联的C-端肽)、N-端肽(I型胶原蛋白的N末端端肽(NTX))、脱氧吡啶啉(DB))、吡啶啉、尿羟脯氨酸、半乳糖羟赖氨酸、以及酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(例如血清酒石酸盐抗性酸性磷酸酶同功异型物5b)。骨形成/矿化标记物包括但不限于骨骼特异性碱性磷酸酶(BSAP)、I型原胶原的N末端和C末端延伸释放的肽(P1NP、PICP)、以及骨钙素(OstCa)。数种试剂盒可自商业上购得用于检测并且定量临床样品(如尿和血液)中的标记物。
[0115]施用涂径
[0116]骨硬化蛋白抑制剂优选以可包含载体、赋形剂或稀释剂的生理学上可接受(例如医药)组合物形式施用给受试者。应了解，本文所述的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)可用于制备使用本文公开的任何剂量和/或时机方案施用的药剂。医药组合物和治疗方法公开于美国专利公布号20050106683和2007/110747中，其以引用的方式并入本文中。“生理学上可接受”指分子实体和组合物在施用给人时并不产生过敏性或类似的不良反应。另外，施用给受试者的组合物可以含有超过一种骨硬化蛋白抑制剂(例如两种抗骨硬化蛋白抗体、或骨硬化蛋白结合剂以及合成的化学骨硬化蛋白抑制剂)或骨硬化蛋白抑制剂与一或多种具有不同作用机制的治疗剂组合。
[0117]适用于多种施用途径的组合物和制剂的研发在本领域中为熟知的且讨论于美国专利公布号2007/0110747中，施用途径包括例如皮下、经口、胃肠外、静脉内、鼻内以及肌肉内施用。例如，在某些环境中，希望皮下、胃肠外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送包含骨硬化蛋白结合剂的医药组合物。此类方法对所属领域的技术人员为熟知的，其中一些进一步描述于例如美国专利号5，543，158,5, 641，515以及5，399，363中。适于可注射用途的说明性医药形式包括无菌水溶液或分散液和临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂(例如参见美国专利号5，466，468)。在所有情况下，所述形式必须为无菌的且必须为达到存在可容易注射性(即，无过度粘性以防穿过注射器)的程度的流体。
[0118]在一个方面，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)全身性施用。在一个实施方案中，对于水溶液形 式的胃肠外施用，所述溶液必要时应合适地缓冲，且所述液体稀释剂首先用足够生理盐水或葡萄糖变得等张。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下以及腹膜内施用。例如，一个剂量可溶解于Iml等张的NaCl溶液，且添加至100ml皮下灌注流体或注射在建议的输注部位(参见例如Remington’s PharmaceuticalSciences,第 15 版，Mack Pub.C0.，Easton, PA,第 1035-1038 页和第 1570-1580 页)。剂量和施用频率的一些变化可取决于所治疗受试者的病状；患者的年龄、身高、体重以及总体健康状况；以及任何副作用的存在而发生。另外，包含骨硬化蛋白结合剂的医药组合物可连同提供关于使用此类医药组合物的说明书的包装材料一起而置放在容器(例如小瓶或预填充注射器)内。一般来说，此类说明书将包括有形的表达，所述表达描述试剂浓度，并且在某些实施方案内，描述可能为复原医药组合物所必需的赋形剂成分或稀释剂(例如水、生理盐水或PBS)的相对量。
[0119]在另一方面，局部施用给受试者骨硬化蛋白抑制剂。在一些或任何实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)根据疾病而施用至患病牙龈、骨骼或牙齿区域。在此方面，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)任选地通过例如含有骨硬化蛋白抑制剂以及适当载体的注射器直接注射至牙龈组织中和/或施用于牙周袋。
[0120]对于局部施用方面(如直接皮下注射骨硬化蛋白抑制剂至受试者的患病牙龈区域或患病牙周袋中)，骨硬化蛋白抑制剂任选地以约0.1mg至约20mg的量施用给受试者。在一些实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂直接施用至受感染区域，施用量为约0.lmg、0.5mg、lmg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、llmg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19或约20mg。剂量以任何间隔施用，如每周多次(例如每周两次或三次)、每周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次。在一些或任何实施方案中，每周两次施用约0.1mg至约20mg范围内的剂量的骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)。抑制剂的量任选地沿受感染区域的片区以分次剂量施用，例如利用多个注射液。
[0121 ] 在一些或任何实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)并入凝胶、网状物、基质或胶原蛋白海绵中，嵌入牙齿植入物或骨移植物中，或涂布在植入物上。植入物可为受试者的自身牙齿(例如因外伤而丢失)的再植入或假体植入物(由例如塑料、陶瓷、金属制成或如WO 2004/074464中所述由干细胞制成)。
[0122]术语“网状物”意指呈任何形式的任何材料，包括例如打结、编织(braided)、挤出、冲压、编结、编织(woven)、非编织或其它形式，且可包括具有实质上规则和/或不规则图案的材料。可使用非编织网状物的实例，包括电纺材料(关于制备电纺奈米纤维材料的评论，参见 Zheng-Ming Huang 等人，Composites Science and Technology, 2003, 63:2223-2253)。网状物可为但不限于交联纤维网状物、奈米纤维网状物、网状物织物、生物可降解的聚合物网状物或任何上述者的组合。网状物可为不可降解的、可降解的或生物可降解的。可降解的网状物可为 可经由非生物方式(例如水解或光解作用)降解的网状物。在不同的实施方案中，生物可降解的网状物为可由生物系统通过细胞或消化酶作用或经由生物分子氧化而分解的一类网状物。
[0123]用于经口递送抗体的示例性凝胶制剂物描述于WO 2010/1004179中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，凝胶为由合成或天然起源的高分子量生物相容的弹性聚合物制成的水凝胶。水凝胶的合乎要求的性质为在人体内快速响应机械应力、尤其剪切和荷载的能力。涵盖获自天然来源的水凝胶，因为其对于体内应用更可能为生物可降解的且生物相容的。适合的水凝胶包括天然水凝胶，例如像明胶；胶原蛋白；丝；弹性蛋白；纤维蛋白以及多糖衍生的聚合物；葡甘露聚糖凝胶；透明质酸；多糖，如交联的含羧基的多糖，或其组合。合成的水凝胶包括但不限于由聚乙烯醇形成的那些；丙烯酰胺，如聚丙烯酸和聚(丙烯睛-丙烯酸)；聚氨基甲酸酯；聚乙二醇(例如PEG3350、PEG4500、PEG8000);硅酮；聚烯烃，如聚异丁烯和聚异戊二烯；硅酮与聚氨基甲酸酯的共聚物；氯丁橡胶；丁腈橡胶；硫化橡胶；聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)；丙烯酸酯，如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)和丙烯酸酯与N-乙烯基咯烷酮的共聚物；N-乙烯基内酰胺；聚丙烯腈或其组合。水凝胶材料可进一步按需要交联以提供进一步强度。不同类型的聚氨基甲酸酯的实例包括热塑性或热固性聚氨基甲酸酯、脂族或芳族聚氨基甲酸酯、聚醚型氨基甲酸酯、聚碳酸酯-氨基甲酸酯或硅酮聚醚-氨基甲酸酯、或其组合。
[0124]在不同的实施方案中，不是直接将骨硬化蛋白抑制剂混合于凝胶中，而是将装载骨硬化蛋白抑制剂的微球体分散在凝胶内。在一个实施方案中，微球体提供骨硬化蛋白抑制剂的持续释放。在又一个实施方案中，生物可降解的凝胶阻止微球体释放骨硬化蛋白抑制剂；微球体因此在其自凝胶释放之前并不释放骨硬化蛋白抑制剂。例如，凝胶可布署在靶组织部位(例如牙槽嵴)周围。
[0125]本发明还涵盖使用粘附凝胶剂以限制骨硬化蛋白抑制剂的分散。凝胶剂可布署于例如牙周袋、牙齿、牙槽骨中或布署于周围的牙龈组织中。
[0126]在一些或任何实施方案中，骨硬化蛋白抑制剂配制成糊状物、药膏、蜡、洗剂、冲洗液、有/无增积剂的干燥散剂以及本领域已知的局部施用的不同的其它形式。骨硬化蛋白抑制剂还可以散剂或喷洒溶液或漱口溶液形式局部递送。或者，骨硬化蛋白抑制剂并入伤口敷料、护垫、纱布、或施加于所关注的患病区域(例如患病牙龈区域或牙周袋)的其它装置，所述骨硬化蛋白抑制剂自所述装置转移至所关注的患病区域。
[0127]组合疗法
[0128]通过组合两种或两种以上靶向相同病原体或生物化学路径的药剂的病理学治疗相对于单独使用治疗上有关的剂量的各药剂有时产生更高的功效和减小的副作用。在一些情况下，药物组合的功效相加(组合的功效近似等于各药物单独作用的总和)，但在其它情况下，作用可为协同的(组合功效大于单独给予的各药物的作用的总和)。如本文所使用，术语“组合疗法”意指两种化合物可以同时的方式(例如并行)递送，或其中一种化合物首先施用，接着例如相继施用第二药剂。所要结果可为剂量接受者中一或多种症状的主观减轻或客观可识别的改善。 [0129]在一些实施方案中，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)与使用支持骨骼再生长的材料组合，所述材料如骨移植物、骨粉、骨碎片、去矿化骨基质、骨骼支架、修复体、金属稳定剂或骨骼支架物质，其包含一或多种聚合物、陶瓷、牙骨质以及基于磷酸钙的骨骼移植物取代物。本领域中已知此类材料的许多变体。
[0130]在一些或任何实施方案中，本文所述的方法或用途包括在施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)之前向受试者施用治疗牙周病的标准护理疗法。例如,在一些实施方案中，治疗牙周病的标准护理疗法为选自由Per1stat?和/或化学改性的四环素-3(CMT-3)组成的组的治疗剂。在一些实施方案中，标准护理疗法包含受试者感染区域的口冲洗法和/或刮牙术以及牙龈上及/或牙龈下清创术(例如移除微生物牙菌斑及牙垢)。在一些实施方案中，标准护理包含在施用骨硬化蛋白抑制剂之前进行口冲洗法和/或刮牙术以及感染区域清创术与Per1stat和/或CMT-3的组合。在一些实施方案中,所述方法包括施用标准护理疗法并行施用骨硬化蛋白抑制剂。在其它实施方案中，标准护理疗法相继施用。例如，标准护理疗法可在施用给受试者骨硬化蛋白抑制剂之前I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周或更长时间来施用。在优选实施方案中，在施用骨硬化蛋白抑制剂之前，受试者的牙周病进展减缓、停止或逆转。
[0131]在一些或任何实施方案中，本文所述的方法或用途进一步包含施用抗生素，如选自由以下组成的组的抗生素:阿莫西林、盐酸四环素、多西环素、米诺霉素、阿奇霉素、罗红霉素、莫西沙星、环丙沙星以及甲硝哒唑。在一些实施方案中，所述方法或用途包含在施用给受试者骨硬化蛋白抑制剂之前施用给受试者抗生素。在其它实施方案中，所述方法或用途包含与施用骨硬化蛋白抑制剂并行施用给受试者抗生素。
[0132]在一些实施方案中，施用骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)以及适用于治疗骨骼矿物密度减小或骨骼缺陷的第二骨骼增强治疗剂。在一些实施方案中，骨骼增强治疗剂选自由以下组成的组:抗再吸收药物、成骨剂、雌激素受体调节剂(包括但不限于雷诺昔芬、巴多昔芬以及拉索昔芬)以及对破骨细胞具有抑制作用的药物。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂选自由以下组成的组:双膦酸盐(包括但不限于阿仑膦酸钠(FOSAMAX?)、利塞膦酸盐、伊班膦酸钠(B0NIVA?)以及唑来膦酸
(RECLAST?));雌激素或雌激素类似物；抗RANK配体(RANKL)抗体(例如PR0LIA?)或RANKL抑制剂；维生素D或维生素D衍生物或其模拟物；钙来源、替勃龙、降钙素、骨化三醇；以及激素代替疗法。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂包括但不限于副甲状腺素(PTH)或其肽片段、PTH相关蛋白质(PTHrp)、骨骼形态发生蛋白、成骨素、NaF 16&激动剂、士他汀、雷奈酸锶、抗DKKl抗体或抑制剂。在一些实施方案中，第二骨骼增强剂为Forteo?(特立帕肽)、Preotact?或 Protelos?。
[0133]在不同实施方案中，牙周病治疗计划包括在骨硬化蛋白抑制剂积极治疗之后进行定期支持性跟踪疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法或用途任选地包含进行选自由机械清创术、口腔卫生增强(例如定期专业清洁(即每6个月)、日常刷洗以及清牙垢)以及施用抗生素组成的组 的支援性跟踪疗法。
[0134]在一些实施方案中，采用本文所述的骨硬化蛋白抑制剂的组合疗法可在施用另外的一种或多种治疗剂(例如抗生素或第二骨骼增强剂)之前或之后，间隔范围为数分钟至数周。例如，分开的模态在彼此的约24小时内、例如在彼此的约6-12小时内或在彼此的约1-2小时内或在彼此的约10-30分钟内施用。在一些情况下，可能希望显著延长治疗期，其中不同模态的各自施用之间间流逝数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。尤其涵盖组合疗法的一种或两种药剂/疗法的重复治疗。
[0135]维持治疗方案
[0136]还涵盖在维持方案中使用第二骨骼增强剂和/或骨硬化蛋白抑制剂以例如预防或减缓牙槽骨的一或多个以下参数的损失:骨骼矿物密度、牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨体积以及牙槽骨矿物含量。在此方面，本文所述的方法或用途任选地包含施用有效维持骨骼矿物密度、牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨体积以及牙槽骨矿物含量的一或多个量的第二骨骼增强剂，维持期为骨硬化蛋白抗体治疗期结束后约I周至约5年。例如，在一些实施方案中，本文所述的方法或用途包含施用给受试者第二骨骼增强剂持续的维持期为约至少约I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、25周、26周、27周、28周、7个月、29周、30周、31周或更长时间(例如8个月、9个月、10个月、11个月、I年、15个月、18个月、2年、3年、4年、5年或更长时间(例如受试者一生)。在一些实施方案中，维持期为约6-12周。在一些实施方案中，维持期为约4-12周或约1-3个月。在一些实施方案中，维持期为约12-20周或约3-5个月。在一些实施方案中，维持期为约20-32周或约5-8个月。在一些实施方案中，维持期为约24-36周或约6-9个月。在一些实施方案中，维持期为约I年、约2年、约3年、约4年、约5年或更长时间。“维持”牙槽骨包括维持接受骨硬化蛋白抑制剂治疗的受试者所经受的类似水平的牙槽骨参数。
[0137]类似地，本文所述的方法或用途任选地包含随后施用对骨骼矿物密度、牙槽骨高度、牙槽骨质量、牙槽骨体积以及牙槽骨矿物含量有效的一或多个量的骨硬化蛋白抑制剂，维持期为治疗期结束后至少约至少约I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、I年、2年、3年、4年、5年或更长时间(例如受试者一生)。在一些实施方案中，维持期为约6-12周。在一些实施方案中，维持期为约4-12周或约1-3个月。在一些实施方案中，维持期为约12-20周或约3-5个月。在一些实施方案中，维持期为约20-32周或约5-8个月。在一些实施方案中，维持期为约24-36周或约6-9个月。在一些实施方案中，维持期为约I年、约2年、约3年、约4年、约5年或更长时间。
[0138]试剂盒[0139]包含骨硬化蛋白抑制剂(例如抗骨硬化蛋白抗体或抗体片段)的医药组合物可连同提供关于使用此类医药组合物的说明书的包装材料一起置放在容器(例如小瓶或注射器)内。一般来说，此类说明书将包括有形表达，所述表达描述骨硬化蛋白抑制剂浓度，以及在某些实施方案内，描述可能为复原医药组合物所必需的赋形剂成分或稀释剂(例如水、生理盐水或PBS)的相对量。
[0140]本发明在下列实施例中进一步描述。以下实施例仅用于说明本发明，且无论如何不旨在限制本发明的范围。
实施例[0141]实施例1
[0142]本实施例描述适用于表征抗骨硬化蛋白抗体的中和活性的不同的基于细胞的中和测定。
[0143]基于MC3T3细胞 的矿化测定-使用抗坏血酸和B-甘油磷酸盐诱发MC3T3-E1-BF细胞分化，从而导致矿物沉积。一种示例性筛选方案在96孔格式中包括在第I天接种细胞，接着在12天时间内，更换7次培养基，大多数矿物沉积在最后18小时内发生。矿物沉积的具体时间和程度可以部分地取决于所使用的特定血清批号而变化。如细胞培养实验领域中一般所熟知，对照实验将允许虑及所述变量。对于统计分析(使用MS Excel和JMP)，可依次使用单向ANOVA和杜氏比较(Dunnett’ s comparison)来确定组之间的差异。当P值小于
0.05(P〈0.05)时，数据集的组平均值被视为显著不同。
[0144]用于MC3T3-E1-BF细胞扩增的细胞培养如下进行。细胞培养在37°C和5 % CO2下进行。出于筛选骨硬化蛋白中和抗体的目的，可产生细胞库。通过在37°C水浴中搅动，解冻一小瓶冷冻的MC3T3-E1-BF细胞。将解冻的细胞投入50ml试管中的1ml扩增培养基(a-MEM/10% FBS/PenStr印Glu)中，且平缓地离心5分钟。随后使细胞再悬浮于4ml a -MEM/10% FBS/PenStr印Glu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，将IxlO6个细胞接种于在一个T175烧瓶中的50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培养基中。
[0145]当此继代融合(约7天)时，用胰蛋白酶作0了4(0.05%胰蛋白酶；0.531111^0丁八)使细胞进行胰蛋白酶处理，平缓地离心5分钟，并且随后再悬浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，接种细胞，每一个T175烧瓶将IxlO6个细胞接种于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培养基中。用于接种的T175烧瓶的数目此时取决于可利用的总细胞数目和将用于下一继代所要的烧瓶数目。
[0146]当此继代融合(约3-4天)时，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使细胞进行胰蛋白酶处理，平缓地离心5分钟，并且随后再悬浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，接种细胞，每一个T175烧瓶将IxlO6个细胞接种于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培养基中。用于接种的T175烧瓶的数目此时取决于可利用的总细胞数目和将用于下一继代所要的烧瓶数目。
[0147]当此继代融合(约3-4天)时，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使细胞进行胰蛋白酶处理，平缓地离心5分钟，并且随后再悬浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，接种细胞，每一个T175烧瓶将IxlO6个细胞接种于50ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu培养基中。用于接种的T175烧瓶的数目此时取决于可利用的总细胞数目和将用于下一继代所要的烧瓶数目。以1-2χ106个活细胞/ml在90% FBS/10% DMSO中冷冻额外的细胞。
[0148]当此继代融合(约3-4天)时，用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶；0.53mM EDTA)使细胞进行胰蛋白酶处理，平缓地离心5分钟，并且随后再悬浮于5ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，以1_2χ106个活细胞/ml在90% FBS/10% DMSO中冷冻细胞。此“最后继代”的冷冻细胞为用于筛选测定的继代。
[0149]用于矿化MC3T3-E1-BF细胞的细胞培养如下进行。细胞培养在37°C和5% CO2下进行。在矿化细胞培养物程序期间，需要将温度和CO2波动％最小化。通过在37°C水浴中搅动，解冻适当数目的如上所述制备的“最后继代”小瓶。将解冻的细胞投入50ml试管中的1ml扩增培养基(a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu)中，并且平缓地离心5分钟。随后使细胞再悬浮于4ml a -MEM/10% FBS/PenStrepGlu中。在使用台盼蓝和血球计确定细胞数目之后，在胶原蛋白I涂布的96孔板上，将每孔2500个细胞接种于200微升扩增培养基中(Becton Dickinson Labware,目录号 354407)。 [0150]示例性细胞培养程序如下。指示接种细胞起始日为星期三。如果使用所述周中的不同的一天作为用于接种细胞的起始日，则所述日将触发如下文指示的整个方法期间移除和添加培养基的日程。例如，如果在星期二接种细胞，则不应在第一个星期五和星期六，也不应在第二个星期五和星期六，移除和添加培养基。在星期二起始情况下，应在最后的星期日制备板用于钙测定。在星期三接种细胞，2500个细胞接种于200 μ I扩增培养基中。在星期四，移除所有扩增培养基且添加200 μ I分化培养基。在星期五，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在星期一，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在星期二，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在星期三，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在星期四，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在星期五，移除100 μ I培养基且添加100 μ I新鲜的分化培养基。在下一个星期一，如下制备板用于钙测定:用1mM Tris，HCl (ΡΗ7-8)洗涤板一次。在通风橱下作业，每孔添加200 μ 10.5Ν HCl。随后在-80°C下冷冻板。恰好在测量钙之前，冷冻-解冻板两次，并且随后使用多通道吸移管湿磨来分散板的内容物。随后在4°C下使板的内容物沉降30分钟，此时移除适量上清液以使用市售钙试剂盒测量钙。示例性且非限制性试剂盒为钙(CPC) Liquicolor,目录号 0150-250, Stanb1 Laboratory, Boerne, TX0
[0151]在此基于细胞的测定中，骨硬化蛋白抑制导致且包括矿物沉积的一系列事件中的一个或多个(即骨硬化蛋白抑制矿化)。因此，在特定细胞培养实验中包括骨硬化蛋白的实验中，在第一个星期四起始和此后的每个饲喂日，向培养基中添加重组骨硬化蛋白。在测试抗骨硬化蛋白抗体中和骨硬化蛋白的能力，即通过中和骨硬化蛋白抑制矿化的能力来允许矿化的情况下，在第一个星期四起始和此后的每个饲喂日，向培养基中添加抗体。在37°C下在分化培养基中与重组骨硬化蛋白一起预孵育抗体45-60分钟，且随后使用所述培养基饲喂细胞。
[0152]上述为针对MC3T3-E1-BF细胞的12天矿化方案。原始MC3T3-E1细胞的矿化受重组骨硬化蛋白抑制，并且使用抗骨硬化蛋白中和抗体，例如包含SEQ ID NO:245-247和78-80的CDR的抗骨硬化蛋白抗体封闭这种抑制。基于细胞的中和测定进一步描述于美国专利公布号7，592，429的例如实施例8处(特此其基于细胞的中和测定的描述以引用的方式并入)。
[0153]骨骼特异性碱性磷酸酶酸测定-示例性骨骼特异性碱性磷酶酸测定描述于国际专利公布号WO 2008/115732和美国专利号7，744，874 (特此其基于细胞的中和测定的描述以引用的方式并入)。示例性方案如下。在96孔组织培养板的补充有5%胎牛血清的MEM培养基中按3000-5000个细胞/孔接种C2C12细胞(ATCC，CRL1772)。在371:下在5%0)2中孵育板隔夜。在0.5X Wnt3a调节培养基(如WO 2008/115732中所述制备)中稀释抗体至不同的最终浓度。自接种的细胞移除培养基，且添加预混合的抗体-BMP4-骨硬化蛋白溶液(人或猕猴)(150 μ I)，得到30 μ g/ml至0.5 μ g/ml的抗体最终浓度，25ng/ml的最终BMP-4浓度，1.0 μ g/ml的最终骨硬化蛋白蛋白质浓度，且调节培养基为0.5X浓度。随后在37°C下在5% CO2中孵育板72小时。自细胞移除培养基，用PBS洗涤一次，且在-80°C与37°C之间交替冷冻和解冻三次。通过添加碱性磷酸酶底物(1-步PNPP，Pierce#37621) (150 μ I/孔)测量碱性磷酸酶活性。在室温下孵育细胞板60分钟，此时在405nm下测量光密度(OD)以确定碱性磷酸酶活性。可以使用例如具S型4参数拟合方程的SigmaPlot Regress1nWizard进行IC5tl计算。 [0154]BMP2诱发的MC3T3细胞矿化测定-MC3T3细胞中的示例性BMP2诱发的矿化测定描述于国际专利公布号WO 2009/047356(特此其基于细胞的中和测定的描述以引用的方式并入)。简单地说，将MC3T31b细胞接种于96孔板的100 μ I测定培养基(无G418的维持培养基)中(例如6χ103个细胞/孔或2χ103个细胞/孔)并孵育三天达到融合。改变测定培养基,且添加欲测试的化合物与1mM b-甘油磷酸盐和50 μ M抗坏血酸。在添加至细胞中之前，在室温下在独立板上预孵育骨硬化蛋白和候选抗体两小时。在施加骨硬化蛋白-抗体混合物之前，向测定96孔板中施加2.1或2.8nM BMP-2 (R&D Systems,目录号355-BM-010)。孵育细胞14天。在孵育结束时，用200 μ I PBS/孔洗涤细胞两次，向各孔中添加50 μ 10.5ΜHC1，且在_20°C下冷冻板至少24小时。在室温下解冻板2小时以供测试。将十10 μ I各孔转移至新板中，且暴露于钙工作溶液(1:5) (200 μ I)。在5-30分钟孵育期之后，在微板读取器上在595nm下测量光密度。根据标准曲线将吸光度转换成钙的微克数，从而测定BMP-2诱发的矿化的程度。
[0155]基于细胞的wnt信号传导测定-采用上顶边(super top flash ；STF)报告蛋白的示例性基于细胞的信号传导测定描述于国际专利公布号WO 2009/047356中。用以下对 HEK293 细胞进行转染:对于对照孔，pcDNA3+(480ng) ；SuperTopFlash(STF) (20ng)；以及 phRL-CMV (0.5ng)，并且对于 Wntl 处理孔，pcDNA-wntl (20ng) ；pcDNA3+(460ng)；
SuperTopFlash (STF) (20ng)；以及 phRL-CMV (0.5ng)。将质粒与稀释于 50 μ I OptiMEM?
中的1.6μ I Lipof ectamine2000混合,且在施加至细胞之前在室温下孵育30分钟。一旦施加，在37°C下在5% CO2中孵育细胞5小时。
[0156]将抗体与SOST —起预混合以生成一系列稀释液。各稀释液制备Iml培养基，并且在移除转染混合物后，向各孔中添加450 μ I。细胞与抗体-SOST混合物一起孵育18-20小时。孵育结束时，移除培养基，且向溶解细胞中添加300μ IlX被动溶解缓冲液(Promega，目录号E194A)。随后使用Dual-Glo荧光素酶系统(Promega，目录号E2940)和30 μ I溶解产物一式两份测量荧光素酶活性。典型地，使用30 μ I Dual-Glo荧光素酶(荧火虫荧光素酶；对于STF)和30 μ I Dual-Glo Stop与Glo (海肾荧光素酶；对于转染效率对照)底物。用Mithras LB940仪器(Berthold Technologies)测量发光信号。计算荧火虫与海肾荧光素酶的比率。通过将无SOST的Wntl值设定为I来表示最终结果。测定的另外的细节提供于国际专利公布号WO 2009/047356中。
[0157]实施例2—
[0158]以下实施例说明骨硬化蛋白抑制剂，即抗骨硬化蛋白单克隆抗体(Scl-Ab)在大鼠牙周病模型中增强牙槽骨修复的能力。
[0159]大鼠牙周炎模型:通过如先前所述的结扎置放，在大鼠中诱发实验牙周病(Jin Q 等人，2007.J Per1dontol78:1300-1308 ;Graves, DT 等 A, 2008.J ClinPer1dontol35:89-105 ;其公开内容以引用的方式全部并入本文中)。简单地说，用氯胺酮和噻榛(83/17比率)使雄性Sprague Dawley大鼠(体重约300_350g, HarlanLaboratory, I N)麻醉。随后环绕位于小颚的一侧的磨牙的颈部分(恰在牙銀上方)固定棉缝合线(3.0)以允许进行正常咀嚼。每周评估结扎三次，自顶端平缓地移入牙龈缝中以确保龈下位置，且必要时更换。
[0160]微电脑断层(μ CT)扫描和分析:在指定时间点，处死大鼠。解剖小颚且置放于10%中性缓冲福尔马林中48-72小时。在70%乙醇中通过锥形射束微CT系统(GEHealthcare B1Sciences)扫描固定的未去矿化大鼠小颚。线性且测定体积的分析是基于先前开发的方法(Park CH等人，2007.J Per1dontol78:273-281)。简单地说，扫描各上颌试样，且使用4(^系统在18\18\18-4 111三维像素下重建。使用三维(3-D)体积观测器和分析软件(Microview Analysis, GE Healthcare)作为3-D与2-D可视化和定量的工具。通过测量上颌第二磨牙的自牙骨质-牙轴质接面(CEJ)至牙槽骨嵴(ABC)的距离鉴别垂直的线性骨质流失。就体积分析而论，使用第一磨牙的最近中根(m-Ml)、第三磨牙的最远中根(d-M3)、分叉的顶盖、M1-M3的根尖作为评估上颌牙槽骨的可重现的标志。在前视图(coronal view)上以规则间距(平均值，8个数据切片)绘制二维感兴趣区域(ROI)且重建为3-D结构以定量体积参数、骨骼体积分数(BVF)以及骨骼矿物密度(BMD ；mg/cc)。
[0161]统计分析:使用GraphPad Prism (V.5.01)进行统计分析。通过单向方差分析(ANOVA)与Tukey多重比较事后检验在统计上评估线性且测定体积的骨骼测量的组之间的差异。数据以平均值+SE报告，且显著性水平设定为P < 0.05。
[0162]研究设计:使10至12周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠经受通过如上所述的结扎置放而诱发的实验牙周炎。在一个研究模式中，在结扎置放前三天，用生理盐水媒介物或Scl-Ab (剂量水平为25mg/kg)皮下注射动物(n = 10只/组)一次。在结扎置放之后立即用生理盐水媒介物或Scl-Ab处理结扎的动物或其正常完整对照。通过每周皮下注射两次给予Scl-Ab (剂量水平为25mg/kg)和其媒介物对照。分别在疾病诱发后两周和四周进行验尸。
[0163]在另一研究模式中，结扎诱发的实验牙周炎四周后，移除结扎后立即开始处理。用生理盐水媒介物或Scl-Ab (剂量水平为25mg/kg)每周皮下注射患实验牙周炎的动物(η =10只/组)或其正常完整对照两次。处理在疾病诱发停止后持续三周或六周，总研究持续时间为7周或10周。在Scl-Ab施用之前每周进行体重测量直至研究结束为止。分别在疾病诱发后七周和十周进行验尸。收集全血(用于血清测定)、小颚以及股骨。研究由密歇根大学(UniversityofMichigan)的机构动物护理与使用委员会(Institut1nAnimal Careand Use Committee)批准。
[0164]结果:
[0165]上颌牙槽骨:图2和图3中阐述支持牙槽骨体积和密度的微CT测量。在整个研究过程(两周和四周)中置放结扎的研究模式中，与处理开始后两周和四周接受媒介物注射液的正常完整动物相比，正常完整动物组中的全身性Scl-Ab施用在骨骼体积分数(BVF)与骨骼矿物密度(BMD)方面均产生统计上显著增加。此外，接受全身性Scl-Ab注射液的结扎诱发的牙周病组显示BVF和BMD (虽然统计上不显著)值与两周和四周时间点接受媒介物注射液的疾病组相比增加(图2A和图2B)。
[0166]在置放后四周和处理开始前立即移除结扎的研究模式中，与正常完整动物组相t匕，实验牙周炎组中在疾病诱发期期间BVF和BMD显示在统计上显著减小。在疾病诱发停止后三周内，媒介物处理组中BVF和BMD反弹并且随后稳定直至研究结束为止。与接受媒介物注射液的动物组相比，实验牙周炎诱发后接受Scl-Ab处理的结扎动物在六周处理阶段始终展示改善的骨骼修复(即骨骼体积和密度值更高)。最重要的是，在处理六周后，BVF和BMD在用Scl-Ab处理的动物中比在媒介物 处理的动物组中在统计上更高。此外，在10周研究结束时，骨骼体积分数和骨骼密度在Scl-Ab处理的疾病动物与媒介物处理的正常完整动物之间未发现统计性差异，表明Scl-Ab可有助于在牙周病后使牙槽骨再生至健康正常水平。
[0167]线性骨骼测量:牙槽骨高度是用微CT评估自第二磨牙的骨骼嵴至牙骨质-牙轴质接面测量(图4)。在置放后四周和处理开始前立即移除结扎的研究模式中，scl-Ab施用显示对线性骨骼修复(即增加牙槽骨高度)有一定作用。处理三周后，在结扎的第二磨牙部位，在Scl-Ab处理与媒介物组之间未观察到线性骨骼测量统计显着性。然而，在处理后六周时间点时，Scl-Ab处理显示线性骨骼修复增加，其中在结扎的第二磨牙部位处在媒介物和Scl-Ab处理组与媒介物组之间统计上显著差异明显(图4A至图4C)。
[0168]实验牙周炎诱发后六周全身性施用Scl-Ab与媒介物处理相比产生统计上更高的BVF和BMD值，以及与正常完整组相比统计上类似的骨骼测量。因此，如由BVF和BMD所测量，全身性Scl-Ab施用促使牙槽骨再生。Scl-Ab可有希望成为增强和/或加速口骨再生的治疗剂。
[0169]虽然本发明已在着重强调优选实施方案的情况下予以描述，但是显然所属领域的技术人员可使用优选化合物和方法的变化形式，并且预期本发明可以与本文具体描述的方式不同的方式来实践。因此，本发明包括如下文权利要求书所限定的本发明精神和范围内内所涵盖的所有修改。
【权利要求】
1.一种治疗受试者牙槽骨流失的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离的量的抗骨硬化蛋白抗体，剂量为每周约5mg至约1，OOOmg0
2.如权利要求1所述的方法，其中截至治疗开始后六周，所述牙骨质-牙轴质接面与所述牙槽骨嵴之间的距离与治疗前距离相比减小了至少10 %。
3.如权利要求1所述的方法，其中截至治疗开始后六周，牙槽骨高度与治疗前牙槽骨高度相比增加了至少10%。
4.如权利要求1所述的方法，其中截至治疗开始后六周，所述受试者的牙槽骨高度与治疗前牙槽骨高度相比增加了至少1mm。
5.如权利要求1所述的方法，其中截至治疗开始后六周，所述受试者的牙槽骨密度与治疗前牙槽骨密度相比增加了至少10%。
6.如权利要求1所述的方法，其中截至治疗开始后六周，牙槽骨体积分数与治疗前骨骼体积分数相比增加了至少10%。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体的施用量为约120-270mg。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体每周施用两次。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体局部地施用至所述受试者的患病牙銀区或患病牙周袋。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括在施用所述抗骨硬化蛋白抗体之前，施用选自由Per1stat?或化学改性的四环素-3 (CMT-3)组成的组的护理标准护理治疗剂。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其进一步包括施用选自由副甲状腺素、特立帕肽(teriparatide)、双膦酸盐、RANKL抗体以及DKK-1抗体组成的组的第二骨骼增强治疗剂。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述第二骨骼增强治疗剂是在使用所述抗骨硬化蛋白抗体的治疗期结束之后施用。
13.如权利要求1所述的方法，其任选地包括施用足以维持牙槽骨的量的所述抗骨硬化蛋白抗体持续第二段时间。
14.如权利要I至13中任一项所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体为包含重链和轻链的免疫球蛋白。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体为对SEQIDNO:1的骨硬化蛋白显示小于或等于1x10_9M的结合亲和力的抗体或其片段。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中当与每孔的骨硬化蛋白摩尔数相比，每孔存在少于六倍过量的摩尔数的骨硬化蛋白结合位点时，在基于MC3T3细胞的矿化分析中，所述抗骨硬化蛋白抗体中和人骨硬化蛋白。
17.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭以下抗体中至少一者与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab_l、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab_8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab_13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab_17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23以及Ab_24，和/或被以下抗体中至少一者交叉封闭与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5, Ab-6,Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
18.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗骨硬化蛋白抗体包含SEQID NO:245 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQ ID NO:78 的CDR-Ll、SEQ ID NO: 79 的 CDR-L2,以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
19.如权利要求18所述的方法，其中抗骨硬化蛋白抗体包含含有SEQID NO:378的重链以及含有SEQ ID N0376的轻链。
20.一种包含抗骨硬化蛋白抗体的牙齿植入物，所述抗骨硬化蛋白抗体结合至包含SEQ ID NO:1中所阐明的氨基酸序列的骨硬化蛋肽多，其中所述抗骨硬化蛋白抗体对SEQ IDNO:1的骨硬化蛋白显示小于或等于1x10_9M的结 合亲和力。
21.一种包含抗骨硬化蛋白抗体的凝胶或基质，所述抗骨硬化蛋白抗体结合至包含SEQ ID NO:1中所阐明的氨基酸序列的骨硬化蛋肽多，其中所述抗骨硬化蛋白抗体对SEQ IDNO:1的骨硬化蛋白显示小于或等于1x10_9M的结合亲和力。
22.一种抗骨硬化蛋白抗体，其用于在治疗受试者牙槽骨流失的方法中使用，所述方法包括施用有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离的量的抗骨硬化蛋白抗体，剂量任选地为每周约5mg至约l，000mg。
23.根据权利要求22所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述治疗牙槽骨流失的方法进一步包括施用选自由副甲状腺素、特立帕肽、双膦酸盐、RANKL抗体及DKK-1抗体组成的组的第二骨骼增强治疗剂。
24.根据权利要求23所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述第二骨骼增强治疗剂是在使用所述抗骨硬化蛋白抗体的治疗期结束之后施用。
25.根据权利要求22所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述治疗牙槽骨流失的方法任选地进一步包括施用足以维持牙槽骨的量的所述抗骨硬化蛋白抗体持续第二段时间。
26.如权利要求22至25中任一项所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述抗骨硬化蛋白抗体为包含重链和轻链的免疫球蛋白。
27.如权利要求22至26中任一项所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述抗骨硬化蛋白抗体为对SEQ ID NO:1的骨硬化蛋白显示小于或等于1χ10-9Μ的结合亲和力的抗体或其片段。
28.如权利要求22至27中任一项所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中当与每孔的骨硬化蛋白摩尔数相比，每孔存在少于六倍过量的摩尔数的骨硬化蛋白结合位点时，在基于MC3T3细胞的矿化分析中，所述抗骨硬化蛋白抗体中和人骨硬化蛋白。
29.如权利要求22至28中任一项所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述抗骨硬化蛋白抗体交叉封闭以下抗体中至少一者与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B、Ab-C、Ab-D、Ab-l、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab-9、Ab-10、Ab-ll、Ab-12、Ab-13、Ab-14、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Ab-18、Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24，和 / 或被以下抗体中至少一者交叉封闭与骨硬化蛋白的结合:Ab-A、Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1、Ab_2、Ab_3、Ab_4、Ab-5,Ab-6、Ab-7、Ab-8、Ab_9、Ab_10、Ab_ll、Ab_12、Ab_13、Ab_14、Ab_15、Ab_16、Ab-17, Ab-18,Ab-19、Ab-20、Ab-21、Ab-22、Ab-23 以及 Ab_24。
30.如权利要求22至29中任一项所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中所述抗骨硬化蛋白抗体包含 SEQ ID NO:245 的 CDR-Hl、SEQ ID NO:246 的 CDR-H2、SEQ ID NO:247 的 CDR-H3、SEQID NO:78 的 CDR-Ll、SEQ ID NO:79 的 CDR-L2,以及 SEQ ID NO:80 的 CDR-L3。
31.如权利要求30所述的抗骨硬化蛋白抗体，其中抗骨硬化蛋白抗体包含含有SEQIDNO:378的重链及含有SEQ ID N0376的轻链。
32.一种抗骨硬化蛋白抗体的用途，其用于制备供治疗受试者牙槽骨流失的药剂，其用量有效减小牙骨质-牙轴质接面与牙槽骨嵴之间的距离，其中所述抗骨硬化蛋白抗体的剂量任选地为每周约5mg至约1，OOOmg0
【文档编号】C07K16/22GK104039828SQ201280064888
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】柯华珠, 刘敏, W·V·格兰诺拜尔 申请人:安进公司, 密执安州立大学董事会