噬菌体的p3作为淀粉样蛋白结合剂的用途

噬菌体的p3作为淀粉样蛋白结合剂的用途
【专利摘要】本发明涉及用于减少淀粉样蛋白形成和/或用于促进淀粉样蛋白解聚的试剂和药物组合物。所述组合物也可以用于检测淀粉样蛋白。
【专利说明】噬菌体的P3作为淀粉样蛋白结合剂的用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物组合物，其包含丝状噬菌体g3p蛋白、g3p的淀粉样蛋白结合片段 以及g3p的结合淀粉样蛋白的突变体和变体，并涉及这样的组合物作为治疗剂用于降低与 疾病有关的淀粉样蛋白负载的用途，所述疾病为诸如全身性和周围性淀粉样蛋白疾病、神 经变性疾病包括神经变性Tau病变和传播性海绵状脑病（朊病毒相关的疾病）。也包括那 些组合物用于预防与这些疾病有关的淀粉样蛋白负载的积累的用途，以及那些组合物作为 诊断剂用于检测淀粉样蛋白和从而诊断这样的疾病的用途。

【背景技术】
[0002] 丝状噬菌体Μ13和有关的丝状噬菌体已经表现出在蛋白错误折叠疾病的动物 模型中的效用，并因此代表蛋白错误折叠疾病的潜在治疗剂类别。参见美国专利公开US 2011/0142803,通过引用整体并入本文。具体地，已经发现，丝状噬菌体具有介导已经在脑 中形成的淀粉样蛋白的清除的能力。参见，例如，W02006083795和W02010060073,通过引用 整体并入本文。
[0003] 形成淀粉样蛋白的疾病的特征在于神经元变性和错误折叠的、聚集的蛋白在脑中 的存在。这些错误折叠的和聚集的蛋白在不同的疾病中存在差异，但是在大多数情况下，它 们具有结合刚果红染料并显示苹果绿双折射的交叉-β_折叠片结构。预期淀粉样蛋白的 除去会减轻多种以淀粉样蛋白为特征的疾病、减慢所述疾病的进展、或甚至逆转与所述疾 病有关的征状。
[0004] 用于预防和/或逆转与形成淀粉样蛋白的疾病有关的病理学和/或征状的潜在治 疗方案包括，例如，抑制淀粉样蛋白形成、促进淀粉样蛋白清除和抑制淀粉样蛋白聚集。参 见，例如，Aguzzi&O-Connor，Nature Review Drug Discovery (2010)9:237-48。除去有毒寡 聚体和/或阻止有毒寡聚体的形成，在形成淀粉样蛋白的疾病的治疗和预防中也可能是有 益的。出处同上。
[0005] 已知与错误折叠的和/或聚集的蛋白有关的神经变性疾病包括：阿尔茨海默氏 病、帕金森病、朊病毒病、神经变性Tau病变、肌萎缩性侧索硬化（ALS)、脊髓小脑性共济 失调（SCA1)、（SCA3)、（SCA6)、（SCA7)、亨廷顿病、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、脊 髓延髓肌肉萎缩症、遗传性脑淀粉样蛋白血管病、家族性淀粉样变性、额颞叶退化（FTLD) 包括额颞叶痴呆、英国/丹麦痴呆和家族性脑病。其它疾病涉及周围的错误折叠的和/ 或聚集的蛋白一所以被称作周围性淀粉样变性。参见，例如，Chiti&Dobson, Annu Rev Biochem (2006) 75:333-66 ;和 Jos印hs 等人，Acta Neuropathol (2011) 122:137-153。对于 预防和/或减少淀粉样蛋白聚集体形成（即，错误折叠的和/或聚集的蛋白）以治疗这些 疾病或减轻这些疾病的征状或严重程度，存在巨大需求。
[0006] 近年来，国立老龄研究所（National Institute on Aging)和阿尔茨海默氏病协 会（Alzheimer' s Association)公布了诊断"所有原因"痴呆和阿尔茨海默氏病痴呆的标 准。参见，McKhann 等人，Alzheimer' s&Dementia, (2011) 7 (3): 263-9。基于该指导，当行 为或认知征状满足5个试验时，诊断为"所有原因"痴呆,所述试验包括，例如，干扰在工作 时或在惯常活动时起作用的能力，和从以前的功能和执行水平的下降。所述试验包括病史 采集和客观认知评估的组合。如本文中所述的，丝状噬菌体g3p蛋白、g3p的淀粉样蛋白结 合片段和g3p的结合淀粉样蛋白的突变体和变体会结合淀粉样蛋白的发现，提供了用于诊 断任何疾病或由淀粉样蛋白形成引起的痴呆（包括"所有原因"痴呆和阿尔茨海默氏病痴 呆）的补充方法。
[0007] 丝状噬菌体是一组结构上相关的病毒，其感染细菌细胞且含有环形单链DNA基 因组。它们在生产性感染过程中不会杀死它们的宿主。Rasched和Oberer, Microbiol Rev (1986) 50:401-427。丝状噬菌体的例子包括Ff家族的噬菌体（例如，M13、Π 和fd)。自1978年以来，已经知道fd的核苷酸序列。Beck等人，Nucleic Acids Research(1978)5(12):4495_4503。在 1980 年公布了 M13 的完整序列。van Wezenbeek 等 人，Gene (1980) 11:129-148。在 1982 年之前对噬菌体 Π 进行了测序。Hill 和 Petersen, J. Virol. (1982)44(1) : 32-46。Π 基因组包含6407个核苷酸，其比噬菌体fd小。它与fd序列 相差186个核苷酸（包括1个核苷酸缺失），从而导致噬菌体Π 和fd的蛋白之间的12个 氨基酸差异。Π 序列与M13序列相差52个核苷酸，从而导致对应的蛋白之间的5个氨基酸 差异。出处同上。M13和fd的DNA序列相差192个（3%)核苷酸，但是这些差异中的仅12 个导致对应的氨基酸序列的变化（6. 25% )。van Wezenbeek等人，Gene (1980) 11:129-148。
[0008] 丝状噬菌体的结构是非常确定的，且综述在，例如，Marvin, Curr. Opin. in Struct.Biol. (1998)8:150-158 ;Rasched 和 Oberer,Microbiological Reviews (1986)50(4) :401-427。丝状噬菌体具有"外壳"，其包含由基因8编码的主要衣壳蛋白 (g8p、p8或pVIII)的数千个拷贝。装配的g8p-DNA复合物形成噬菌体的特征性丝状形状。 次要外壳蛋白（即，仅以几个（3-5个）拷贝存在的那些）位于丝的末端处。这些尖蛋白之 一 g3p (也被称作p3或pill)是细菌宿主结合和开始感染所必需的。
[0009] M13噬菌体具有406个氨基酸的成熟g3p。GenBank Ref Seq ΝΡ_510891· 1提供了 一种参照序列，其包括18残基氨基端信号序列。与公开的序列相比具有氨基酸差异的变体 是常见的。I-家族的丝状噬菌体具有与Ff家族成员不同的g3p，但是即使在家族g3p之间 仍然是高度保守的。Stassen 等人，JMol Evol(1992)34:141_52。
[0010] 可得到 g3p 的晶体结构。Lubkowski 等人，Structure (1998) 7 (6) 711-722。该蛋 白包含3个被柔性的富含甘氨酸的接头序列隔开的折叠结构域。2个氨基端结构域N1和 N2 (包含262个氨基酸）相互作用以形成N1-N2复合物。羧基端（CT，也称为N3)结构域 是146个氨基酸，它通过与g8p的疏水相互作用而起将g3p锚定在噬菌体颗粒中的作用。 Marvin, Current Opin. in Structural Biology(1998)8:150_158。在图 1 中呈现了可公开 得到的、使用 Hoiliger，J Mol. Biol. (1999)288(4) :649-57 的 N1-N2 结构域融合蛋白 2g3p 制备的带结构。
[0011] 不同于大多数蛋白，g3p需要N1和N2结构域从潜在的"锁定"形式解折叠才能获 得它的天然生物活性。Eckert&Schmid，J. Mol. Biol. (2007)373:452-461。在感染的初始步 骤中，N2经由在N2的外边缘上的残基结合细菌性菌毛。Deng&Perham，2002。N2的该初始 结合会通过"打开" N1-N2复合物而"解锁" g3p，从而允许N1然后结合共受体TolA。在g3p 的N1-N2片段中，在其中N2展开的初始解锁步骤的热转变发生在48. 1°C的解链温度（TM)。 该过程的一部分涉及在Gln212-Pr〇213肽键处的异构化。Pr〇213转化在解锁状态是反式 的。在发生于TM60. 2°C的第二步之前，N1保持稳定折叠。综述见Eckert&Schmid，2007。
[0012] 已经使用N1-N2片段中的突变来研究不同突变体的稳定性和侵染性。 Eckert&Schmid，2007。一种变体（被命名为"3A"）会损害菌毛结合和降低N2结构域的稳 定性。由于该突变，T M下降至42. 6°C。3A携带下述突变：W181A、F190A和F194A。N2的另 一种突变体G153D会使N2失稳，从而使TM下降至44. 4°C。Q129H突变体会稳定化N2,从而 使TM增加至51. 4°C。Π 变体含有在铰链中的突变T101I和D209Y，并增加 N1-N2片段的稳 定性（11 = 56.5°〇。1册含有突变1'1011、0129!1和0209￥(1" = 60.1°〇。11册含有突变 T13I、T101I、Q129H 和 D209Y(TM = 61. 8°C )。Q129Y 和 T13I 突变都是起稳定作用的，添加 这些突变会进一步增加解链温度TM。噬菌体侵染性随着g3p内的结构域相互作用的强度而 相反地变化。Eckert&Schmid，2007。N2结构域的删除（噬菌体fd(AN2))会通过除去N2 结构域对TolA的N1结合的阻断作用而增加侵染性。出处同上。


【发明内容】

[0013] 本发明部分地基于下述发现：g3p也以类似于噬菌体感染细菌的过程的方式介导 丝状噬菌体与淀粉样蛋白的结合。美国专利号7, 867, 487假定，在该专利中报道的噬菌体 在解聚淀粉样蛋白中的治疗效果的根本机制是，噬菌体的长、薄结构可能使它沿着淀粉样 蛋白纤维构造。另外，有人提议，在g8p(主要外壳蛋白）中存在的高α螺旋含量可能干扰 淀粉样蛋白的β折叠结构。该机制与所述专利的以下报道相一致：纳摩尔量的噬菌体可以 解聚微摩尔量的β_淀粉样蛋白，这可以提示，噬菌体的高拷贝组分（即，g8p)在介导该效 应。它也与US20110182948中的以下报道相一致：烟草花叶病毒（其具有与丝状噬菌体类 似的结构）可以造成解聚。因而，该早期工作提示，完整结构（具有许多α螺旋的长丝） 对于治疗效果而言是重要的，或者，如果特定外壳蛋白是重要的，那么在噬菌体外壳上高度 呈现该蛋白，诸如g8p。该早期工作都没有提供噬菌体的分离组分（相对于完整噬菌体）可 以结合淀粉样蛋白和/或造成它的解聚的任何暗示。此外，从未存在丝状噬菌体的次要外 壳蛋白在它的结合和解聚淀粉样蛋白的能力中起作用的任何暗示。
[0014] 但是，本公开内容提供了替代性的（尽管不一定相互排斥的）作用机理的证据。发 明人已经发现，噬菌体g3p会直接地结合淀粉样蛋白纤维，并且噬菌体介导的解聚依赖于 该初始结合步骤。发明人的g3p负责丝状噬菌体介导的淀粉样蛋白结合的认识提供了噬菌 体治疗效果的机制，以及提供了新类型的治疗剂和诊断剂的基础。
[0015] 本发明的其它目的和优点将在下面的描述中部分地阐述，并且将从所述描述部分 地明白，或者可以通过本发明的实践来获知。借助于在所附权利要求中特别指出的要素和 组合，将会实现和达到本发明的目的和优点。
[0016] 应当理解，前述的一般描述和下述的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，并 且不限制要求保护的发明。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1呈现了 g3p的N1和N2结构域的带结构和铰链。
[0018] 图2A-2C呈现了得自不同来源的g3p的比对。图2A是得自噬菌体M13(SEQ ID N0:l)、Fd(SEQIDN0:2)和Fl(SEQIDN0:3)的g3p的比对，包括共有序列（SEQIDN0:4)。 Fig2B显示了得自噬菌体I2-2(SEQ ID N0:5)和Ike(SEQ ID N0:6)的g3p的比对，以及在 12-2和Ike之间的共有序列（SEQ ID NO: 7)。图2C呈现了得自噬菌体If的g3p的氨基酸 序列（SEQ ID N0:8)。
[0019] 图3A呈现了噬菌体结合的表面等离子体共振（SPR)研究。使用流过生物传感器 芯片的10 14噬菌体/mL，对比了与Αβ纤丝的结合和与Αβ单体的结合。图3B显示了从图 3Α所示的SPR数据计算出的K a、Kd和KD。
[0020] 图4A和4B呈现了结合研究。图4A显示了 2种噬菌体剂量（10n/mL和1012/mL) 的直接结合测定，其中逐渐增加 fAi3 42的摩尔量。图4B是结合竞争研究，并提供了用于确 定M13结合的KD的替代方式。使用了构建体1。
[0021] 图5显示了在淀粉样蛋白纤维结合竞争测定中使用热变性的（框-90°c保持10分 钟）相对于天然构象（圆圈）M13(构建体1)的结合竞争结果。
[0022] 图6显示了硫代黄素 T (ThT)荧光测定，其使用在有或没有2种浓度的M13噬菌体 (构建体1)存在下温育的?Αβ 42。
[0023] 图7Α和7Β显示了在ThT解聚测定中改变各个测定参数的作用。图7Α呈现了在有 2种盐浓度（0. 15M和1. 5M)存在下的解聚百分比。图7B呈现了在2种温度（4°C和37°C ) 下剩余的fAP的百分比。使用了构建体1。
[0024] 图8A和8B描绘了使用fAi342的M13-淀粉样蛋白结合测定。在图8A中，使用保 持3小时的18°C至58°C的温育温度，报告了 M13结合。图8B显示了在37°C相对于50°C的 温育的结合动力学。
[0025] 图9A-9C显示了 g3p的蛋白水解除去对噬菌体-淀粉样蛋白相互作用的影响。使 用蛋白酶Arg C从M13噬菌体切掉g3p (M13 Λ g3p)。图9A呈现了使用M13 Λ g3p噬菌体相 对于天然（与ArgC处理的噬菌体相同地处理，但是没有蛋白酶处理）噬菌体的Αβ结合竞 争研究的结果。图9Β显示了与天然噬菌体相比，Arg C处理对Μ13 Λ g3p噬菌体的侵染性 的影响。图9C在解聚测定中对比了 ArgC处理的噬菌体和天然噬菌体。
[0026] 图10A和10B呈现了使用g3p的N1-N2片段作为标记的M13与fA β 42的 结合的竞争剂的结合竞争测定的结果，所述Ν1-Ν2片段在本文中被称作重组可溶性 NlN2(rs-g3p(NlN2)构建体 3"）、M13Ag3p(Arg C 处理的）和 Μ13。图 10Β 显示了所述 竞争测定的重复。
[0027] 图11呈现了噬菌体fd、IIHY、AAA和M13的竞争数据。将噬菌体fd、AAA和IIHY 在50°C预活化1. 5小时，然后对比活化的和非活化的Fd、AAA和IIHY在37°C温育45分钟 中与标记的M13竞争结合Α β的能力。
[0028] 图 12Α 显示了 rs-g3p(NlN2)(构建体 3)的示意图。图 12Β 呈现了 rs-g3p(NlN2) 的离子交换特性。图12C显示了使用Sephacryl S-300和rs-g3p(NlN2)的凝胶过滤测定 的结果。图12D显示了 rs-g3p(NlN2)以及g3p和g8p对照的蛋白质印迹。M13噬菌体在泳 道1和2中泳动作为阳性对照，并用多克隆抗-M13抗体（其检测g8p和g3p)检测。纯化 的rs-g3p在泳道3和4中泳动，并用相同的多克隆抗-M13抗体检测。
[0029] 图 13 呈现了使用 rs-g3p(NlN2)(构建体 3)的 SPR 数据。rs-g3p(NlN2)以约 160nM 的KD有效地结合fA β 42,但是不会结合单体。
[0030] 图14呈现了用于测量在给定样品中存在的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。将10 μ Μ Αβ 42单体在有或没有5种浓度的rs-g3p(NlN2)(构建体3)存在下在37°C温育3天。通 过定量结合的ThT荧光，测量在3天结束时形成的纤维的量。IC 5(I是大约20nM，从而指示 rs-g3p(NlN2)有效地抑制Αβ42纤维的形成。该图也指示，结合是剂量依赖性的。
[0031] 图15Α显示了在有或没有rs-g3p(NlN2)(构建体3)存在下温育fA@42的透射电 子显微镜检查（TEM)结果。图15B显示了 ThT荧光测定的结果，其中使用在37°C温育7天 的 Α β 42 和 2 μ M rs-g3p (N1N2)(构建体 3)。rs-g3p (N1N2)会阻断 fA β 42 的形成。
[0032] 图16证实，rs_g3p (Ν1Ν2)(构建体3)有效地抑制α -突触核蛋白纤维的形成。通 过在37°C在300rpm搅拌4天，装配25μΜα-突触核蛋白（参见，条1)。该图上的条2描 绘了在37°C摇动3天的α-突触核蛋白单体+1χ1(Γ 13五聚体Μ13噬菌体。条2所示的结果 指示，五聚体Μ13会阻断α-突触核蛋白纤维的装配。该图上的条3描绘了 α-突触核蛋 白单体+83nM rsg3p单体。条3所示的结果指示，单体在抑制α-突触核蛋白纤维形成方 面的有效性低于五聚体Μ13。条4是显示在时间0的α突触核蛋白单体的阴性对照。在条 5中，显示了在没有α -突触核蛋白纤维的情况下的g3p单体，以确定g3p是否结合pTAA和 隔离染料从而免于结合纤维。条5所示的结果指示，g3p不会结合pTAA。
[0033] 图 17 呈现了 rs-g3p (N1N2)(构建体 3)、M13 (构建体 2)、rs-g3p (N1N2) -hIgG4-Fc 融合蛋白（构建体4)和IgG4-Fc阴性对照的竞争结合数据。
[0034] 图18呈现了对比M13(构建体2 ;正方形）、rs-g3p(NlN2)(构建体3 ;三角形）、 rs-g3p (N1N2) -hIgG4-Fc融合蛋白（构建体4 ;倒转三角形）和重组IgG4-Fc阴性对照（菱 形）的竞争结合数据。
[0035] 图19显示了对比5种浓度的Α β 42纤维加或减2种浓度的M13 (构建体2)、800nM rs-g3p (N1N2)(构建体3)和3种浓度的rs-g3p (N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白（构建体4)的 过滤器截留测定。
[0036] 图20呈现了 rs-g3p (N1N2)(构建体3 单体"）和抗生蛋白链菌素缀合的 rs-g3p(NlN2)( "SA[g3pNlN2]n = 2_4"；"SA-g3p"；"四聚体"）的竞争结合数据。对比了 rs-g3p(NlN2)和SA-g3p在37°C温育3小时过程中与标记的M13竞争结合Αβ的能力。
[0037] 图21显示了对比5种浓度的fA β 42加或减2种浓度的rs-g3p (Ν1Ν2)(构建体3 ; "单体"）和2种浓度的SA-g3p( "四聚体"）的过滤器截留测定。
[0038] 图22A和22B显示了在时间0 (图22A)和与SA-g3p -起温育3天后（图22B)的 --β 42 的 TEM。
[0039] 图23显示了一种rs-g3p (Ν1Ν2) -hIgG4-Fc构建体"构建体4"的氨基酸序列（SEQ ID N0:9)。从"构建体1"（SEQ ID N0:10)的N1N2区域衍生出"构建体4"的N1N2区域。
[0040] 图24显示了另一种rs-g3p(NlN2)-hIgG4-Fc构建体"构建体5"的氨基酸序列（SEQ ID N0:11)。从"构建体2"（SEQ ID N0:12)的N1N2区域衍生出"构建体5"的N1N2区域。
[0041] 图25显不了一种rs_g3p (N1N2)-hlgGl-Fc构建体"构建体6"的氨基酸序列（SEQ ID N0:13)。从"构建体2"的N1N2区域衍生出"构建体6"的N1N2区域。
[0042] 图 26 显示了得自 fd(SEQ ID N0:14)、fl(SEQ ID N0:15)、M13(SEQ ID N0:16)、 Ike (SEQ ID NO: 17)、12-2 (SEQ ID NO: 18)和 If 1 (SEQ ID NO: 19)的 N2 的氨基酸序列比对。 星号指示具有单个完全保守残基的位置。冒号"："指示在Gonnet PAM250矩阵中具有 大于0. 5的评分的、具有强类似性质的基团之间的保守。句点"指示在Gonnet PAM250 矩阵中具有等于或小于〇. 5的评分的、具有弱类似性质的基团之间的保守。
[0043] 图27A显示了构建体3的示意图。图27B显示了构建体3的g3p部分的DNA序列 (SEQ ID N0:23)。图27C显示了构建体3的g3p部分的氨基酸序列（SEQ ID N0:24)。
[0044] 图28显示了测试2种rs-g3p(NlN2)-IgG融合蛋白在阿尔茨海默氏病的转基因小 鼠模型中减少淀粉样蛋白β的能力的实验的结果。rs-g3p(NlN2)-hIgG4-Fc(构建体5)和 rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体6)都显著地降低阿尔茨海默氏病小鼠的海马中的淀粉样 蛋白β的水平。
[0045] 图29显示了测试2种rs-g3p(NlN2)-IgG融合蛋白在阿尔茨海默氏病的转基因小 鼠模型中减少淀粉样蛋白β的能力的实验的结果。rs-g3p(NlN2)-hIgG4-Fc(构建体5)和 rs-g3p (N1N2)-hlgGl-Fc (构建体6)都能够显著地降低阿尔茨海默氏病小鼠的大脑皮质中 的淀粉样蛋白β的水平。
[0046] 图 30 显示了 rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体 6)对 Αβ42 的装配抑制。图 30Α 显示了在没有SDS的情况下制备的"天然"琼脂糖凝胶。将样品在不含SDS的TEA缓冲液 中泳动，且不沸腾。结果指示，构建体6能够抑制fAi3 42的装配。图30B呈现了用于测量 存在于给定样品中的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。将10 μ Μ Αβ 42单体在有或没有2种浓 度的rs-g3p (Ν1Ν2) -hlgGl-Fc (构建体6)存在下在37°C温育1天。通过定量结合的ThT荧 光，测量在第1天结束时形成的纤维的量。rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体6)有效地抑制 Αβ 42纤维的形成。该图也指示，构建体6对纤维形成的抑制是剂量依赖性的。
[0047] 图31呈现了代表性的圆二色性数据，其表明Αβ42装配被rs_g3p(NlN2)(构建体 3)抑制。圆二色性会测量要评估的Α β纤维的α-螺旋和β-折叠含量。图31A显示了在 Τ = 0、Τ = 24小时和Τ = 48小时，Αβ 42的椭圆性与波长的关系。图31Β显示了在Τ = 0、Τ = 24小时和Τ = 48小时，Αβ 42+构建体3的椭圆性与波长的关系。图31C显示了代 表性的ThT测定，其中通过定量结合的ThT荧光，测量在24-48小时之间形成的纤维的量。 构建体3有效地抑制Αβ 42纤维的形成。图31D显示了在T = 0、T = 24小时和T = 48小 时，构建体3的椭圆性与波长的关系。这些数据一起证实了构建体3的抑制Α β 42装配的 能力。
[0048] 图32呈现了表明Μ13(构建体2)和rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体6)会阻 断寡聚体诱导的N2a细胞毒性的代表性数据。参见，例如，Stine等人（2003) J. Biol. Chem. 278(13) :11612-11622 和 Stine 等人（2011)Erik D. Roberson(编）Alzheimer，s Disease and Frontotemporal Dementia, Methods in Molecular Biology,第 670 卷：13-32。在处理之前，通过血清饥饿48小时，使N2a细胞分化。将Αβ 42寡聚体（2uM) 与构建体2和构建体6 -起在37°C预温育3小时，然后加给N2a细胞。时间0( "TO"）复 合物不进行预温育。温育24小时以后，监测腺苷酸激酶（"AK"）释放。向培养基中的AK 释放指示细胞死亡/裂解。如Stine等人，2011所述，制备Αβ42寡聚体。结果指示，M13 和rs-g3p (Ν1Ν2)-hlgGl-Fc是有毒寡聚体的有效抑制剂。
[0049] 图33显示的过滤器截留测定对比了 6种浓度的Αβ42纤维加或减lxl012/ml M13(构建体 2) ;80nm 和 800nM rs-g3p(NlN2)-hIgG4-Fc 构建体（构建体 5);和 80nm 和 800nM rs-g3p (N1N2) -hlgGl-Fc (构建体 6)。将 Α β 42 纤维与构建体 2、5 和 6 -起在 37°C 温育3天，然后进行过滤器截留。用mAb 6E10(1:15000)探测过滤器，所述mAb6E10识别被 捕集在过滤器上的Α β 42纤维。800nM构建体5或构建体6等于5xl014/ml分子摩尔浓度 的构建体2。结果指示，构建体2、5和6有效地解聚β-淀粉样蛋白纤维。
[0050] 图34Α和34Β呈现了用于测量与ftau-起预温育3小时以后与fA@42结合的 M13(构建体2)的量的代表性测定。在有或没有4种浓度的ftau存在下，将5μΜ的与 构建体2结合的Αβ 42单体在37°C温育3小时。由于fA0 :M13-Alexa488会沉淀，但是 ftau:M13_Alexa488不会沉淀，测量来自沉淀物的突光的损失指示，ftau竞争--β结合。 在这里，通过定量沉淀的结合竞争反应中的Alexa488荧光，测量在3小时结束时形成的 M13-fA0的量。结果指示，ftau能够与M13-Alexa488(构建体2)竞争结合fAP42。
[0051] 图35显示了测试rs-g3p (NlN2)-hIgG4_Fc (构建体4)的结合ftau的能力的一种 代表性的SPR测定的结果。结果指示，构建体4有效地结合ftau。
[0052] 图36显示了 rs-g3p(NlN2)-hIgGl_Fc(构建体6)的解聚ftau的能力。通过将 40uM的tau的微管结合重复区域（"MTBR"）稀释进50mM超氧化物歧化酶（"Sod"）中， 制备Tau纤维。将不同浓度的构建体6和制备的ftau在乙酸盐缓冲液（pH7. 0)中在37°C 温育72小时。在有5倍过量的ThT存在下，记录ThT荧光。图36A呈现了代表性的ThT测 定的结果，所述测定显示了构建体6的解聚ftau的能力。图36B显示了另一个代表性的实 验，其证实了构建体6的解聚tau的能力。图36A和36B也表明，构建体6对ftau的解聚 是剂量依赖性的。
[0053] 图 37 呈现了表明 rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体 6)和 rs-g3p(NlN2)(构建体 3)随时间对Αβ聚集的抑制的代表性实验。将Αβ42溶解在DMS0中，并在含有NaN3的PBS 中稀释。在有或没有不同浓度的构建体3和构建体6存在下，Α β 42在37°C聚集。通过ThT 荧光，测量Αβ42的聚集。图37A显示了样品的SDSPAGE。图37B显示了得自一个代表性 实验的结果。图37C显示了得自另一个代表性实验的结果。图37D总结了结果。
[0054] 图38Α和图38Β呈现了表明rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体6)的阻断PrP向 PrP-Sc转变的能力的实验的结果。对构建体6和IgG细胞裂解物进行超速离心以分离可 溶性的（上清液）和不溶性的（沉淀物）PrP物质。用抗-PrP单克隆抗体^Dll)，使PrP 物质生化地显影。在有IgG存在下，PrP分配在可溶性级分和不溶性级分中。在有构建体6 存在下，存在有限的不溶性的PrP。数据代表η = 4。
[0055] 图39Α和图39Β呈现了表明rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc(构建体6)在朊病毒病的细 胞培养模型中减少PrP Se的积累和聚集的能力的实验的结果。图39A显示了在用构建体6 和IgG处理以后，生化地分辨的未消化的和PK-消化的N2a22L Se细胞裂解物。在用递增浓 度的构建体6处理的细胞中，明显观察到PrPSe水平的显著下降。用?0. 08ug/ml构建体6 的处理实现了？1^(：水平的大约50(%下降。用1〇1^/1]11构建体6的处理使？冲&水平下降 至5. 725%，p〈0. 0001。在用lug/ml鼠 IgG处理的N2A22LSe细胞中没有观察到PrPSe水平 的显著变化。对于图39B，随后将X-射线胶片数字化，并初步标准化为得自相同通道的IgG 处理的N2a22LSc;细胞中的作用（其被视作100%)。然后相对于同样印迹的未消化的裂解 物，分析得自PK-消化的印迹的密度测定数据，并表达为变化百分比PrP s7PrPc。数据代表 η = 4〇

【具体实施方式】
[0056] 本发明部分地基于发明人对基因3蛋白（"g3p"，也被称作"p3"或"pill"）在介 导淀粉样蛋白结合和淀粉样蛋白聚集体的解聚中的作用的认识。本发明也基于发明人鉴别 出的与淀粉样蛋白结合所需的g3p的最小序列。
[0057] 因而，在某些实施方案中，本发明提供了包含从g3p衍生出的最小共有淀粉样蛋 白结合序列的分子，尤其是多肽。在这些实施方案的一个方面，所述分子是可溶性的。在这 些实施方案的另一个方面，所述分子解聚淀粉样蛋白（例如，淀粉样蛋白斑块）和/或阻 止所述淀粉样蛋白的聚集。在这些实施方案的另一个方面，所述分子是融合蛋白。在这些 实施方案的一个更具体的方面，所述分子是额外包含免疫球蛋白链的氨基酸序列的融合蛋 白。在这些实施方案的一个甚至更具体的方面，所述分子是额外包含免疫球蛋白G(例如， IgG)或免疫球蛋白M(例如，IgM)链的氨基酸序列的融合蛋白。在这些实施方案的另一个 方面，所述分子包含g3p的N2结构域。在这些实施方案的一个更具体的方面，所述分子包 含g3p的N1-N2结构域。在这些实施方案的另一个方面，所述分子包含全长g3p。在另一个 方面，所述分子是作为任意前述分子的片段、突变体或变体的多肽。
[0058] 在其它方面，本发明提供了结合TolA的分子，诸如TolA抑制剂分子，尤其是多肽， 其包含最小共有淀粉样蛋白结合序列。本发明的TolA结合分子和/或TolA抑制剂会结 合、解聚、分解淀粉样蛋白和阻止淀粉样蛋白聚集。所述TolA结合分子和/或TolA抑制剂 分子包括融合蛋白。在某些实施方案中，所述TolA结合分子和/或TolA抑制剂分子是大 肠菌素或大肠菌素的淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，所述大肠菌素是A组大肠 菌素。参见，例如，Cascales 等人，Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2007) 71 (1): 158-229。本 发明的TolA结合分子和TolA抑制剂分子是用于减少与疾病有关的淀粉样蛋白负载的有用 治疗剂，所述疾病为诸如全身性和周围性淀粉样蛋白疾病、神经变性疾病包括神经变性Tau 病变和传播性海绵状脑病（朊病毒相关的疾病）。也包括那些组合物用于预防与这些疾病 有关的淀粉样蛋白负载的积累的用途，以及那些组合物作为诊断剂用于检测淀粉样蛋白和 从而诊断这样的疾病的用途。
[0059] 在另一个实施方案中，本发明提供了丝状噬菌体，其已经被修饰以与野生型噬菌 体相比过表达g3p,以表达g3p的淀粉样蛋白结合片段、g3p的结合淀粉样蛋白的突变体或 变体形式、或包含g3p的结合淀粉样蛋白的融合蛋白。
[0060] 本发明提供了任意前述分子或噬菌体的物质组合物和/或药物组合物，以及它们 的结合、解聚淀粉样蛋白和阻止淀粉样蛋白聚集的用途，和它们的检测淀粉样沉着物并诊 断以淀粉样蛋白为特征的疾病和障碍的用途。
[0061] 定义
[0062] 术语"g3p"当单独使用或在术语诸如"g3p衍生的"中使用时，表示任意野生型或 重组丝状噬菌体g3p蛋白（包括g3p的片段、变体和突变体）。该术语不应解释为限于任何 特定丝状噬菌体g3p。作为例子，术语"g3p"包括SEQ ID NO: 1和图2中所示的有关蛋白。
[0063] 术语"丝状噬菌体"包括野生型丝状噬菌体和重组丝状噬菌体。在本申请中，"丝 状噬菌体"也可以被称作"噬菌体（bacteriophage) "、"噬菌体（phage) "或"M13"。
[0064] 本文中使用的术语"野生型丝状噬菌体"表示：在自然界中发现的丝状噬菌体，在 任意核苷酸或氨基酸序列数据库中指定为"野生型"的丝状噬菌体，商购可得的且被表征为 "野生型"的丝状噬菌体，和通过传代已经获得相对于任意前述丝状噬菌体的非重组突变的 丝状噬菌体。
[0065] 术语"结构域"是指多肽（包括蛋白）的具有一些独特物理特征或作用的区域，包 括例如由多肽链的一段组成的独立折叠的结构。结构域可以含有多肽的独特物理特征的序 列，或者它可以含有保留它的结合特征的物理特征的片段（即，它可以结合第二结构域）。 一个结构域可以与另一个结构域结合。换而言之，第一结构域可以天然地结合第二结构域。 例如，g3p N2结构域会结合性菌毛，g3p N1结构域会结合TolA。
[0066] 本文中使用的术语"淀粉样蛋白"、"淀粉样蛋白纤丝"和"淀粉样蛋白纤维"是三级 结构的一般术语，所述三级结构通过几种不同蛋白中的任意蛋白的聚集而形成，且由垂直 于纤维轴线堆叠的β折叠的有序排列组成。Sunde等人，J. Mol. Biol. (1997)273:729-39。 一种示例性的淀粉样蛋白是在阿尔茨海默氏病中形成的淀粉样蛋白-β的聚集体，其由 β -淀粉样肽" β A"组成，所述β Α是从人淀粉样蛋白前体蛋白（hAPP)切出的39-43氨基酸 内部片段。存在短形式（诸如Αβ 40)和长形式（诸如更纤维原性的Αβ异形体Αβ 42)。其它 示例性的淀粉样蛋白包括错误折叠的α-突触核蛋白（与帕金森病有关）、huntingtin (与 亨廷顿病有关）、tau(与阿尔茨海默氏病有关）和朊病毒蛋白的异常构象PrP'其它例子 提供在说明书中，并且是本领域技术人员已知的（参见，例如，Aguzzi(2010),和Eichner 和Radf〇rd，M〇l.Cell(2011)43:8-18)。因而，除非指明蛋白或肽，否则术语"淀粉样蛋白"、 "淀粉样蛋白纤丝"或"淀粉样蛋白纤维"的应用不应解释为限于任何特定蛋白或疾病。
[0067] 术语"β淀粉样肽"与"β_淀粉样肽"、"βΑΡ"、"βΑ"和"Αβ "同义。所有这些 术语表示从人淀粉样蛋白前体蛋白（hAPP)衍生出的形成淀粉样蛋白的肽。
[0068] "结合淀粉样蛋白纤丝"或"结合淀粉样蛋白"的噬菌体、蛋白、融合蛋白、融合蛋 白结构域、或前述物质的突变体、片段或变体是在淀粉样蛋白结合测定中为阳性的个体。使 用直接结合测定诸如表面等离子体共振（SPR)，可以在体外检测淀粉样蛋白结合，在该情况 下，它通常以至少1(Γ8Μ、1(Γ 9Μ、Κ^Μ或1(ΓηΜ的Kd结合淀粉样蛋白。可替换地，使用在实 施例中描述的fAi3 42结合测定，可以检测淀粉样蛋白结合。g3p的结合淀粉样蛋白的片段、 变体和突变体也可以如下鉴别：当注射进任意蛋白错误折叠疾病的转基因小鼠模型中时， 它们共同局部化至淀粉样蛋白。
[0069] 被描述为"解聚"或"介导解聚"的本发明的任意产品或组合物会减少已 经形成的聚集体。通过过滤器截留测定，可以测量解聚。Wanker等人，Methods Enzymol (1999) 309:375-86。过滤器截留测定在本文中进行了描述，且可以用于检测聚集体 和监测由本发明的组合物介导的解聚。将解聚检测为淀粉样蛋白在过滤器上的截留减少， 这通过在有递增浓度的解聚剂存在下的染色减少来证实。
[0070] 本文中使用的"减少淀粉样蛋白"的组合物会实现下述一项或多项：抑制淀粉样蛋 白形成，造成淀粉样蛋白解聚，促进淀粉样蛋白清除，抑制淀粉样蛋白聚集，阻断和/或阻 止有毒淀粉样蛋白寡聚体的形成，和/或促进有毒淀粉样蛋白寡聚体的清除。
[0071] 被描述为"保护神经元免于淀粉样蛋白损伤"的本发明的任意产品或组合物会阻 止新淀粉样蛋白的积累和/或阻止有毒淀粉样蛋白寡聚体的形成。可以预防性地施用被描 述为"保护神经元免于淀粉样蛋白损伤"的本发明的产品或组合物。通过本文描述的神经元 细胞培养物细胞毒性测定，可以测量产品或组合物是否保护神经元免于淀粉样蛋白损伤。
[0072] 本文中使用的"PrP蛋白"、"PrP"和"朊病毒"表示，能够在适当条件下诱导 引起蛋白错误折叠疾病的聚集体的形成的多肽。例如，正常细胞的朊病毒蛋白（PrP e) 在这样的条件下被转化成对应的羊瘙痒症异形体（PrP，，后者会引起疾病例如、但不 限于：牛海绵状脑病（BSE)或疯牛病、猫海绵状脑病、库鲁病（kuru)、克雅病（CJD)、 Gerstmann-Straussler-Scheinker 病（GSS)和致死性家族性失眠症（FFI)。
[0073] 本文中与噬菌体、蛋白、多肽或氨基酸序列结合使用的术语"变体"（例如，g3p变 体或g3p的淀粉样蛋白结合片段的变体）表示，与参比物相比，含有至少一个氨基酸差异 (置换、插入或缺失）的对应物质。在某些实施方案中，与参照序列相比，"变体"具有高氨基 酸序列同源性和/或保守的氨基酸置换、缺失和/或插入。在某些实施方案中，与参照序列 相比，变体具有不超过 75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 个氨基酸差异。 "保守置换"表示第一种氨基酸被第二种氨基酸替换，所述第二种氨基酸基本上不改变g3p 蛋白或g3p的淀粉样蛋白结合片段的化学、物理和/或功能性质（例如，g3p蛋白或淀粉样 蛋白结合片段保留相同的电荷、结构、极性、疏水性/亲水性，和/或保持功能诸如识别、结 合和/或减少淀粉样蛋白的能力）。这样的保守氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相 对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到不同前述特征的示例性保守 置换是本领域技术人员众所周知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸 和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0074] 术语"突变体"（例如，"突变体g3p"或"结合淀粉样蛋白的突变体片段"）表示这 样的蛋白：其在一个或多个氨基酸处被突变，以便调节它的治疗或诊断效力。在某些实施方 案中，突变体含有在已知与淀粉样蛋白相互作用的氨基酸处的置换、缺失和/或插入。在其 它实施方案中，突变体含有在特定氨基酸处的置换、缺失和/或插入，所述特定氨基酸是在 野生型g3p或其淀粉样蛋白结合片段中存在的保守氨基酸。在某些实施方案中，与参照序 列相比，突变体具有不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸 差异。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守置换。除了"变体"通常在性质上是非重 组的、而"突变体"通常是重组的以外，术语"变体"和"突变体"在本文中可互换地使用。
[0075] 本文中使用的术语"高严谨性"包括，技术人员基于例如DNA的长度容易地确定 的条件。通常，这样的条件定义在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版·第 1 卷，第 1· 101-104页，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 且包括使用：用于硝酸纤维素过滤器的预洗涤溶液5X SSC、0. 5%SDS、1.0mM EDTA(PH8.0)， 50%甲酰胺、6X SSC在42°C的杂交条件（或其它类似的杂交溶液，诸如Stark氏溶液，在 50%甲酰胺中，在42°C )，和在大约68°C用0. 2X SSC、0. 1% SDS洗涤。技术人员会认识到， 根据诸如探针长度等因素，可以在必要时调节温度和洗涤溶液盐浓度。
[0076] 本文中使用的术语"中等严谨性"包括，本领域普通技术人员基于例如DNA的 长度可以容易地确定的条件。基础条件阐述在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版·第 1 卷，第 L 101-104 页，Cold Spring Harbor Laboratory PreSS(1989)，且包括使用：用于硝酸纤维素过滤器的预洗涤溶液5X SSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA (pH8. 0)，50%甲酰胺、6X SSC在42°C的杂交条件（或其它类似的杂交溶液，诸如Stark 氏溶液，在50%甲酰胺中，在42°C )，和60°C、0. 5X SSC、0. 1% SDS的洗涤条件。
[0077] 术语"高序列同源性"是指，使用已知的计算机程序（诸如Bestfit程序）测得的 与参照序列的至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、 至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %氨基酸序列同 源性。
[0078] "融合蛋白"是包含包含至少2个多肽结构域的非天然存在的蛋白。
[0079] "g3p融合蛋白"包含与第二结构域连接的g3p蛋白。
[0080] "N1-N2融合蛋白"（也被称作"N1N2融合蛋白"）包含与第二结构域连接的g3p蛋 白的N1和N2结构域（或任一种的突变体、片段或变体），但是不包含N3/CT结构域。N1N2 融合蛋白可以包含或不包含铰链区。
[0081] "N2融合蛋白"包含与第二结构域连接的g3p蛋白的N2结构域（或N2的突变体、 片段或变体），但是既不包含N1结构域也不包含N3/CT结构域。N2融合蛋白可以包含或不 包含铰链区。
[0082] 本文中使用的"构建体1"衍生自野生型M13(参见，Genbank文件：NC_003287. 2， 版本GI:56718463。与野生型M13相比，在构建体1中，Ser378(AGC)被改变为Gly(GGC)， 且Ile87(ATT)被改变为Asn(AAC))。构建体1包含SEQ ID NO: 10的核酸。
[0083] "构建体2"是野生型M13分离物（GenBank JX412914. 1)。构建体2包含SEQ ID NO: 12的核酸。
[0084] "构建体3"是包含g3p的N1和N2结构域的重组可溶性g3p片段（rs-g3p (N1N2))， 其包含SEQ ID NO :20的氨基酸。
[0085] "构建体4"是重组可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白（rs-g3p (N1N2) -hIgG4-Fc)， 其包含SEQ ID NO:9的氨基酸。"构建体4"的N1N2区域衍生自"构建体1"的N1N2区域。
[0086] "构建体5"是重组可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白（rs-g3p (N1N2) -hIgG4-Fc)， 其包含SEQ ID NO: 11的氨基酸。"构建体5"的N1N2区域衍生自"构建体2"的N1N2区域。
[0087] "构建体6"是重组可溶性g3p片段IgGIFc融合蛋白（rs-g3p(NlN2)-hIgGl-Fc)， 其包含SEQ ID NO: 13的氨基酸。"构建体6"的N1N2区域衍生自"构建体2"的N1N2区域。
[0088] g3p的来源
[0089] 丝状噬菌体是一组感染革兰氏阴性细菌（例如，大肠杆菌（E. coli))的相关病毒。 参见，例如，Rasched and Oberer, Microbiology Reviews(1986)Dec:401_427。丝状噬菌体 的例子包括、但不限于：Ff家族的噬菌体（S卩，至少M13、fl和fd)和I-家族的噬菌体（即， 至少 122、Ike、ΙΠ )。
[0090] 所有天然存在的丝状噬菌体含有g3p作为次要外壳蛋白，其存在于每个噬菌体的 3-5个拷贝中。因而，在本发明的一个方面，从任何天然存在的丝状噬菌体得到分离的g3p。 还可以生产重组形式的g3p。重组g3p可以对应于得自任何天然存在的丝状噬菌体的野生 型g3p。因而，本发明也包括分离的重组g3p。
[0091] 在SEQ ID NO: 1中呈现了得自噬菌体M13的g3p的一个例子。除非另外清楚地指 明，描述的任何g3p突变是参照在下面以清洁和注解形式显示的SEQ ID N0:1:
[0092] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVWCTCDE TQCYGTWVPI
[0093] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN
[0094] 121PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY
[0095] 181WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE
[0096] 241GGGSEGGGSG GGSGS⑶FDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID
[0097] 301 GFI⑶VSGLA NGNGATCDFA GSNSGjMAQVG D⑶NSPLMNNFRQYLPSLPQ SVECRPFVFS
[0098] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0099] 沣解的 SEQ ID NO :1
[0100] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVVVCTCDE TQCYGTffVPI
[0101] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN
[0102] 121 PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY
[0103] 181 ffNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE
[0104] 241 GGGSEGGGSG GGSGS⑶FDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID
[0105] 301 GFI⑶VSGLA NGNGATCDFA GSNSQMAQVG D⑶NSPLMNN FRQYLPSLPQ SVECRPFVFS
[0106] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0107] 表1-注解的SEQ ID NO: 1的表解
[0108]

【权利要求】
1. 一种药物组合物，其包含结合淀粉样蛋白的多肽和药学上可接受的载体，其中所述 多肽包含至少一个基因3蛋白（g3p)或其淀粉样蛋白结合片段，其中所述组合物不包含噬 菌体。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋 白结合片段。
3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的整个N2结构域。
4. 根据权利要求2-3中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含g3p的 N1结构域的片段。
5. 根据权利要求2-3中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含g3p的 整个N1结构域。
6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p。
7. 根据权利要求1-6中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含载体， 所述载体与所述多肽共价地或非共价地连接。
8. 根据权利要求1-7中的任一项所述的药物组合物，其中存在于所述多肽中的至少一 个g3p或其淀粉样蛋白结合片段的氨基酸序列与野生型g3p的对应部分的氨基酸序列相 同。
9. 根据权利要求1-8中的任一项所述的药物组合物，其中存在于所述多肽中的至少一 个g3p或其淀粉样蛋白结合片段是突变体g3p。
10. 根据权利要求1-9中的任一项所述的药物组合物，其中所述g3p或其淀粉样蛋白结 合片段的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1-20中的任一个的对应部分具有至少70%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%同一性。
11. 根据权利要求9或权利要求10所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的N1和 N2结构域，其中N2的铰链区是突变的，使得铰链Tm低于野生型M13噬菌体的铰链Tm，且其 中所述多肽以比M13更高的亲和力结合淀粉样蛋白。
12. -种融合蛋白，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域结合淀粉样蛋 白，其中所述第一结构域包含至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段。
13. 根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的N2结构域的淀 粉样蛋白结合片段。
14. 根据权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含整个 N2结构域。
15. 根据权利要求13或权利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一结构域进一步包含 g3p的N1结构域的片段。
16. 根据权利要求13或权利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一结构域进一步包含 g3p的整个N1结构域。
17. 根据权利要求12-16中的任一项所述的融合蛋白，其中存在于所述第一结构域中 的至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段的氨基酸序列与野生型g3p的对应部分的氨基酸 序列相同。
18. 根据权利要求12-17中的任一项所述的融合蛋白，其中，存在于所述融合蛋白中的 至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段是突变体或变体g3p。
19. 根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的突变体或变体 或它们的片段，其保留g3p的结合淀粉样蛋白的能力，且当与SEQ ID NO: 1-20中的任一个 的氨基酸序列的对应部分比对时，其具有包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、 7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
20. 根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的N1和N2结构 域片段，其中N1和N2结构域中的至少一个包含没有破坏所述片段的结合淀粉样蛋白的能 力的突变，且其中所述N1和N2结构域片段当与SEQ ID NO: 1-20中的任一个的对应氨基酸 比对时，具有包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差 异的氨基酸序列。
21. 根据权利要求12-20中的任一项所述的融合蛋白，其中所述第二结构域包含免疫 球蛋白恒定区。
22. 根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区是Fc片段。
23. 根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述Fc片段选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和IgM的Fc片段。
24. 根据权利要求12所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含与SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少 98 %同一性的氨基酸序列。
25. 根据权利要求24所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含与SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13相同的氨基酸序列。
26. -种药物组合物，其包含根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白。
27. -种药物组合物，其包含分离的丝状噬菌体，所述丝状噬菌体表达突变体或变体 g3p。
28. 根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述突变体或变体g3p的氨基酸序列与 SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%同一 性。
29. -种药物组合物，其包含分离的丝状噬菌体，所述丝状噬菌体表达g3p的5个或更 多个拷贝，或突变体或变体g3p的5个或更多个拷贝。
30. 根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25 中的任一项所述的融合蛋白，其用于在有此需要的患者中减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋 白形成、抑制淀粉样蛋白聚集、或除去有毒寡聚体和/或阻止有毒寡聚体的形成。
31. 根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25 中的任一项所述的融合蛋白，其用于治疗选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默氏病，包括早 发型阿尔茨海默氏病、迟发型阿尔茨海默氏病和症状发生前的阿尔茨海默氏病；帕金森病； SAA淀粉样变性；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C ;遗传性冰岛综合征；年老；多发性骨髓瘤；朊病 毒病，包括库鲁病、克雅病（CJD)、Gerstmann-Straussler_Scheinker病（GSS)、致死性家族 性失眠症（FFI)、羊瘙痒症和牛海绵状脑炎（BSE);肌萎缩性侧索硬化（ALS);脊髓小脑性共 济失调（SCA1、SCA3、SCA6或SCA7);亨廷顿病；齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩；脊髓延 髓肌肉萎缩症；遗传性脑淀粉样蛋白血管病；家族性淀粉样变性；额颞叶痴呆；英国/丹麦 痴呆；和家族性脑病。
32. 根据权利要求30或权利要求31所述的药物组合物，其中当将生物标志物 florbetapir用作正电子发射断层摄影术中的成像剂时，所述患者是所述生物标志物阳性 的。
33. 根据权利要求30-32中的任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是帕金 森病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
34. 根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默氏病。
35. 根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是朊病毒病。
36. 根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述朊病毒病选自：克雅病、库鲁病、致 死性家族性失眠症和Gerstmann-Strauss丨er-Scheinker综合征。
37. -种减少有此需要的患者中的淀粉样蛋白的方法，所述方法包括：给所述患者施 用有效量的根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求 12-25中的任一项所述的融合蛋白。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述患者正在表现出与淀粉样蛋白的存在有关 的神经变性疾病的征状。
39. 根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中当将生物标志物florbetapir用 作正电子发射断层摄影术中的成像剂时，所述患者是所述生物标志物阳性的。
40. 根据权利要求37-39中的任一项所述的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森病、 阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。
42. 根据权利要求37所述的方法，其中所述患者正在表现出朊病毒介导的疾病的征 状。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述朊病毒介导的疾病选自：克雅病、库鲁病、 致死性家族性失眠症或Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征。
44. 一种编码结合淀粉样蛋白的多肽的核酸，其中所述多肽包含g3p或其淀粉样蛋白 结合片段，其中所述多肽与SEQ ID NO: 1相比包含在所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段中 的一个或多个突变，且其中所述突变非排它地选自Q129H、G153D、W181A、F190A和F194A。
45. 根据权利要求44所述的核酸，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋白结 合片段。
46. -种载体，其包含根据权利要求44或权利要求45所述的核酸。
47. -种宿主细胞，其包含根据权利要求46所述的载体。
48. -种制备结合淀粉样蛋白的多肽的方法，其中所述多肽包含g3p或其淀粉样蛋白 结合片段，其中所述多肽与SEQ ID NO: 1相比包含在N2部分中的一个或多个突变，且其中 所述突变非排它地选自0129!1、6153〇、118认、？19(^和？1944，所述方法包括 ：表达由根据权 利要求46所述的载体中的核酸编码的多肽，和分离表达的蛋白。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋白结 合片段。
50. -种核酸，其编码根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白。
51. -种载体，其包含根据权利要求50所述的核酸。
52. -种宿主细胞，其包含根据权利要求51所述的载体。
53. -种制备根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括： 表达由根据权利要求51所述的载体中的核酸编码的融合蛋白，和分离表达的融合蛋白。
54. 根据权利要求1-11中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25中的任一 项所述的融合蛋白，其中所述组合物中的多肽或所述融合蛋白进一步包含可检测标记。
55. 根据权利要求54所述的药物组合物或融合蛋白，其中所述标记是选自18F、nC或 1231的放射性标记。
56. -种检测患者中的淀粉样蛋白的方法，所述方法包括下述步骤： a) 给所述患者施用根据权利要求54所述的药物组合物或融合蛋白；和 b) 检测所述标记。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中通过正电子发射断层摄影术（PET)检测所述标 记。
58. -种成像剂，其包含根据权利要求54或55所述的组合物。
59. -种用于诊断患者中与淀粉样蛋白有关的疾病或障碍的方法，所述方法包括下述 步骤： a) 给所述患者施用根据权利要求58所述的成像剂； b) 允许所述试剂结合存在的任何淀粉样蛋白； c) 检测已经与淀粉样蛋白结合的任何成像剂，和 d) 当检测到所述成像剂时，诊断与淀粉样蛋白有关的疾病或障碍。
【文档编号】A61K47/48GK104093414SQ201280066659
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月28日 优先权日:2011年11月29日
【发明者】R.克里什南 申请人:神经噬菌体制药股份有限公司