一种针对β淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学与分子生物学领域，涉及一种针对退行性神经系统疾病致病 因子13淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体。
【背景技术】
[0002] 退行性神经系统疾病的代表性病症阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD)，俗 称老年痴呆症，是一种持续性神经功能障碍，也是老年人群中痴呆症最普遍的成因。在2006 年，全世界约有2600万名阿兹海默病病患，到2050年时预估全球发病率为1/85。研究显示 阿兹海默病与大脑中的老年斑块（senile plaque,即amyloid plaque)和神经纤维纠结有 关。目前的治疗仅能帮助缓解疾病的症状，并没有能够停止或是反转阿兹海默病病程的治 疗方法。截至2012年为止，已有超过1000个临床试验研究如何治疗阿兹海默病。目前较 有治愈潜力的为各种针对13淀粉样蛋白（amyl〇id-beta，A0)所开发的基因工程抗体。A3 多肽可包含不同数目的氨基酸，常见形式如AP42和AP40。这些针对AP的人源化的抗体 可以通过抑制AP的聚集来消除其对神经元的毒性作用，或者通过清除已形成的老年斑块 来达到回复神经系统功能的效果。尽管如此，这些抗体由于体积较大（150kd左右)，不能轻 易穿过血脑屏障，也容易失活、变性，稳定性差，溶解性低及生产成本高昂，难以在临床上应 用。
[0003] 1993年比利时科学家首次报道驼类血液中存在不含轻链的抗体，这些缺失轻链 的"单域重链抗体"（VHH)能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，而且不会像常规抗体 那样互相沾粘，甚至聚集成块，另外不会因为含有传统抗体的Fc段而引起补体反应。这种 抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是表达出来的单域重 链抗体具有很好的结构稳定性与抗原结合活性。由于此种VHH的分子量只是普通抗体的 1/10,大小仅有2-5nm，因此VHH也称纳米抗体（Nanobody);与此同时纳米抗体化学性质 也更加灵活，稳定性好，可溶性高且容易获得，同时可以轻易穿过血脑屏障，到达靶部位起 作用。因此通过筛选出针对AP的单域重链纳米抗体(命名为NB1)可以有效克服常规抗体 在治疗过程中的缺点，可开发成用于治疗AP为致病因子的抗体药物。此外，由于纳米抗体 的化学、物理稳定性好，仅含有约130个氨基酸，便于基因工程改造或化学偶联上多种标记 物，如生物素等，因此可以用于开发成针对AP的检测试剂盒。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是：提供一种针对AP的单域重链纳米抗体及其氨基酸 序列，同时提供该单域重链纳米抗体的DNA编码序列，并提出该抗体在制备针对A P检测试 剂和治疗阿兹海默病的药物方面的应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是： 提出了一种针对AP的单域重链纳米抗体，其VHH链包括框架区FR和互补决定区⑶R， 其特征在于，所述框架区FR包括？1?1、？1?2、？1?3、？1?4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为5￡〇 10勵：1所示？1?1，5￡〇10勵:2所示？1?2,5￡〇10勵:3所示的？1?3,5￡〇10勵:4所示的FR4 ;所述互补决定区⑶R包括⑶RU⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO:5 所示的CDRl，SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0006] 其中，所述的针对AP的单域重链纳米抗体的VHH链具有SEQIDNO:8所示的氨 基酸序列。
[0007] 还提供一种DNA分子，它用以编码上述针对AP的单域重链纳米抗体的VHH链，其 核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。
[0008] 除此之外，还提供一种表达载体，它包含上述DNA分子的核苷酸序列，一种宿主细 胞，它可以表达上述针对AP的单域重链纳米抗体。
[0009] 本发明还提供了针对AP的单域重链纳米抗体用于制备检测AP试剂中的用途以 及用于制备治疗阿兹海默病药物中的用途。
[0010] 最后，提出一种用于检测P淀粉样蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括上面所述的 针对0淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体。
[0011] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的优点如下： 本发明采用AP肽段免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对A3的单域重链纳米抗体基因库，将AP偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示 技术筛选免疫性的单域重链纳米抗体基因库，从而获得了针对A3特异性的单域重链纳米 抗体基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的单域重链纳米抗 体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对A0单域重链纳米抗体VHH 链的氨基酸序列，并证明了该单域重链纳米抗体可以同AP特异性结合，从而可以应用到 A3检测试剂和治疗阿兹海默病药物的开发。
【附图说明】
[0012] 图1是对于所构建的噬菌体展示单域重链纳米抗体文库进行插入率检测的菌落PCR电泳图，其中泳道1是DNA分子marker，泳道2-25是所构建的AP单域重链纳米抗体 文库中随机挑取的克隆PCR检测电泳图； 图2是表达的针对AP单域重链纳米抗体，经镍柱亲和层析纯化前后的SDS-PAGE的电 泳图，M:蛋白分子标记，单位为KDa;1:样品与镍柱结合前，破菌后蛋白总的粗提液样品； 2:总的蛋白粗提液过镍柱后的样品（15KDa处无条带说明单域重链纳米抗体吸附停留在 镍柱上);3-7:共5步含500毫摩尔咪唑洗脱液洗脱的样品（3-7递减显示至第5轮基本完 全洗脱)。
[0013] 图3是以AP单域重链纳米抗体NBl为核心材料制作的基于ELISA技术的A3检 测试剂盒原理示意图。
[0014]附图标记：1.包被的AP单域重链纳米抗体NBl;2.抗原AP;3.AP抗体；4. 酶标抗体；5.辣根过氧化物酶。
【具体实施方式】
[0015] 下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
[0016] 本发明首先将经过KLH蛋白偶联的人工合成AP作为抗原免疫一只新疆双峰驼， 经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了AP特异的单域重链抗体文库。 将八0偶联在酶标板上，展示正确的空间结构，使得AP的抗原表位得以暴露出来，以此形 式的抗原利用噬菌体展示技术筛选AP免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展 不基因库)，而获得了能在大肠杆菌中商效表达的单域重链纳米抗体株。
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0018] 实施例1 :针对AP的单域重链抗体NBl文库的构建 (1)由KLH蛋白偶联的合成六0肽段20mg(购自南京金斯瑞生物科技有限公司）与弗 氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼(购自句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫4 次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不完全佐剂，免疫过程中刺激B 淋巴细胞表达抗原特异性的针对AP的单域重链纳米抗体VHH。（2)4次免疫结束后，提取 骆驼外周血淋巴细胞IOOml并提取总RNA。（3)将提取的RNA反转录成cDNA。（3)利用套 式PCR扩增VHH链，结果如图1显示，该片段的大小约为400bp。（4)使用限制性的内切 酶PstI及NotI酶切20HgpComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10HgVHH基 因片段的PCR纯化产物，并连接两个片段。（5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TGl (购自北京神州红叶科技有限公司）中，构建A3的单域重链纳米抗体VHH噬菌体展示文库 并测定库容，库容的大小为6XlO8。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选 取24颗克隆做菌落PCR(图一)。结果显示我们的插入率近100%。
[0019] 实施例2 :针对AP的单域重链纳米抗体NBl的筛选过程： (1)取200微升转化TGl细胞加入到100毫升2XTY培养基中，37°C培养3小时。（2) 加入40微升VCSM13辅助噬菌体，室温静置30分钟。（3)离