植物淀粉合成相关蛋白IbAATP及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物淀粉合成相关蛋白IbAATP及其编 码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 甘薯（Ipomoea batatas (L. ) Lam.)是一种重要的粮食、饲料以及工业原料用作物， 并且在当今世界上作为一种新型能源植物，其地位显得尤为重要。我国是世界上最大的甘 薯生产国，年种植面积348. 2万公顷，占世界总种植面积的43. 0%，年产量占世界总产量的 68. 6%。我国目前正处于飞速发展时期，对能源的需求持续增加，因此寻找新的可替代能源 将是一项长期的战略性工作。甘薯作为一种块根作物，含丰富的淀粉，而淀粉又是目前工业 乙醇生产的重要原料之一，因此通过对甘薯淀粉生物合成途径相关蛋白的深入研宄，提高 甘薯淀粉总含量与品质，对于增加甘薯在新能源领域的应用价值非常有意义。
[0003] 甘薯是无性繁殖作物，种间、种内杂交不亲和性严重限制了甘薯育种中的资源利 用和亲本自由组配，育种实践表明，用常规杂交育种方法难以选育出优质、高产、耐盐抗旱 的甘薯新品种。利用基因工程技术培育甘薯新品种，可以减少甘薯种质的退化，提高甘薯的 产量和品质，具有较好的环境效益和社会效益。
[0004] 植物淀粉是大多数植物种子或块茎的主要组成部分，在人类生活中起着举足轻重 的作用。植物淀粉主要是由两类葡糖聚体组成：（1)直链淀粉，由1000-5000个葡糖残基以 α -1，4糖苷键呈线性连接的葡聚糖直链，很少或没有α -1，6糖苷键分支；（2)支链淀粉， 由线性的α-1，4葡聚糖苷链在α-1，6糖苷键部位产生葡聚糖分支构成的一束葡糖聚体 (polymerization，DP)，分子量大约在IO5-IO6葡糖残基单位左右。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物淀粉的总含量和/或改变淀粉品质。
[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种植物淀粉合成相关蛋白。
[0007] 本发明所提供的植物淀粉合成相关蛋白，名称为IbAATP，来源于甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.)，是如下1)或2)或3)的蛋白质：
[0008] 1)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白质；
[0009] 2)在序列表序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； [0010] 3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加得到的与植物淀粉合成相关的蛋白质。
[0011] 其中，序列表序列2由629个氨基酸残基组成。
[0012] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧 基末端连接上如表1所示的标签。
[0013] 表1、标签的序列
[0014]
[0015] 上述c)中的蛋白质IbAATP，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0016] 上述C)中的蛋白质IbAATP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。
[0017] 上述c)中的蛋白质IbAATP的编码基因可通过将序列表序列1所示的DNA序列中 缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在 其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 编码所述IbAATP的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0019] 所述编码IbAATP的核酸分子可为如下（1)或⑵或（3)或（4)所示的DNA分子：
[0020] (1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
[0021] (2)编码区如序列表序列1所示的DNA分子；
[0022] (3)与⑴或⑵限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且编码所述 IbAATP 的 DNA 分子；
[0023] (4)在严格条件下与⑴或（2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述IbAATP的DNA 分子。
[0024] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0025] 其中，序列表序列1由1890个核苷酸组成，序列表序列1的核苷酸编码序列表序 列2所示的氨基酸序列。
[0026] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码IbAATP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 分离得到的IbAATP的核苷酸序列80%或者更高同一性的核苷酸，只要编码IbAATP且与植 物淀粉合成相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0027] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列表的序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质的核昔酸序列具有80%或更尚， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0028] 含有所述编码所述IbAATP的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因 细胞系也属于本发明的保护范围。
[0029] 所述表达盒可为表达盒A ;所述表达盒A包括启动子、编码所述IbAATP的核酸分 子和终止子。所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子；所述终止子可为 NOS终止子或OCS polyA终止子。
[0030] 所述表达盒A的序列可为序列表序列3所示。所述表达盒A中：序列表序列3的 自5'末端第1至835位为CaMV35S启动子，第854至2743位为编码所述IbAATP的核酸分 子，第2760至3012位为NOS终止子。
[0031] 所述重组载体可为将所述IbAATP的编码基因（即序列表序列1所示的DNA分子） 通过含有所述IbAATP的编码基因的表达盒插入出发质粒得到的重组质粒。
[0032] 所述重组载体可为用序列表序列1所示的DNA分子替换pCAMBIA3301的BamHI 和Sac I识别序列间的片段（pCAMBIA3301被限制性核酸内切酶BamHI和Sac I切成 一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段）得到的重组载体pCAMBIA3301-IbAATP， pCAMBIA3301-IbAATP表达序列表序列2所示的IbAATP。所述pCAMBIA3301与 pCAMBIA3301-IbAATP的差别仅在于将pCAMBIA3301的BamHI和Sac I识别序列间的DNA 片段（PCAMBIA3301被限制性核酸内切酶BamHI和Sac I切成一个大片段和一个小片段，该 DNA为该小片段）替换为序列表序列1所示的DNA分子。
[0033] 在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为：(A)用限制性内切酶PstI和 EcoRI双酶切植物表达载体pCAMBIA3301得到载体骨架，用限制性内切酶PstI和EcoRI双 酶切原核表达载体PBI121，回收约3006bp的片段，将所述载体骨架和所述片段连接得到重 组质粒PCB⑶S ; (B)用序列表序列1所示的DNA分子替换重组质粒pCB⑶S的BamHI和Sac I识别序列间的片段（重组质粒PCBGUS被限制性核酸内切酶BamHI和Sac I切成一个大片 段和一个小片段，该DNA为该小片段）得到的重组载体pCB-IbAATP，pCB-IbAATP表达序列 表序列2所示的IbAATP。所述pCB⑶S与pCB-IbAATP的差别仅在于将pCB⑶S的BamHI和 Sac I识别序列间的DNA片段（pCB⑶S被限制性核酸内切酶BamHI和Sac I切成一个大片 段和一个小片段，该DNA为该小片段）替换为序列表序列1所示的DNA分子。
[0034] 所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。
[0035] 所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革 兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)。所 述根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌EHA105。
[0036] 所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所 述IbAATP基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物， 可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品 种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0037] 所述IbAATP，或，所述编码所述IbAATP的核酸分子，或，含有所述编码所述IbAATP 的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在植物淀粉总含量改变和/ 或淀粉品质改变中的应用也属于本发明的保护范围。
[0038] 所述IbAATP，或，所述编码所述IbAATP的核酸分子，或，含有所述编码所述IbAATP 的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育植物淀粉总含量改变 和/或淀粉品质改变的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0039] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
[0040] 本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括将编码所述IbAATP的核酸分 子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比淀粉总 含量增加和/或直链淀粉含量增加和/或支链淀粉含量减少和/或淀粉链长分布改变和/ 或粘度特性改变。
[0041] 上述培育转基因植物的方法中，所述编码所述IbAATP的核酸分子可为如下（1)或 (2)或⑶或（4)所示的DNA分子：
[0042] (1)核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
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