p38α拮抗肽突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，涉及ρ38α拮抗肽突变体及其在制备治疗心肌缺血 再灌注损伤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] ρ38 是 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase)超家族成员之一，p38 家族主 要有四个亚型，ρ38 α、Ρ38 β、ρ38 γ和ρ38 δ。其中Ρ38 α和Ρ38 β在组织细胞中遍在表 达，而ρ38γ和ρ38δ只在特异的组织中表达。Ρ38α和Ρ38β具有较高同源性，在功能上 也有一定重叠；但ρ38α在大多数细胞中处于高表达水平而Ρ38β则处于低表达水平，所 以，一般认为ρ38α是Ρ38家族成员的主要亚型。ρ38α最初发现是因其是一种能够结合嘧 啶咪唑类化合物的酶，能够抑制LPS诱导的炎性因子IL-I和TNF- α在单核细胞内的产生。 随后的研宄表明，ρ38α不仅是炎症发展的核心介导因子，在肿瘤生成、细胞存活和氧化应 激损伤等方面也发挥重要作用，因此被认为是治疗炎症及的靶点。目前已设计出多种ρ38α 抑制剂，它们作用位点虽然不尽相同，但其本质是相同的，都是与ATP竞争结合ρ38的催化 中心，由于人体内不同的激酶均有高度相似的腺苷结合口袋，致使以竞争结合ATP为作用 机制的ρ38 α抑制剂存在不同程度毒副作用。鉴于Ρ38 α的ATP竞争性抑制剂临床试验存 在安全性问题，所以设计非ATP竞争性ρ38 α抑制剂来替代现有的ATP竞争性抑制剂非常 必要。
[0003] 以 P38 α 与其衔接接头蛋白 TABl [transforming growth factor-β (TGF-β )- activated protein kinase I(TAKl)-binding protein 1]相互作用为革El点是设计非 ATP 竞争性ρ38α抑制剂的策略之一。研宄发现，TABl能够与ρ38α发生相互作用，促使其第 180位的苏氨酸和第182位的酪氨酸发生双位点磷酸化而被激活，而这一过程不需要ρ38 上游MAPK激酶ΜΚΚ3/ΜΚΚ6的参与。TABl与ρ38 α的相互作用具有亚型特异性和结构特异 性-即TABl不与ρ38的其他三个亚型ρ38 β、ρ38 γ、ρ38 δ发生结合，而且ρ38 α与TABl 相互作用的结构区域不同于它和ΜΚΚ3/ΜΚΚ6的相互作用区域。基于此，本课题组之前的工 作通过靶向ΤΑΒ1/ρ38 α设计了一种具有细胞膜渗透性的拮抗肽ΡΤ5,并通过体内体外实验 证明ΡΤ5能够选择性的抑制ΤΑΒ1/ρ38 α的相互作用，从而在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 中减轻心肌的再灌注损伤。急性心肌梗塞是由于冠状动脉血栓形成后导致的组织缺血而引 起。冠状动脉的再灌注对于恢复心肌功能非常重要，但刚开始恢复血液再灌注后，不但未减 轻反而加重缺血所引起的细胞功能代谢障碍及结构破坏，因而将这种血液再灌注后缺血性 损伤加重的现象称为缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R)损伤。I/R将会带来一些 不良效应，例如氧化应激，细胞内钙超载等，这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。研宄表明， 在缺血再灌注过程中TABl与ρ38α相互作用以及TABl介导的ρ38α旁路活化在其中起关 键作用。
[0004] 目前，能够有效降低心肌缺血再灌注损伤的干预策略和治疗药物还非常有限。之 前工作所设计的ΡΤ5拮抗肽有望成为相关药物的先导化合物。然而，ΡΤ5中发挥拮抗ρ38 α 旁路活化作用的关键氨基酸还是未知的。寻找PT5拮抗肽中相应的关键位点将有助于获得 更精确的结构信息并对多肽进行优化，从而为心肌再灌注损伤防治药物提供先导结构。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种ρ38 α拮抗肽突变体PT5-2。经GST-pull实验和 Kinase assay实验证明：ΡΤ5突变体ΡΤ5-2对于TABl与ρ38 α相互作用的抑制能力更强。 [0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种ρ38 α拮抗肽突变体，所述突变体命名为ΡΤ5-2,所述ΡΤ5-2的 氨基酸序列为以下组中的任意一个：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；
[0009] (2)在SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
[0010] 优选地，所述PT5-2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0011] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0012] 本发明的ρ38α拮抗肽突变体PT5-2也包括对SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的 非保守修饰，只要经过修饰的多肽仍然能够保留P38 α拮抗肽突变体PT5-2的生物学活性 即可。在此类修饰中突变的氨基酸数目是3个或者更少。
[0013] 本发明还提供了一种编码上述突变体的DNA分子。
[0014] 本发明提供了一种重组载体，所述载体包括前面所述的DNA分子。
[0015] 所述重组载体可以是病毒载体或者非病毒载体。
[0016] 非病毒载体包括但不限于线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA载体。
[0017] 本发明的病毒载体包括但不限于腺病毒载体（adenoviral vectors)、腺相关病 毒载体（adeno-associated viral vectors)、反车专录病毒载体（retroviral vectors)、 单纯疱疼病毒载体（herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒载体（lentiviral vectors)〇
[0018] 如本文中所使用，术语"载体"应理解为意指包含了能够并入到宿主细胞中并与宿 主细胞基因组重组并整合到宿主细胞基因组中，或作为游离体自主复制的核苷酸序列的任 何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA载体、病毒载体等。
[0019] 在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核（如 大肠杆菌等细菌）、低等真核细胞（如酵母）、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。 总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有 复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
[0020] 本发明还提供了包含上述重组载体的宿主细胞。
[0021] 进一步，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏 菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0, C0S，293细胞、 或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0022] 本发明还提供了前面所述的PT5-2突变体在制备抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用的药 物中的应用。
[0023] 本发明还提供了编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子在制备抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 的药物中的应用。
[0024] 本发明还提供了包含编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子的重组载体在制备抑制TABl/ ρ38α相互作用的药物中的应用。
[0025] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备抑制ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用的药物中的应用。
[0026] 本发明还提供了前面所述的ΡΤ5-2突变体在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用导致 的疾病的药物中的应用。
[0027] 本发明还提供了编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 导致的疾病的药物中的应用。
[0028] 本发明还提供了包含编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗TABl/ ρ38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。
[0029] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用导致的疾病的药物中的应用。
[0030] 本发明还提供了前面所述的ΡΤ5-2突变体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药 物中的应用。
[0031] 本发明还提供了编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的 药物中的应用。
[0032] 本发明还提供了包含编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗心肌缺 血再灌注损伤的药物中的应用。
[0033] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗心肌缺血再灌 注损伤的药物中的应用。
[0034] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的ΡΤ5-2突变 体、编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子、包含编码ΡΤ5-2突变体的DNA分子的重组载体、或包含 前面所述的重组载体的宿主细胞。
[0035] 进一步，本发明的所述药物组合物还包括要学上可接受的载体，所述载体包括但 不限于已经被美国食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、赋形剂、助 流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助 悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
[0036] 本发明的药物组合物可以通过多种手段施用，所述手段例如通过口服、舌下、口 腔、肠胃外、经鼻、经局部、经直肠、经皮、经粘膜等。
[0037] 根据药物组合物的施用形式，可将药物组合物制备成相应的各种剂型，所述剂型 包括但不限于片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂。
[0038] 本发明的组合物可以例如呈适于立即释放或持续释放的形式施用。立即释放或持 续释放可以通过使用适合的药物组合物，或特别是在持续释放情形中，通过使用如皮下植 入物或渗透泵等装置实现。
[0039] 供治疗的受试者为经历心肌缺血再灌注损伤的患者，受试者包括但不限于哺乳动 物，如人、狗、猫等。
[0040] 应了解，用于任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且将取决 于多种因素，包括所用药物组合物的活性；该药物组合物的代谢稳定性和作用时间长度； 受试者的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式