专利名称：肿瘤坏死因子拮抗肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组肿瘤坏死因子拮抗肽，具体涉及一组能够与肿瘤坏死因子特异结合并抑制其活性的小分子肽。本发明还涉及这些肿瘤坏死因子拮抗肽在医药领域中的应用。
通过抑制肿瘤坏死因子-α与受体的结合是一种比较好的抑制肿瘤坏死因子-α活性的方法。目前抑制肿瘤坏死因子-α与受体的结合有三种方式肿瘤坏死因子-α抗体、可溶性肿瘤坏死因子受体、肿瘤坏死因子-α及其受体模拟肽。最初研究表明，抗肿瘤坏死因子-α抗体可中和肿瘤坏死因子-α的活性，提示肿瘤坏死因子-α抗体可望作为药物用于炎症治疗。在随后的研究中，许多公司致力于开发针对肿瘤坏死因子-α诱发炎症的抗体药物。Centorcor公司生产的抗肿瘤坏死因子-α抗体REMICADE(infliximab)于1998年8月获FDA批准用于Crohn’s的治疗(van Deventer等，Aliment Pharmacl Ther 13 Suppl43(1999)；Scand J Immunol 5118(2000))，该药于1999年11月再次获FDA批准用于RA的治疗。这是第一种用于RA治疗的抗体类药物。另外，英国BASF公司在成功实验了人-鼠杂合抗肿瘤坏死因子-α抗体cA2对RA的治疗之后，目前正在开展新抗体D2E7治疗RA的三期临床实验(Baert等，Int JColorectal Dis 1447(1999))。研究还表明除了抗肿瘤坏死因子-α的抗体可以中和肿瘤坏死因子-α的活性外，可溶性肿瘤坏死因子-α受体也同样具有比较好的效果。美国的Immunex公司于1993年就开始研究使用人肿瘤坏死因子R2胞外区与IgG1Fc段融合的重组蛋白(商品名ENBREL)治疗RA，并于1998年5月获得FDA批准，用于RA的临床治疗(Moreland等，Rheum Dis ClinNorth Am 24579(1998))。1999年5月再次获准用于青少年类风湿性关节炎(JRA)的治疗。目前该公司正在实验用ENBREL治疗充血性心力衰竭。
虽然抗肿瘤坏死因子-α抗体、可溶性肿瘤坏死因子-α受体已经取得了较好的临床效果，但还存在一些问题。由于肿瘤坏死因子-α拮抗剂的适用症主要是一些急性或慢性炎症，因此实际临床应用时对这些拮抗剂的要求是可以大剂量、长期使用，而且毒副作用小。然而，目前临床上使用的这些大分子物质在来源、稳定性、成本(例如Enbrel的分子量为150kDa，一个成年人的用量是50mg/周)以及潜在的副作用等方面存在诸多问题，为了取得更好的治疗效果，并降低成本，人们开始把研究的注意力逐步转移到开发小分子拮抗剂，肿瘤坏死因子受体模拟肽就是这样一种尝试，肿瘤坏死因子-α受体小分子模拟肽的研究经历了三个阶段，最初人们尝试根据抗-肿瘤坏死因子-抗体或可溶性肿瘤坏死因子受体上与配体结合有关的氨基酸一级结构进行多肽合成和药物筛选。但由于氨基酸的一级结构不能完全反映蛋白质的空间构象，因此很难达到理想的拮抗效果(Lie等，Biochemical and BiophysicalResearch Communication 188503-509(1992))。后来由于肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R复合物的晶体结构的发现，Takasaki等借助计算机的模拟，确定受体-配体结合位点的关键氨基酸，并合成了一系列肽模拟物(Takasaki等，Nature Biotech，151266(1997))。他们发现其中一些肽模拟物无论是在受体结合还是生物学活性方面，都具有拮抗肿瘤坏死因子-α的作用，其中最好的拮抗剂的IC50可达5μmol/L。但开展这项研究首先要对细胞因子及其受体空间结构，以及对细胞因子的功能部位有深入研究，而且即使是象肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R这样晶体结构已知的体系，由于单纯从配体结构分析入手得到的信息是十分有限的，尤其是肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子R间作用位点几乎分布在整个三聚体表面，因此仍然很难明确究竟哪个位点是最重要的，必须合成一系列的多肽，这样就存在一定的风险。目前这一条路线的成功率还很低。
随着80年代后期崛起的一种研究蛋白质间相互作用的有力工具—噬菌体展示技术的成熟和发展，对肿瘤坏死因子-α及其受体模拟肽的直接筛选工作终于成为可能。由于噬菌体展示技术的简单、直接以及丰富的库容量所赋予的极大的可能性，已成为药物筛选的首选工具。并且在肿瘤坏死因子-α拮抗剂的筛选中也已得到应用。1998年，Chirinos-Rojas等利用随机14肽库对肿瘤坏死因子-α进行筛选，得到了一种具有生物活性的结合肽(Chirinos-Rojas等，Journal of Immuology 1615621(1998)；Immunology96109(1999))。但由于他们得到的是单一序列，无法对序列中每个氨基酸的作用进行评价，因此不能做进一步的优化，限制了继续筛选高亲和力的肽配体。我们从噬菌体随机12肽库中筛选到两组具有一致序列的肿瘤坏死因子拮抗肽，其中一组已经申请了中国专利(专利申请号为01110780.4)，这里所列的是另外一组具有一致序列的肿瘤坏死因子-α结合肽。
本发明的另一目的是提供这些肿瘤坏死因子拮抗肽的用途。
本发明的肿瘤坏死因子拮抗肽是具有以下通式的多肽；X1-X2-X3-X4-His-X6-Glu-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14式中，X1可以是任何氨基酸残基，也可以缺失；
X2可以是任何氨基酸残基，最好是酪氨酸残基(Tyr)；X3可以是任何氨基酸残基，最好是碱性氨基酸残基，包括精氨酸残基(Arg)和赖氨酸残基(Lys)；X4可以是任何氨基酸残基，最好是亮氨酸残基(Leu)或脯氨酸残基(Pro)；X6可以缺失，也可为侧链基团较小的氨基酸残基，如甘氨酸(Gly)残基或丙氨酸(Ala)残基；X8为亮氨酸残基(Leu)或异亮氨酸残基(Ile)；X9代表芳香族氨基酸残基，包括色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)和酪氨酸残基(Tyr)；X10可以是任何氨基酸残基；X11可以是任何氨基酸残基；X12代表芳香族氨基酸残基，包括色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)和酪氨酸残基(Tyr)；X13可以是任何氨基酸残基，也可以缺失；X14可以是任何氨基酸残基，也可以缺失。
具有上述结构模式的多肽可与肿瘤坏死因子专一结合，并阻断肿瘤坏死因子与受体的结合，从而抑制肿瘤坏死因子的生物学活性，包括肿瘤坏死因子的细胞毒性以及肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡的活性。此类结构模式既可以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白或多肽融合，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构模式的物质都可能表现出与肿瘤坏死因子结合并抑制肿瘤坏死因子活性的作用。
本发明选用以下8个具有代表性的肽进行说明。
1号肽EYRPHLLLWSVY2号肽NYK-HAELYQSWH3号肽NYRLH-ELYQSWH
4号肽TARPH-ELFLLLR5号肽GLNMH-ELYMHWA6号肽VPPLH-ELYLMYT7号肽QPLH-EIFFHFMY8号肽VLQH--LYPIFSPH目前虽有肿瘤坏死因子结合肽的报道，但未能找到在结合过程中起关键作用的氨基酸残基。本发明通过对一组与肿瘤坏死因子结合的多肽的结构分析，确定了与肿瘤坏死因子结合的氨基酸序列模式或称结构模式，这对于设计和研制新型抗肿瘤坏死因子的药物具有重要意义。
研究结果表明，本发明筛选到的多肽不仅能够竞争性地阻断肿瘤坏死因子与受体的结合，也能抑制肿瘤坏死因子对细胞的细胞毒性，因而可望成为新的抗肿瘤坏死因子药物或药物前体，为各种炎症或相关免疫性疾病的治疗提供了一条新的途径。本发明的肿瘤坏死因子拮抗肽在制造抗肿瘤坏死因子的药物中具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。
另外，肿瘤坏死因子结合肽作为生物制剂也有着潜在的应用价值，如作为配体用于肿瘤坏死因子的亲和纯化、作为探针用于肿瘤坏死因子的检测等等。
根据肿瘤坏死因子结合肽序列模式的多种存在形式，可以有多种获取含此序列模式物质的方法，如固相方法，溶液中合成，用基因工程方法生产重组蛋白，以及通过其他化学方法合成。含此序列模式的物质可有各种应用方式，主要包括在体外和体内抑制肿瘤坏死因子的活性，以各种给药方式实现以抑制肿瘤坏死因子活性为目的的疾病治疗，以及肿瘤坏死因子的检测或纯化等。
含本发明序列模式的物质在生物医学方面的应用还包括1、通过合成或基因重组的方式，将含此序列模式的肽段与其他蛋白或肽融合，用于以抑制肿瘤坏死因子活性为目的的各种感染性疾病、自免疫疾病以及其他相关疾病的治疗。
2、将其与琼脂糖偶联后，用于肿瘤坏死因子的亲和分离。
3、将其与指示标签偶联后，用于肿瘤坏死因子的鉴定。
图1B为ELISA检测GST融合肽与TNFα的特异性结合。
图2为GST融合肽及合成肽的竞争性受体结合抑制实验的结果曲线，A.GST融合肽，B.合成肽。
图3为GST融合肽对TNF-α细胞毒活性抑制实验的结果曲线。
实施例1、三个具有代表性肽的有机合成有机合成3号、6号、7号多肽(由上海申友生物有限公司合成)，称取KR树脂1g置于反应器中，加入DMF溶涨30min，滤除DMF，将Fmoc氨基酸、HBTU、HOBT各0.4mmol和NMM 0.6mmol溶于适量DMF中，将其加入到反应器中，于40℃左右振摇2hr，滤除反应液，以甲醇、DMF、交替洗涤树脂各2次，用无水乙醚洗一次。用20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc基。反应10min，滤除反应液甲醇、DMF交替洗涤树脂各2次。进行下一个氨基酸残基的偶联。如此依次由C端第一个氨基酸向N端延伸，直到肽链组装完成。合成好的多肽经过G10柱脱盐和HPLC纯化，冷冻干燥保存。其纯度分别为95.73％、95.10％、86.64％，将其溶解于DMSO中，浓度为20mmol/L。
实施例2、三个具有代表性肽的GST融合表达和纯化根据3号、6号、7号肽的DNA序列分别合成互补片段，退火后将其分别连接入pGEX-KG载体的EcoRI/BamHI酶切位点处并转化DH-5α感受态细胞。各挑取数个单菌落进行PCR鉴定，并测序。将经鉴定正确的重组菌菌液按1∶100接种于含有氨卞青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6-1.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG诱导表达3h，离心去上清，菌体可进行纯化或冻存于-20℃；将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS超声缓冲液中，在超声破碎仪上冰浴超声裂解；将超声处理后的菌液于4℃，12,000r/m离心15min，其间将Glutathione Sepharose 4B亲和纯化树脂用10倍柱体积的PBS平衡；将离心上清上柱，使GST-结合肽融合蛋白与树脂结合；用10倍柱体积PBS洗去非特异结合的杂蛋白。用10mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定其纯度达到95％以上，纯化蛋白经蒸馏水充分透析去除还原型谷胱甘肽后冻干于-20℃保存。
实施例3、A、ELISA方法检测噬菌体展示肽与TNF-α的特异性结合将浓度为10μg/ml的TNF-α(PBS稀释)包被于96孔酶联板，100μl/孔，4℃孵育过夜；加入200μl/孔1％BSA(PBS稀释)室温封闭1小时；加入1×1011pfu/ml的噬菌体克隆(PBS稀释)100μl/孔(除不包被的对照孔外，设置加噬菌体同时加入终浓度为170μg/mlTNF-α的对照孔，以检测噬菌体与TNF-α的特异性结合。)，室温结合1小时；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗涤三遍后加入抗噬菌体的兔血清(1∶1万稀释于PBS中)100μl/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤三遍后加入HRP标记的羊抗兔IgG(按产品说明书要求稀释于PBS中)100μl/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤三遍后加入显色液100μl/孔避光显色5-10分钟，加入1mol/L H2SO450μl/孔终止反应，立即测定OD450。
B、ELISA方法检测GST融合肽与TNF-α的特异性结合同样将浓度为10μg/ml的TNF-α(PBS稀释)包被于96孔酶联板，100μl/孔，4℃孵育过夜；加入200μl/孔1％BSA(PBS稀释)室温封闭1小时；加入0.5μmol/L的GST融合肽(PBS稀释)100μl/孔(除不包被的对照孔外，设置加GST融合表达肽同时加入系列浓度的TNF-α作为对照，以检测GST融合肽与TNF-α的特异性结合。)，室温结合1小时；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗涤三遍后加入抗GST的单克隆抗体(1∶1千稀释于PBS中)100μl/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤三遍后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(按产品说明书要求稀释于PBS中)100μl/孔，室温孵育1小时；PBST洗涤三遍后加入显色液100μl/孔避光显色5-10分钟，加入1mol/L H2SO450μl/孔终止反应，立即测定OD450。
实施例4、GST融合肽及合成肽的竞争性受体结合抑制实验将浓度为250ng/ml的TNFR1(PBS稀释)包被于96孔可拆卸酶联板，100μl/孔，4℃孵育过夜；加入200μl/孔1％BSA(PBS稀释)室温封闭1小时；用1％BSA(PBS稀释)将GST融合肽或合成肽进行倍比稀释，分别加入等体积125I-TNFα(含1％BSA的PBS稀释，终浓度为2nmol/L，并以加入终浓度为2nmol/L125I-TNFα+600nmol/L非标记TNFα作为非特异对照(N)，以加入终浓度为2nmol/L125I-TNFα作为总结合(T))，混匀后加入上述包被TNFR1的孔中，100μl/孔，室温孵育3小时；用含1％BSA的PBS 200μl/孔洗涤三次，每次15分钟，采用γ计数仪测定每孔放射强度(cpm)，TNF结合肽对TNFα与TNFR1结合的抑制百分数计算公式为「cpm(T-N)-cpm(样品-N)」/cpm(T-N)×100％。
实施例5、GST融合肽对TNF细胞毒活性的抑制实验将MCF-7细胞传于96孔细胞培养板，4×104cells/孔，50μl/孔，37℃，5％CO2培养箱中贴壁3小时；加入终浓度为1μg/ml的放线菌素D(DMEM/5％FBS稀释)，50μl/孔；用DMEM/5％FBS系列稀释GST融合肽，加入等体积适当浓度的TNFα(DMEM/5％FBS稀释)，混匀后加入上述细胞板中，100μl/孔，设置空白对照(D)、TNFα对照(T)和过量TNFα对照，37℃，5％CO2培养箱中孵育20小时；用PBS洗涤两到三次，加入100μl/孔结晶紫溶液(25％乙醇配制)，37℃放置15分钟；用自来水冲洗细胞板，扣干后加入100μl/孔30％HAC溶液，混匀后以加入过量TNFα的孔作为零对照，测定OD595，TNF结合肽对TNFα细胞毒活性的抑制百分数计算公式为(OD样品-ODT)/(ODD-ODT)×100％。
权利要求
1.具有以下通式结构的肿瘤坏死因子拮抗肽X1-X2-X3-X4-His-X6-Glu-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14式中，X1可以是任何氨基酸残基，也可以缺失；X2可以是任何氨基酸残基，最好是酪氨酸残基(Tyr)；X3可以是任何氨基酸残基，最好是碱性氨基酸残基，包括精氨酸残基(Arg)和赖氨酸残基(Lys)；X4可以是任何氨基酸残基，最好是亮氨酸残基(Leu)或脯氨酸残基(Pro)；X6可以缺失，也可为侧链基团较小的氨基酸残基，如甘氨酸残基(Gly)或丙氨酸残基(Ala)；X8为亮氨酸残基(Leu)或异亮氨酸残基(Ile)；X9代表芳香族氨基酸残基，包括色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)和酪氨酸残基(Tyr)；X10可以是任何氨基酸残基；X11可以是任何氨基酸残基；X12代表芳香族氨基酸残基，包括色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)和酪氨酸残基(Tyr)；X13可以是任何氨基酸残基，也可以缺失；X14可以是任何氨基酸残基，也可以缺失。
2.根据权利要求1的肿瘤坏死因子拮抗肽，其特征在于式中X2是酪氨酸残基(Tyr)；X3是碱性氨基酸残基；X4是亮氨酸残基(Leu)或脯氨酸残基(Pro)；X6为侧链基团较小的氨基酸残基；X8为亮氨酸残基(Leu)或异亮氨酸残基(Ile)；X9代表芳香族氨基酸残基；X12代表芳香族氨基酸残基。3.根据权利要求2的肿瘤坏死因子拮抗肽，其特征在于式中X3是精氨酸残基(Arg)或赖氨酸残基(Lys)；X6为甘氨酸残基(Gly)或丙氨酸残基(Ala)；X9代表色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)或酪氨酸残基(Tyr)；X12代表色氨酸残基(Trp)、苯丙氨酸残基(Phe)或酪氨酸残基(Tyr)。
4.根据权利要求1的肿瘤坏死因子拮抗肽，其特征在于其氨基酸序列为NYRLH-ELYQSWH。
5.根据权利要求1的肿瘤坏死因子拮抗肽，其特征在于其氨基酸序列为VPPLH-ELYLMYT。
6.根据权利要求1的肿瘤坏死因子拮抗肽，其特征在于其氨基酸序列为QPLH-EIFFHFMY。
7.权利要求1、2、3、4、5、6中任意一项的肿瘤坏死因子拮抗肽在医药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一组肿瘤坏死因子拮抗肽，它们具有下述通式氨基酸序列X1－X2－X3－X4－His－X6－Glu－X8－X9－X10－X11－X12－X13－X14，式中X1、X2、X3、X4、X10、X11、X13、X14可以是任何氨基酸，X1、X13和X14可以缺失；X2最好是酪氨酸(Tyr)；X3最好是碱性氨基酸，包括精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)；X4最好是亮氨酸(Leu)或脯氨酸(Pro)；X6位氨基酸可以缺失，但也可插入非极性氨基酸，如亮氨酸(Leu)或丙氨酸(Ala)；X8代表亮氨酸(Leu)或异亮氨酸(Ile)；X9、X11代表芳香族氨基酸，包括色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)。本发明的物质在体外和体内均能抑制肿瘤坏死因子的活性，能用于肿瘤坏死因子的检测、纯化和相关疾病的治疗等。
文档编号A61K38/08GK1445237SQ02104459
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月19日 优先权日2002年3月19日
发明者张 杰, 薛沿宁, 郑莉, 赵安, 高波, 王会信 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所