一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽药物，具 体涉及ρ38 α拮抗肽突变体PT5-4及其在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 缺血性心脏病是导致人类死亡的主要原因，在治疗上，早期成功恢复心肌再灌注 是改善临床转归的最有效方法。但缺血心肌恢复血流的过程可造成损伤，这一现象称为心 肌缺血 / 再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)。。I/R 将会带 来一些不良效应，例如氧化应激，细胞内钙超载等，这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。细 胞凋亡是缺血再灌注组织损伤功能丧失的重要原因，它是一个很复杂的过程，其详细的触 发机制尚不完全明确。
[0003] 研宄表明，在缺血再灌注过程中TABl与ρ38 α相互作用以及TABl介导的ρ38 α 旁路活化在其中起关键作用。细胞内存在有许多能与TABl和ρ38α发生相互作用的分子， 我们希望获得能够特异性的阻断ΤΑΒ1/ρ38 α结合的能力，而不会对ΤΑΒ1、ρ38 α与其他蛋 白质的相互作用产生影响的ρ38α拮抗肽。目前，能够有效降低心肌缺血再灌注损伤的干 预策略和治疗药物还非常有限。因此本发明的进行可以为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供 一种具有临床应用价值的候选药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种ρ38 α拮抗肽突变体ΡΤ5-4。经GST-pull实验和 Kinase assay实验证明：PT5突变体PT5-4对于TABl与ρ38α相互作用的抑制能力更强， 但是同时ΡΤ5突变体ΡΤ5-4并不影响ρ38 α经典活化途径中ΜΚΚ6/ρ38 α的相互作用。所 述的"相互作用的抑制"包括结合抑制以及自身磷酸化的抑制。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种ρ38 α拮抗肽突变体，所述突变体命名为ΡΤ5-4,所述ΡΤ5-4的 氨基酸序列为以下组中的任意一个：
[0007] (1)如SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列；
[0008] (2)在SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
[0009] 优选地，所述PT5-4的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0010] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0011] 本发明的ρ38 α拮抗肽突变体PT5-4也包括对SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的 非保守修饰，只要经过修饰的多肽仍然能够保留P38 α拮抗肽突变体PT5-4的生物学活性 即可。在此类修饰中突变的氨基酸数目是3个或者更少。
[0012] 本发明还提供了一种编码上述突变体的DNA分子。
[0013] 本发明提供了一种重组载体，所述载体包括前面所述的DNA分子。
[0014] 所述重组载体可以是病毒载体或者非病毒载体。
[0015] 非病毒载体包括但不限于线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA载体。
[0016] 本发明的病毒载体包括但不限于腺病毒载体（adenoviral vectors)、腺相关病 毒载体（adeno-associated viral vectors)、反车专录病毒载体（retroviral vectors)、 单纯疱疼病毒载体（herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒载体（lentiviral vectors)〇
[0017] 如本文中所使用，术语"载体"应理解为意指包含了能够并入到宿主细胞中并与宿 主细胞基因组重组并整合到宿主细胞基因组中，或作为游离体自主复制的核苷酸序列的任 何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA载体、病毒载体等。
[0018] 在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核（如 大肠杆菌等细菌）、低等真核细胞（如酵母）、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。 总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有 复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
[0019] 本发明还提供了包含上述重组载体的宿主细胞。
[0020] 进一步，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏 菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、C0S、293细胞、 或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0021] 本发明还提供了前面所述的PT5-4突变体在制备抑制TAB1/P38 α相互作用的药 物中的应用。
[0022] 本发明还提供了编码ΡΤ5-4突变体的DNA分子在制备抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 的药物中的应用。
[0023] 本发明还提供了包含编码ΡΤ5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备抑制TABl/ ρ38α相互作用的药物中的应用。
[0024] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备抑制ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用的药物中的应用。
[0025] 本发明还提供了前面所述的ΡΤ5-4突变体在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用导致 的疾病的药物中的应用。
[0026] 本发明还提供了编码ΡΤ5-4突变体的DNA分子在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 导致的疾病的药物中的应用。
[0027] 本发明还提供了包含编码ΡΤ5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗TABl/ ρ38α相互作用导致的疾病的药物中的应用。
[0028] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用导致的疾病的药物中的应用。
[0029] 本发明还提供了前面所述的ΡΤ5-4突变体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药 物中的应用。
[0030] 本发明还提供了编码PT5-4突变体的DNA分子在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的 药物中的应用。
[0031] 本发明还提供了包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体在制备治疗心肌缺 血再灌注损伤的药物中的应用。
[0032] 本发明还提供了包含前面所述的重组载体的宿主细胞在制备治疗心肌缺血再灌 注损伤的药物中的应用。
[0033] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的PT5-4突变 体、编码PT5-4突变体的DNA分子、包含编码PT5-4突变体的DNA分子的重组载体、或包含 前面所述的重组载体的宿主细胞。
[0034] 进一步，本发明的所述药物组合物还包含一种或多种对本领域技术人员而言为 公知的其它药学上可接受的成分，该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋 形剂、佐剂、缓冲剂、PH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂、稳定剂、悬浮剂、增溶剂、表面活 性剂（例如润湿剂）、着色剂和致等渗（isotonicizing)溶质（即其使制剂与目标患者的 血液或其它相关的体液等渗）。适当的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学书籍中找 到。参见，例如药物添加剂手册（Handbookof Pharmaceutical Additives)，第二版（编者 M.Ash 和 I. Ash)，2001(Synapselnformation Resources, Inc. ,Endicott, New York,USA)； Remington' sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.， 1990;以及药物赋形剂手册（Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第二版，1994。
[0035] 文中使用的术语"药学上可接受的"涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们 在医学判断的合理范围内，适于与上述患者（例如人类）的组织接触，并未带来过度的不希 望的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并有合理的益处/风险比。每种载体、稀 释剂、赋形剂等还必须就与组合物的其它成分可配伍的意义而言是"可接受的"。
[0036] 本发明的药物组合物可以通过常规途径给药，包括但不局限于静脉内，腹膜内，眼 内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸 入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些 情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
[0037] 根据药物组合物的施用形式，可将药物组合物制备成相应的各种剂型，所述剂型 包括但不限于药物组合物被制备为胃肠外、经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、 溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0038] 供治疗的受试者为经历心肌缺血再灌注损伤的患者，受试者包括但不限于哺乳动 物。就治疗目的而言，"哺乳动物"指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养和农用动物， 以及动物园动物（zoo animal)、运动动物（sports animal)和宠物，如狗、马、猫、母牛等。 优选地，所述哺乳动物是人。
[0039] 应了解，用于任何特定受试者的治疗剂量水平和剂量频率可以变化，并且将取决 于多种因素，包括所用药物组合物的活性；该药物组合物的代谢稳定性和作用时间长度； 受试者的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式和时间；排泄速率和清 除率；药物组合；及特定病状的严重程度。
[0040] 本发明的药物组合物可以单独使用，或与可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的其它 适合的治疗剂组合使用。或者与其他治疗心肌缺血损伤手术方法一起使用。
[0041] 本文所用的"进行治疗"或"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类 中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
[0042] (i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中