黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了黄连素在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，本发明从细胞核分子层面对黄连素抗心肌自噬作用做了评价，表明黄连素能有效的提高经缺氧再复氧处理后的心肌细胞活力，并且它的这种保护作用是通过抑制细胞自噬水平达到，且黄连素能有效的提高心肌缺血再灌注后心功能水平，减少心肌梗死面积，这种保护作用也是通过抑制心肌自噬水平发达到，另研究结果表明黄连素能有效的抑制p-AMPK(Thr172)以及p-mTOR(Ser2481)这条信号通路，为其进一步开发应用奠定了良好的基础，多方面、多层次证实了黄连素具有抗心肌缺血再灌注的保护作用。
【专利说明】黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄连素，又名小蘗碱，是一种异喹啉衍生化的生物碱，它可从多种中草药如白毛 茛、黄柏、黄连等中分离，是这些中草药的主要成分。迄今为止，黄连素在临床上一直作为非 处方药治疗如痢疾杆菌、大肠杆菌引起的肠道感染、腹泻；除此之外，国内外许多药理学研 究发现黄连素具有抗肿瘤、降血糖降血脂、抑制内皮细胞凋亡及血管平滑肌细胞增殖以及 调节免疫系统、抗心力衰竭、抗心律失常以及抗动脉粥样硬化等功效。上述所列出的以往研 究结果，不仅扩大了黄连素的应用范围，也提示黄连素的药理作用具有多种生物活性，但是 目前对黄连素在心肌缺血再灌注方面的研究几乎近于空白。鉴于黄连素来源广泛、价格低 廉，加之毒副作用小，如能对其相关药理效应及其作用机制进行深入研究，有望为缺血再灌 注损伤的防治提供一种有效、安全、价廉的新型药物。
[0003] 目前黄连素的应用领域局限于抗感染、肿瘤、调整血脂血糖以及抗动脉粥样硬化 炎症反应等方面的研究，但是针对心肌缺血再灌注损伤过程的自噬调节，国内外研究一直 少有涉及。缺血再灌注造成心肌细胞损伤的机制尚未完全阐明，目前公认的机制可能为：细 胞线粒体功能失衡、细胞内钙离子超载、大量活性氧自由基产生等，最终导致细胞死亡。一 般认为，在心肌缺血再灌注损伤中导致心肌细胞死亡的形式只有凋亡和坏死两种形式，但 近年研究证实心肌细胞内存在第三种机制调控心肌细胞的存活或死亡，即自噬作用。它与 凋亡类似，通过启动细胞内部信号通路，形成级联式信息传导和相应基因表达，诱导细胞死 亡。然而，有幸的是，这些调控细胞死亡的不同方式在过程上具有可干预性，在时间上有延 迟性，这为寻求抑制细胞死亡的途径或方法提供了空间，而以往对黄连素的研究在这些方 面的效应均未予以探及。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是基于黄连素原来临床应用及其他领域研究的基础，提供黄连素在 治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，为缺血再灌注损伤的防治提供一种有效、安全、价 廉的新型药物。
[0005] 本发明通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明通过以下方法研究黄连素在心肌缺血再灌注损伤过程中的保护作用，寻找 黄连素在缺血性心脏病领域旧药新用的研究依据：
[0007] 1)通过构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，证实黄连素对心肌细胞自噬水平的影 响，说明黄连素能有效的提高经缺氧再复氧处理后的心肌细胞活力，并且它的这种保护作 用是通过抑制细胞自噬水平达到。具体步骤为：
[0008] a.心肌细胞经缺氧再复氧处理后，观察黄连素对自噬水平的影响，采用CCK-8检 测细胞活力，ATP试剂盒检测细胞ATP含量。
[0009] b.电子显微镜观察各组细胞内自噬体/自噬泡的形成数量，Westernblot检测各 组细胞的自噬相关蛋白变化（LC3-II/LC3-I比值）。
[0010] 2)构建在体心肌缺血/再灌注模型，证实黄连素对心肌细胞自噬水平的影响，说 明黄连素能有效的提高心肌缺血再灌注后心功能水平，减少心肌梗死面积，且黄连素是通 过抑制心肌自噬水平发挥心脏保护作用。具体步骤为：
[0011] a.将实验S-D大鼠分为假手术组和自噬抑制组：假手术组，仅开胸，于前降支放 结扎线但不结扎，缺血再灌注组，缺血30min，再灌注180min，缺血再灌注+黄连素干预组， 术前2h腹腔内注射黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min ;缺血再灌注 +低剂量（5mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血 30min，再灌注180min ;缺血再灌注+高剂量（10mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射 黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min ;
[0012] b.分别行心功能检测：持续记录分析左心室舒张末压（LVEDP)、左心室收缩峰压 (LVPSP)、LVDP ;
[0013] c. Evansblue、TTC双重染色法测定心肌梗死面积：在再灌注快结束时，重新结扎 前降支，从尾静脉注射3mlEvans蓝液，然后处死大鼠，取出心脏，TTC染色，非缺血区为蓝 色，梗死区为白色，缺血区为红色，判断黄连素对心肌梗死范围的影响。
[0014] d. Westernblot检测各组细胞的自噬相关蛋白变化（LC3-II/LC3-I比值）。
[0015] 3)通过 Westernblot 方法检测 Beclinl、Bnip3、SirTl、AMPK、p_AMPK(Thrl72)、 mT0R、p-mT0R(Ser2481)等蛋白表达水平，研究黄连素影响心肌细胞缺血再灌注损伤自噬水 平的分子机制，明确黄连素影响心肌细胞缺血再灌注过程中自噬的分子机制和信号传导通 路。
[0016] 结果表明黄连素有效的抑制p_AMPK(Thrl72)以及p-mT0R(Ser2481)这条信号通 路，从而在细胞和分子水平上能抑制心肌自噬水平发挥保护作用，表明该药物具有开发成 对治疗心肌自噬的有效药物而应用于临床。
[0017] 本发明公开了一种黄连素在作为制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，从 细胞核分子层面对黄连素抗心肌自噬作用做了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基 础，多方面、多层次证实了黄连素具有抗心肌缺血再灌注的保护作用。
[0018] 由于黄连素具有一定的抗感染和炎症作用，在临床上用于长炎性疾病有很好的应 用基础，而心肌缺血再灌注发生的过程中长伴随有炎症，故该药物在治疗病毒性疾病的同 时对病毒所引起的炎症等症状具有较好的缓解和辅助治疗作用。
[0019] 目前黄连素主要应用于抗感染、肿瘤、调整血脂血糖以及抗动脉硬化炎症反应，通 过现阶段常用药物制剂手段，可以将其制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂进行口服 或者注射液，在治疗心肌缺血再灌注损伤及其并发症的药物中加入该成分或在治疗过程中 联合用药使用。
[0020] 本发明的有益效果为：目前我国心血管疾病患者人数已超过2. 7亿，已成为我国 城市和农村人口的第一大死因，心血管疾病治疗费用每年以18. 5%的速率递增，其中，心肌 梗死和卒中费用负担已超过非传染性疾病总负担的50%。随着介入治疗的发展和普及，心 肌梗死等疾病得到了很好的医治，但由此带来的再灌注损伤却增加了患者的医疗负担。黄 连素作为祖国传统中药，对缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，因此本项目有望为心肌 缺血再灌注损伤的防治提供新思路，为患者带来福音。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明技术方案做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的 较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用 上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内 容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本 发明的保护范围内。
[0022] 实施例1黄连素对心肌细胞活力的影响
[0023] 试验方法：构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，证实黄连素对心肌细胞自噬/凋 亡水平的影响。
[0024] 通过以下步骤完成：
[0025] 1)心肌细胞H9c2铺六孔板，待细胞密度达80%时，加入自噬抑制剂（3-MA)预处 理1小时（作为阳性对照），再加入Berberine (20 μ M)处理1小时，换无糖无血清的DMEM 后放入低氧培养箱（〈1% 02、5% C02、约95% Ν2)处理3小时，拿出六孔板放常氧培养箱复 氧4小时，建立体外心肌细胞缺氧再复氧模型，用于后续检测
[0026] 2)采用（1)中建立的方法后用CCK-8检测细胞活力。心肌细胞经缺氧再复氧处理 后细胞活性下降，加用3-MA (自噬抑制剂）后细胞活性增加，提示缺氧再复氧过程中自噬不 利于细胞存活，用黄连素处理后细胞活性增加，提示黄连素可能通过抑制自噬从而达到保 护心肌的作用。
[0027] 3)采用⑴中建立的方法后用ΑΤΡ检测试剂盒检测细胞ΑΤΡ含量，操作过程按照 试剂盒的说明书进行。结果的趋势与CCK-8的结果一致，提示我们缺氧再复氧导致细胞内 ΑΤΡ供应发生障碍，应用自噬抑制剂3-ΜΑ能提高细胞内ΑΤΡ的含量，同样的加用黄连素后能 有效的提高细胞内ΑΤΡ含量，起到保护细胞的功效。
[0028] 4)采用（1)中建立的方法后用电子显微镜观察各组细胞内自噬体/自噬泡的形成 数量，心肌细胞经缺氧再复氧处理后，细胞内自噬体明显增多，而黄连素处理后自噬小体数 减少；用Westernblot检测各组细胞的自噬相关蛋白变化（LC3-II/LC3-I比值），LC3-II/ LC3-I比值在缺氧再复氧组表达明显增加，而黄连素能剂量依赖性的减少LC3-II/LC3-I比 值，结合电镜和Westernblot结果，我们发现黄连素能减少心肌细胞缺氧再复氧过程中自 噬的水平。
[0029] 以上实验结果表明黄连素能有效的提高经缺氧再复氧处理后的心肌细胞活力，并 且它的这种保护作用是通过抑制自噬水平达到。
[0030] 实施例2黄连素对在体心脏功能的影响
[0031] 试验方法：构建在体心肌缺血/再灌注模型，证实黄连素对心肌细胞自噬水平的 影响。
[0032] 通过以下步骤完成：
[0033] 1)将实验S-D大鼠进行分组，如下：
[0034] a.假手术组，仅开胸，于前降支放结扎线但不结扎；
[0035] b.缺血再灌注组，缺血30min，再灌注180min ;
[0036] c.缺血再灌注+低剂量（5mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然后 前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min ;
[0037] d缺血再灌注+高剂量（10mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然 后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min ;
[0038] 2)分别进行心功能检测：持续记录分析发现缺血再灌注组较假手术组的左心 室收缩峰压（LVPSP)、左心室舒张末压（LVEDP)分别从2. 30±0. 27mmand3. 56±0. 30_ 增加到了 3. 51 ±0. 17mmand4. 80±0· 14mm,左室短轴缩短率（fractionalshortening， FS)和射血分数（ejectionfraction，EF)分别从 37. 75±4· 82and69. 57±6· 85 下降 到了 16. 18±2. 30and31.30±3. 95,加用低剂量（5mg/kg)的黄连素后 LVPSP 和 LVEDP 分别降低至2. 92 ± 1. 70mmand4. 22 ± 0. 28mm，FS和EF较缺血再灌注组分别提高到了 24. 96±1. 34and49. 70±3. 46 ;高剂量（5mg/kg)的黄连素也具有类似的保护作用。
[0039] 3)Evansblue、TTC双重染色法测定心肌梗死面积：在再灌注快结束时，重新结扎 前降支，从尾静脉注射3mlEvans蓝液，然后处死大鼠，取出心脏，TTC染色，非缺血区为蓝 色，梗死区为白色，缺血区为红色，缺血再灌注组心肌白色面积明显多于较假手术组，而加 用高低剂量的黄连素处理后白色梗死面积相应的减少。
[0040] 4) Westernblot检测各组组织的自噬相关蛋白变化（LC3-II/LC3-I比值）， LC3-II/LC3-I比值在缺氧再复氧组表达明显增加，高低不同剂量的黄连素均能减少 LC3-II/LC3-I 比值。
[0041] 以上实验结果表明，黄连素能有效的提高心肌缺血再灌注后心功能水平，减少心 肌梗死面积，且黄连素是通过抑制心肌自噬水平发挥心脏保护作用。
[0042] 实施例3黄连素针对心肌缺血再灌注损伤的相关分子机制
[0043] 实验目的：探究黄连素影响心肌细胞缺血再灌注损伤自噬水平的分子机制。
[0044] 1)细胞以及实验动物分组与处理同实施例1和实施例2。
[0045] 2)细胞或心脏经缺氧再复氧或缺血再灌注处理后提取总蛋白，Westernblot方法 检测 Beclinl、Bnip3、SirTl、AMPK、p-AMPK(Thrl72)、mT0R、p-mT0R(Ser2481)等蛋白表达水 平，黄连素能有效的抑制Beclinl、Bnip3、SirTl等自噬相关蛋白的表达；免疫组化的结果 与Westernblot的结果抑制；黄连素能通过阻断p-AMPK(Thrl72)/p-mT0R(Ser2481)这条信 号通路，从而抑制心肌自噬水平发挥保护作用。
【权利要求】
1. 黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于：该药物制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、 分散剂或注射液。
【文档编号】A61P9/10GK104188967SQ201410382825
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】黄周青, 黄伟剑, 叶浡之, 单培仁, 孔繁奇, 吴圣杰 申请人:温州医科大学附属第一医院