进 行双酶切，PGEX-KG 空载体为 5. OKbp，TABl 为 1514bp ;pET-32a 空载体为 5. 9Kbp，ρ38 α 为 1197bp。从图1可以看出，酶切后条带大小与目的片段大小相符，结果说明目的片段TABl 和ρ38α成功插入载体中。
[0109] 2. 2序列比对结果
[0110] pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α重组质粒送北京天一辉远公司测序，测序结果与 TABl和ρ38 α序列进行比对，均为100%匹配，测序结果证明两个质粒构建成功。
[0111] 实施例2融合蛋白的纯化
[0112] 1、常用试剂的配制
[0113] 1)NETN Lysis Buffer ：2mM PMSF,5mM Benzamidine,ImM DTT,ImM Aprotinin,ImM Leupeptine，去离子水定容。
[0114] 2) NETN Buffer :20mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOOmM NaCl，ImM EDTA，0. 5% NP-40,临 用前加入1% PMSF，去离子水定容。
[0115] 3)纯化蛋白洗脱缓冲液（GST Elution Buffer) :50mM Tris-HCl (pH8.0)，20mM Glutathione，去离子水定容。
[0116] 4)1^8-甘氨酸电泳缓冲液：25111111〇1/11^8碱，25〇111111〇1/1甘氨酸（电泳级）， 0.1 % SDS，可配成5 X贮存液备用。
[0117] 5)考马斯亮蓝染液（IL):考马斯亮蓝R2502.0g，考马斯亮蓝G2500. 5g，甲醇 50ml，乙醇425ml，冰醋酸100ml，双蒸水定容至1L。
[0118] 6)考染脱色液（IL):冰醋酸100ml，乙醇200ml，双蒸水700ml。
[0119] 其他常用试剂的配制同前所述。
[0120] 2、GST融合蛋白纯化方法
[0121] 2. 1收集菌液并裂解菌体
[0122] (1)将第一部分构建成功的pGEX-KG-TABl重组载体转化至感受态Rosetta中；
[0123] (2)挑取单克隆菌落转移至5ml氨苄抗性的LB培养基中，37 °C过夜震荡；
[0124] (3)将菌液转移至200ml氨苄抗性的LB培养液中；
[0125] (4)摇菌至 0D600nm ~ 0. 4,加入 IPTG(终浓度 0. 2mM) 16°C诱导过夜；
[0126] (5) 5000rpm 离心 IOmin 收集菌液，用 10ml NETN Lysis Buffer 重悬，加入 Iml 混 有溶菌酶的NETN Buffer，置冰上30~60min ;
[0127] (6)冰上超声破碎菌体。
[0128] 2. 2GSH beads 结合
[0129] (1)将混有菌体的裂解液转移到离心管中，4°C 1000 rpm离心lh，期间，将GSH beads (购自sigma)用PBS溶液置冰上溶胀30min，然后加 Iml NETN BufTer，6000rpm离心 30s以清洗beads，重复2次；
[0130] (2)裂解的上清转移至另一个离心管，加入500 μ1 GSH-beads，4°C摇晃令其吸附 蛋白lh。2500rpm，离心30s后弃上清；
[0131] (3)用 20ml 冰冷的 NETN Buffer (加 1 % 的 PMSF)洗 beads 3 次，3200rpm 离心 Imin弃上清（最后一次尽量去除所有上清）；
[0132] 2. 3 洗脱
[0133] 加入 500ul 新鲜配制的 GST Elution Buffer，4°C轻摇 20min 后 2500rpm离心 30s， 收集上清，重复1次。
[0134] 2. 4 浓缩
[0135] 将上清加入超滤管，用无菌PBS置换溶剂。用Loading tip枪尖分装到高压过的 EP管中，20 μ 1/管，_80°C保存。
[0136] 2. 5检测蛋白纯度
[0137] (1)将纯化的融合蛋白分别以不同的上样量进行SDS-PAGE
[0138] (2)用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色以检测蛋白纯度。
[0139] 3、His融合蛋白纯化方法
[0140] 3. 1收集菌液并裂解菌体方法同前。
[0141] 收集细菌后，与前面的区别为用IOml PBS结合缓冲液（20mM的磷酸盐缓冲液，含 500mM NaCl)重悬细菌。
[0142] 3. 2固定Ni2+离子亲和色谱法
[0143] (1)结合菌体裂解后1000 Orpm离心30min，取上清过镍柱，检测A280,直至A280值 小于0. 01
[0144] (2)洗脱用IOmM的洗脱缓冲液（结合缓冲液加 IOmM咪唑）洗柱子，流速为l_2ml/ min，lml/管收集洗脱液，监测A280 ;为了得到更好的His融合蛋白，分别用50mM，lOOmM， 150mM不同浓度咪唑的洗脱缓冲液分阶段洗柱子，监测A280 ;
[0145] (3)超滤合并洗脱液，4°C，6000rpm离心，超滤浓缩；测蛋白浓度并进行SDS-PAGE， 考马斯亮蓝染色确定条带。
[0146] 4、结果
[0147] TABl蛋白分子量为56KDa，GST标签分子量为26KDa，故GST融合蛋白的分子量应 为82KDa。由图2可知，蛋白条带大致正确，表明GST融合蛋白纯化分离成功，用于下一部分 的实验。
[0148] ρ38 α分子量大小为38KDa，His标签分子量为28KDa，故His融合蛋白的分子量应 为66KDa。由图3可知，蛋白条带大致正确，表明His融合蛋白纯化分离成功，用于下一部分 的实验。
[0149] 实施例3 ρ38α拮抗肽突变体对ΤΑΒ1/ρ38α相互结合的阻断作用
[0150] 1、ρ38α拮抗肽突变体
[0151] ΡΤ1、ΡΤ5、ΡΤ5-1、ΡΤ5-2、ΡΤ5-3、ΡΤ5-4、ΡΤ5-5、ΡΤ5-6 由 Chinese P印tide Company 合成，肽的纯度均为95%以上。其中PTl是无功能的对照肽，实验中作为阴性对照；PT5是 先前工作获得的ρ38 α拮抗肽，在实验中作为阳性对照。PT5-1~PT5-6为设计的PT5的突 变体。所有的肽均使用无菌注射用水按lmg/ml溶解，50 μ 1/管分装保存于-20°C，避免反 复冻融。
[0152] PT5-1 突变体为 Gln3-Ala3, PT5-2 突变体为 Ser6Asn7-Ala6Ala7, PT5-3 突 变体为 Val5Asn7-Ala5Ala7, PT5-4 突变体为 Lys9Serici-Ala9Alaici, PT5-5 突变体为 ThrllAsp12-Ala11Ala12, PT5-6 突变体为 Glu13Gln14-Ala13Ala14,氨基酸序列如下：
[0153] PTl ： Ser-Ser-Ala-Gln-Ser-Thr-Ser-Arg-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Ser-Ser(SEQ ID NO. 1)；
[0154] PT5 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO. 2)；
[0155] PT5 突变体：
[0156] PT5-1 ：Gln-Gly-Ala-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 3)；
[0157] PT5-2 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 4)；
[0158] PT5-3 ：Gln-Gly-Gln-Val-Ala-Ser-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 5)；
[0159] PT5-4 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Ala-Ala-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 6)；
[0160] PT5-5 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Ala-Ala-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 7)；
[0161] PT5-6 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Ala-Ala-Ser (SEQ ID NO. 8) 〇
[0162] 注：标有下划线部位为突变位点。
[0163] 2、方法
[0164] 2. lGST-pull down
[0165] (1)向 NETN buffer 中加入抑制因子，PMSF ImM，Aprotinin 10 μ g/ml，DTTlmM， Na3VO4ImM(抑制因子均购自Sigma公司）；
[0166] (2) His_p38 α 和 GST-TABl 溶于含抑制因子的 NETN buffer 中；
[0167] (3)加入ρ38 α拮抗肽使之终浓度为50 μ M，4°C混旋2h ;
[0168] (4)加入 GSH Sarpharose beads，4°C继续混旋 Ih ;
[0169] (5)用含 PMSF ImM 的 NETN buffer 洗 beads 3 次，每次 NETN buffer 1ml，4°C混 旋 3min ;
[0170] (6)最后一次洗完后吸净液体，向珠子中加入2X蛋白上样缓冲液（loading buffer)，沸水中煮IOmin后上样。
[0171] 2. 2免疫印迹方法
[0172] (1)常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0173] (2)将胶中的蛋白转印到PVDF膜上，条件为60V，3h ;;
[0174] (3)抗体杂交：
[0175] 1)将滤膜转移至封闭液中，室温孵育Ih ;
[0176] 2)加抗体（一抗）：将一抗用5%的BSA 1:1000稀释后浸润滤膜，封接于塑料膜 内，放