专利名称：可溶性sars病毒核衣壳蛋白的表达和纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子和细胞生物学研究领域，具体涉及在宿主细胞中可溶性SARS病毒核衣壳蛋白(SARS Nucleocapsid protein)的表达和纯化。
背景技术：
自2002年底至2003年初，一种被称为“非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)”的病例在我国广东省被首次发现，随后在世界30多个国家和地区爆发，SARS在我国内地的北京、山西、内蒙等25个省市自治区“肆意横行”，对我国人民群众的生命财产构成严重威胁。SARS是一种传染性强、生存强、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累计报告病例已达7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公认为人类的共同敌人。SARS爆发后，引起了各国政府和研究机构的高度重视，世界卫生组织(WHO)已派遣技术人员前往疫区指导防治工作，各国科研人员紧密合作，共同寻找SARS的病原体和防治方法。经过多国科研人员的努力，终于发现SARS冠状病毒(Coronavirus)是SARS感染、病人发病和致死的元凶。SARS病毒的全基因组已分别被加拿大、美国和中国的科学家测定，这对于研究SARS病毒的致病机理以设计抗SARS药物具有重要意义。
核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，简称N蛋白)是冠状病毒(Coronavirus)的一种重要结构蛋白。在成熟的病毒颗粒中，N蛋白和RNA结合位于病毒颗粒的核心。N蛋白在冠状病毒的生理过程中有两个方面的作用1、在病毒包装的过程中和病毒RNA结合并与M蛋白(small membrane protein)相互作用使病毒RNA和N蛋白复合体被包裹进病毒衣壳中。2、在病毒RNA的转录和复制过程中与mRNA有相互作用，可能影响病毒RNA的转录和复制。在前一个过程中，存在一个N蛋白和病毒RNA相互识别的过程。N蛋白只会和完整的病毒RNA结合，也只有这样的复合体才会被M蛋白包裹起来。一般认为，N蛋白通过识别病毒RNA中一个CDS-orflab 3’端的一段核酸序列(packagingsignal)来区别完整的病毒RNA和RNA片断。在鼠肝炎病毒(murine hepatitisvirus)中的研究表明packaging signal位于病毒RNA 20304-20364的位置，长为69nt。对鼠肝炎病毒N蛋白的研究表明，N蛋白存在三个保守的区域(domain)，位于第二个区域中的一段序列(177-231)具有RNA结合活性，序列中存在SRXX的特征序列。因此N蛋白对于病毒基因组RNA特征性序列的识别及其与其他结构蛋白的相互作用，对于病毒粒子的准确组装有着重要意义。
SARS冠状病毒N蛋白是结构蛋白质区第二大编码蛋白，长度为423个氨基酸。通过对50种N蛋白的进化树分析，这50种N蛋白分成三枝，而SARS的N蛋白并不属于这三枝，因此从由N蛋白构建的进化树中可以看出SARS在进化上是一个特殊的病毒。通过对SARS病毒(SARS virus)、人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E)、鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus)、鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectiousbronchitis Virus)的N蛋白的氨基酸序列比对，尽管N蛋白整体氨基酸同源性很低，但是存在两个保守氨基酸集中的区域，其生物学意义不明。经同源比较发现SARS病毒N蛋白的178-205aa位，也就是在第一个保守氨基酸集中区域的末尾，存在一个SRXX富集区，而鼠肝炎病毒的相应区域正好是其RNA结合区，因而推测该区域有可能是SARS病毒N蛋白的RNA结合区的一部分。
另外研究还发现，在N蛋白373-389位附近，存在一个赖氨酸富集区(KKKKTDEAQPLPQRQKK/KTFPPTEPKKDKKKKTD)，该区域符合核转移信号的基本特征。这一特征的生物学意义尚不能确定，既有可能是N蛋白核病毒RNA相互作用的证据，也可能意味着N蛋白能转运进入宿主细胞核内，发挥某种核蛋白的作用。上述推测，还有待更进一步的实验予以证实。
因此，在体外大量表达和纯化可溶性SARS病毒N蛋白以探索其重要的生物学功能将具有重要的理论和现实意义。本发明者经过反复实验利用实验过程中所积累的独特相关技术经验，在宿主细胞中成功表达和纯化了可溶性SARS病毒N蛋白，从而完成了本发明。
本发明的一个目的是提供能够在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的表达质粒。
本发明的另一个目的是提供用该表达质粒转化的宿主细胞。
本发明的再一个目的是提供可溶性SARS病毒N蛋白在宿主细胞中的表达方法。
本发明的还有一个目的是提供SARS病毒N蛋白表达产物的纯化方法。
发明内容
本发明的一个方面提供可在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的表达质粒N-pQE30，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类名称为大肠杆菌M15/pQE30-SARS-N，保藏日2003年5月30日，保藏号CCTCC No.M203046。
本发明的另一个方面提供用质粒N-pQE30转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
本发明的再一个方面提供在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步骤1)采用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；2)用pQE30载体构建SARS病毒N蛋白表达质粒pQE30-N；3)将pQE30-N质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
本发明的还有一个方面提供可溶性SARS病毒N蛋白表达产物的纯化方法，包括细胞裂解、裂解液透析、NTA-Ni柱层析和分子筛纯化。
附图的简单说明
图1所示为可溶性SARS病毒N蛋白表达质粒(N-pQE30)构建示意图。
图2所示为SARS病毒N蛋白PCR产物DNA电泳分析图谱。
图3所示为克隆产物的PCR鉴定图。
图4所示为克隆产物的酶切鉴定图。
图5所示为N-pQE30测序报告。
图6所示为SARS病毒N蛋白纯化产物蛋白质聚丙烯酰胺电泳分析图谱。图中，M为标记物(Marker)；E2，含咪唑的N蛋白粗提物；E3-E6为经分子筛纯化后的N蛋白。
图7所示为SARS病毒N蛋白纯化产物液质联用总离子流图。
具体实施例方式
实施例1 SARS病毒N蛋白表达质粒(N-pQE30)的构建利用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒N蛋白DNA片段(基因序列依据TRO2)，按图1所示，构建表达可溶性的SARS病毒N蛋白的表达质粒(N-pQE30)。
1)设计引物，扩增N蛋白的序列引物序列FW5’ATTAGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCA 3’RV5’TTAAGTCGACTGCCTGAGTTGAATCAGCAGA 3’PCR扩增反应(100μl)模板2μl；10×缓冲液(PyrobesTMbuffer)10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μl；水71μl。
反应条件95℃ 8分钟；(95℃ 1分钟；60℃ 1分钟；72℃ 2分钟)30循环；72℃ 10分钟。
图2所示为SARS病毒N蛋白PCR产物DNA电泳分析图谱。
2)将N的PCR产物克隆到pQE30载体上N的PCR产物和pQE30分别用BamHI和SalI酶切(实验方法参照《分子克隆》第二版)；用试剂盒(华舜公司)回收酶切产物(回收N的PCR酶切产物近1300bp；pQE30酶切产物近3.5kb)；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞M15；挑选正确的克隆(PCR筛选和酶切鉴定)。
PCR鉴定利用N蛋白的特异性引物筛选正确的克隆。正确的克隆应扩增出近1300bp的片段(实验方法和以上PCR反应的方法一致)。结果，在克隆产物的PCR鉴定图(图3)上显示有正确的克隆。
酶切鉴定(实验方法参照《分子克隆》第二版)HindIII在基因内部353bp，在载体上也有一个HindIII的酶切位点，正确的克隆应切出一条900bp左右的片段。经进一步酶切鉴定结果显示，确实有正确的克隆(见图4)。
DNA测序报告N-pQE30表达载体测序报告如图5所示，N-pQE30DNA测序结果和N蛋白原DNA序列比较，第1125位(以N蛋白原序列的序列号为准)的G，在所测的11号克隆中相应处为A，这个碱基位于密码子的第三位，并不影响氨基酸编码。
实施例2 可溶性SARS病毒N蛋白的表达将N-pQE30质粒转化于大肠杆菌M15中，IPTG(浓度0.8mM)诱导，氨苄西林和卡那霉素为双抗生素，温度30℃，表达时间10小时。在上述表达条件下，6升LB培养基经4℃、4000rpm离心30分钟后，将得到的18克细菌沉淀物以每份3克分装，-80℃保存。
实施例3 表达产物的纯化在4℃下，将3克细菌沉淀物悬浮于15mL裂解缓冲溶液(50mMTris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF)中，超声波破碎(超声强度200～300W；超声环境冰水混合物；总超声时间15分钟，每超声1.5分钟间隙1分钟)。经4℃、15,000rpm超速离心1小时后，弃去沉淀物。将得到的14mL上清液在4℃下透析(透析缓冲液PBS，10mM咪唑)过夜后，用NTA-Ni柱(Pharmacia公司产品)纯化蛋白，其中洗涤缓冲液为，PBS+60mM咪唑；洗脱缓冲液为，PBS+500mM咪唑。将得到的10mL蛋白粗提物经蛋白纯化系统FPLC(Pharmacia公司产品)分子筛进一步纯化得到纯SARS病毒N蛋白(如图6所示)。
实施例4 SARS病毒N蛋白质谱检测1)N蛋白序列MRGSHHHHHH GSSDNGPQSN QRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPK QRRPQGLPNN60TASWFTALTQ HGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGD GKMKELSPRW120YFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGT RNPNNNAATVLQLPQGTTLP180
KGFYAEGSRG GSQASSRSSS RSRGNSRNST PGSSRGNSPA RMASGGGETA LALLLLDRLN 240QLESKVSGKG QQQQGQTVTK KSAAEASKKP RQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGD300QDLIRQGTDY KHWPQIAQFA PSASAFFGMS RIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKD360NVILLNKHID AYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQ 420NSMSGASADS TQAGRPAAKL N4412)N蛋白的酶解(胶内酶解)A.切下考马斯兰染色胶带，置于离心管中，用30％ACN/100mM NH4HCO3脱色至胶带呈无色透明状。
B.弃去上清，加入100mM的NH4HCO3(pH8.3)，平衡5分钟。
C.弃去上清，加入ACN脱水3分钟。
D.弃去上清，冷冻干燥。
E.将干燥好的胶用50mM NH4HCO3浸润，加入胰蛋白酶至酶物比为1∶30(W/W)；轻轻涡旋混合。
F.35℃保温，反应过夜。
G.吸出上清，置于另一离心管1。
H.用60％ACN(0.1％TFA)提取肽段三次，提取液与前一次的上清合并置于离心管。
J.浓缩至15μ1，进行LC-MS检测。
3)N蛋白液质联用(LC-MS)分析HPLC仪采用Agilent HP1100质谱仪LCQ Deca ion-trap质谱仪(Finnigan公司)液相柱C830×2.1mmID，Tum(AQUAPORE，RP-300)流动相AH2O(0.1％HCOOH)，BACN(0.1％HCOOH)
时间(分钟) A B0 95％ 5％2 95％ 5％15 85％ 15％35 50％ 50％45 5％ 95％47 5％ 95％53 95％ 5％60 95％ 5％质谱电喷雾电离电压(ESI voltage)5KV毛细管电压(capillary voltage)3V毛细管温度(capillary temperature)220℃鞘气(sheat gas)流速40arb辅助气(Aux gas)流速3arb覆盖率202/441＝45.81％N蛋白酶解后液质联用(LC-MS)分析结果见表1。
表1 N蛋白经酶解后所得肽段及相关信息
产业上利用的可能性利用本发明可在宿主细胞中获得大量的可溶性SARS病毒N蛋白(如，在大肠杆菌中，每升LB培养基可生产15毫克N蛋白)，利用NTA-Ni柱层析和分子筛提纯方法即可得到纯化的蛋白。本发明具有操作简单、蛋白纯度高等特点。
利用本发明得到的SARS病毒N蛋白可用于1)结构生物学方面的研究A.培养SARS病毒N蛋白晶体，通过X-射线晶体衍射技术解析SARS病毒N蛋白晶体结构；B.开展NMR研究，以探求SARS病毒N蛋白溶液状态下的三维结构。
2)与人体重要蛋白相互作用研究利用本发明得到的SARS病毒N蛋白以及生物物理技术可开展与人体重要蛋白(如免疫系统)相互作用研究，以探索SARS病毒感染人体正常细胞的途径，为抗SARS药物设计提供依据。
3)SARS诊断抗体研究利用本发明得到的SARS病毒N蛋白与其他生物工程技术相结合，可开展SARS诊断抗体研究。
序列表CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGA GGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
权利要求
1.可在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的表达质粒，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏号CCTCC No.M203046。
2.如权利要求1所述的表达质粒，含有如下序列CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCA CCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACA4AACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAA4CCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATTGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
3.一种用权利要求1所述表达质粒N-pQE30转化的宿主细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步骤1)用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒N蛋白DNA片段；2)用pQE30载体构建SARS病毒N蛋白表达质粒pQE30-N；3)将pQE30-N质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
7.可溶性SARS病毒N蛋白表达产物的纯化方法，包括将细胞裂解液透析、NTA-Ni柱层析和分子筛纯化。
全文摘要
本发明提供可在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的表达质粒N－pQE30(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏号CCTCC No.M203046)。还提供在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括采用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；用pQE30载体构建SARS病毒N蛋白表达质粒pQE30－N；和将pQE30－N质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。进一步提供可溶性SARS病毒N蛋白表达产物的纯化方法，包括将细胞裂解液进行透析、NTA－Ni柱层析和分子筛纯化。本发明的方法操作简单、得到的蛋白纯度高。
文档编号C07K14/165GK1472318SQ0312907
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者沈旭, 蒋华良, 陈克勤, 陈静, 沈建华, 罗小民, 陈凯先, 庄贤韩, 沈 旭 申请人:中国科学院上海药物研究所, 上海先导药业有限公司, 上海单抗制药技术有限公司