一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物免疫行业技术领域，具体涉及一种用于快速检测鉴定汉城病毒 的方法。
【背景技术】
[0002] 汉城病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，可引起肾综合征出血热，是一种有包膜 分节段的负链RNA病毒，基因组由大（L)、中（M)、小（S)三个基因片段组成，分别编码依赖 RNA的RNA聚合酶、糖蛋白和核衣壳蛋白。目前汉坦病毒属在世界范围内存在30个基因型， 我国以汉滩（HTNV)和汉城（SEOV)型为主。
[0003] 汉坦病毒属病毒感染人主要可以引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)，在 我国主要引起以发热、出血和急性肾功能损害为特征的肾综合征出血热。该病是我国最为 常见的自然疫源性疾病之一，危害十分严重。目前对该病毒所致疾病仍无特效的治疗药物， 因此及时发现和诊断汉城病毒感染显得尤为重要，初期诊断是控制病情，提高治愈率，避免 临床误诊贻误治疗时机的关键，另外通过流行病学观察和统计，建立监测体系并采取相应 预防措施，可对汉城病毒发病高峰期的提前预防提供有力支撑。
[0004] 对于汉城病毒感染，目前常用的诊断方法主要是传统的免疫学方法，包括病毒的 分离鉴定、ELISA法检测血清中抗SEOV IgM、IgG抗体、间接免疫荧光法（IFA法）检测病 毒抗原和抗体以及核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经典的分离鉴定法费时，IFA法 也不适用于快速的现场检测，检测SEOV抗体仅是一个侧面的间接指标，且均存在着特异 性和敏感性不够高、不能准确定量等问题。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)以其特异性强、灵敏
度高、检测速度快、能准确定量等优点，逐渐成为分子生物学和医学研究等领域的重要工 具，在病原的定性定量检测、基因表达水平分析等方面得到了广泛应用。
[0005] SYBR green I是一种能与dsDNA特异结合的染料，在PCR反应体系中，加入过量 SYBR green I荧光染料，可特异性地与dsDNA结合，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染 料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧 光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得 简便，同时也降低了检测的成本，因此非常适合大规模样本的检测。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：一种用于快速检测鉴定汉城病 毒的方法，包括以下几个步骤：
[0008] 1)实时荧光定量PCR引物的合成：由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，根据 SEOV SR-Il株的S基因序列，利用01ig〇6. O软件及NCBI Blast分析设计了一对汉城病毒 核酸的实时荧光定量PCR引物（见表1);分别命名为：上游引物SE0V-S-F-14 ;下游引物 SE0V-S-R-14,扩增片段长度为153bp。
[0009]表 1
[0011] 2)病毒RNA的提取及其纯度的确定
[0012] Vero E6细胞按常规培养成单层后，接种SEOV SR-11，吸附2h后换成2%胎牛血清 的维持液，〇)2培养箱内37°C培养12d，参照TRIZOL试剂（Invitrogen公司）使用说明书提 取细胞中的总RNA ;SE0V SR-11接种1~2天的昆明鼠乳鼠鼠脑，第1天接种病毒后到第25 天，每3天取血一次，QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN公司）提取病毒RNA，提取的病 毒RNA溶于60 μ 1经DEPC技术处理的ddH20,用微量分光光度计检测RNA标本在260nm和 280nm波长下的光密度值0D260和0D280,通过计算0D260/0D280,确定RNA纯度，本发明中 实验的结果显示所有RNA标本1. 9彡0D260/0D280彡2. 1，表明RNA纯度较高，无 DNA和蛋 白质污染，同时读取并记录RNA标本浓度（见图1)。
[0013] 3)病毒RNA反转录成cDNA
[0014] 反转录在20μ1体系中进行，首先取10μ1 RNA，加入下游引物lyl，dNTPs2yl， 置 65°C 水浴 5min，取出后冰浴 2min，再依次加入 5XFirst-Strand Buffer 4yl，DTT 2以1，37°(：水浴21^11，加入]\1-]\0^1以1，70°(：水浴5〇1^11，最后置70°(：151^11终止反应， 置-20 °C备用。
[0015] 4)阳性标准品的制备
[0016] 以上述 cDNA 为模板，以 S-F :5 '-ATGGCAACTATGGAGGAA-3' 为上游引物，S-R : 5 '-TTAGAGTTTCAAAGGCTCT-3'为下游引物进行PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收 目的DNA片段，将目的片段与pMD18-T载体16°C连接过夜，转化DH5 α感受态细胞，构建阳 性标准品质粒，提取质粒紫外分光光度计测定浓度，根据公式：〔6. 02X 1023拷贝数/摩尔 (copies/moL) X 浓度（g/ μ 1)/ 平均分子量（MW g/moL) = copies/ μ 1〕计算其拷贝数， 置-20°C备用，本发明中的实验结果显示用S-F和S-R经PCR扩增得到大小约1300bp的目 的片段，与预期大小一致，将此特异性片段与PMD18T连接，经PCR鉴定及测序证实SEOV-S 质粒构建成功（见图2)，提取质粒DNA经紫外分光光度计测定结果：0D260/0D280 = 1. 9， 质粒浓度为185ng/ μ 1，根据公式换算成拷贝数为I. 3 X 10ncopies/ μ 1，对该质粒进行10 倍梯度稀释，选择 I. 3 X IO5~I. 3 X 10 °copies/ μ 1。
[0017] 5)荧光定量PCR方法的建立
[0018] 10倍梯度稀释质粒pMD18T-S标准品进行Real-time PCR扩增，反应体系为25 μ 1， 其中 SYBRPremix ExTaqTM(2X) 12. 5 μ 1、SEOV-S-F(K) μmol/L)和 SEOV-S-R(K) μmol/L) 各0. 5 μ 1、模板2 μ 1、用ddH20补足，反应条件为：95°C预变性10s ;变性：95°C 5s ;退火/ 延伸：60°C 20s ;每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环，在PCR过程中由实 时荧光定量PCR仪（Mx 3000P)自动绘制线性标准曲线，反应结束后先加热至95°C，然后降 至72°C，开始以0. 2°C /s递增加热至95°C检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线，每次实 验均设立1个空白对照即不加模板，当空白对照为阴性时，实验有效，其中CT值< 30为阳 性，CT值> 30为阴性，本发明中的实验结果显示将质粒标准品按最佳反应条件进行SYBR Green I Real-time PCR反应，得到检测SEOV的扩增曲线（见图3)，以起始模板数的对数 值为横坐标，以循环阈值（Ct)为纵坐标，可以得到一条严格的直线型标准曲线（见图4)，相 关系数r = 0. 993,扩增效率E = 104. 8%，斜率为-3. 212,表明Ct和起始模板数之间存在 着严格的线性关系，保证了准确度，对熔解曲线（图5所示）分析表明，扩增的目的片段只 产生特异性单峰，没有引物二聚体和非特异性扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小 约为153bp (图6所示）。
[0019] 本发明与现有技术相比具有的有益效果是：其中，本发明通过实时收集反应体系 中的荧光信号强度来检测PCR所扩增出的汉城病毒核酸，可以定量分析样本中RNA的拷贝 数，准确检测出样本中的基因数目，比传统血清学方法更精确，更灵敏本；
[0020] 其中，发明中所确立的汉城病毒核酸的SYBR Green I Real-time PCR检测方法， 可对感染Vero E6细胞和感染实验小鼠两种不同样本中的汉城病毒核酸进行检测，使用范 围大，对比性强；
[0021] 其中，本发明中所确立的汉城病毒核酸的SYBR Green I Real-time PCR检测方 法，选用专门针对微量RNA的提取试剂盒和逆转录酶，对于保存条件差，病毒RNA含量低的 样本均有良好的检测效果，大幅提高阳性率，可用于临床、实验室检测以及流行病学研究；
[0022] 其中，本发明中的引物是根据汉坦病毒不同型别保守区的基因序列进行设计，检 测特异性强，重复性好，结果真实可靠；
[0023] 其中，本发明从核酸角度对感染Vero E6细胞和感染实验小鼠中的汉城病毒进行 检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要5~7小时，本发明中实时定量荧光PCR方法， 操作更为简便快速，只需要I. 5h的时间，并且，本发明对操作实验室环境要求不高，所用试 剂比较常规，可实现样本的批量检测，进一步节省了时间和成本，因此本发明是一种快速、 简单、经济的方法。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明中SEOV感染E6细胞提取RNA标本的结构图；
[0025] 图2为本发明中Pmdl8T-S PCR的鉴定图；
[0026] 图3为本发明中SEOV标准品的SYBR Green I Real-time PCR扩增曲线