专利名称：抗白斑症病毒受体的单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及抗体的应用技术的改进，具体讲是一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)受体的单克隆抗体及其制备方法，其属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域。
背景技术：
目前，白斑症病毒病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，引起很高的对虾死亡率，给对虾养殖业造成了巨大的损失。引起该病的白斑症病毒可广泛感染对虾的皮下组织、造血组织、结缔组织、淋巴器官等，血细胞是该病毒侵染的主要靶细胞，因此对虾血细胞上存在白斑症病毒的受体。病毒受体的筛选较多采用病毒重叠蛋白印迹测定(virusoverlay protein blot assay)技术。使用该技术筛选病毒受体的前提条件受体活性必须由单个多肽表达，同时该多肽能够在没有其它细胞膜成分帮助下与病毒结合，并在去垢剂中不失去其活性。但是有些病毒的受体经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转印后，受体蛋白的空间结构被破坏并且失去了其它细胞膜成分的帮助，丧失了与病毒的结合活性，用病毒重叠蛋白印迹测定技术无法筛选到该类受体。单克隆抗体技术的应用为病毒受体的筛选、鉴别提供了新的技术手段。首先制备出抗细胞表面抗原的单克隆抗体和建立对病毒敏感的细胞系，再通过单克隆抗体对病毒敏感细胞上受体的封闭效果，筛选出能保护细胞免受病毒感染的抗体，然后用该抗体鉴别、分离病毒受体。目前，国内外不仅尚未成功建立对白斑症病毒敏感的细胞系，使采用上述方法筛选白斑症病毒受体受到限制，而且用单抗技术筛选、鉴别白斑症病毒受体的研究也未见报道。
发明内容
本发明的目的是要提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体及其制备方法。本发明拟用中国对虾血细胞免疫balb/c小白鼠，通过生物免疫学技术，筛选和克隆得到能分泌抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞，进而开发该单克隆抗体的应用价值，为预防和治疗对虾白斑症病毒的药物或疫苗早日问世作好技术垫铺。本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体。该杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200418，分类命名小鼠杂交瘤细胞株WSSV-R，保藏日期2004/12/14，保藏单位CCTCC，保藏地址中国武汉大学内；其分泌的特异性抗白斑症病毒受体的单克隆抗体(以下简称单抗II)具有与对虾血细胞的细胞膜上的白斑症病毒受体特异性结合，从而封闭该受体，阻断病毒进入细胞，使病毒不能感染对虾血细胞的功能；长势良好的该杂交瘤细胞在其培养液内常规培养2--3天，养液即由桃红色转变为黄色，该培养液中含有大量杂交瘤细胞分泌出的单克隆抗体——单抗II；经间接免疫荧光方法检测，该单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，在荧光显微镜下观察，血细胞膜呈现明亮的黄绿色荧光，血细胞内的细胞核区域无荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值的比值不小于2。
所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法是用中国对虾血细胞免疫balb/c小白鼠，经瘤细胞与被免疫鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到抗中国对虾血细胞的单克隆抗体——即单抗I；再从该单抗I中，选择筛选单抗II的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的该单抗II，通过转印免疫印迹方法，能够确定对虾血细胞的细胞膜上白斑症病毒受体的分子量。
所述的白斑症病毒的受体抗原的分子量为175--200kDa。
所述的选择筛选单抗II的方法之一为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用斑点免疫印迹方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的选择筛选单抗II的方法之二为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用酶联免疫吸附方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的选择筛选单抗II的方法之三为采用原代对虾血细胞培养筛选抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
本发明的优点在于研制了一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体。该杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200418，其分泌的特异性抗白斑症病毒受体的单克隆抗体具有与对虾血细胞的细胞膜上的白斑症病毒受体特异性结合，从而封闭该受体，阻断病毒进入细胞，使病毒不能感染对虾血细胞的功能。正如本发明的单抗II的功能示意图的图1所示中国对虾血细胞膜1上的白斑症病毒受体2首先与单抗II 3特异性结合，白斑症病毒4就不可能吸附于白斑症病毒受体并与其结合，这样白斑症病毒就不可能由该受体感染对虾血细胞。因此本发明的单抗II具有防止白斑症病毒侵染对虾血细胞的功能。该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖，在倒置相差显微镜下观察生长状态良好的细胞，其外观饱满、浑圆、透亮、大小均一、贴壁性好；长势良好的杂交瘤细胞在其培养液内常规培养2——3天，该培养液即由桃红色转变为黄色，该培养液中含有大量杂交瘤分泌出的单克隆抗体——单抗II。该单抗II或经过改造的基因工程抗体很可能成为对虾白斑症病毒的治疗药物或疫苗，通过口服或注射等方式进入对虾体内起到预防或治疗对虾白斑症病毒病的作用。经间接免疫荧光方法检测，该单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，在荧光显微镜下观察，血细胞膜呈现明亮的黄绿色荧光，血细胞内的细胞核区域没有荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值的比值不小于2。本发明的单抗II可以大批量工业化生产，为预防或治疗对虾白斑症病毒病起积极作用。由于本发明的单抗II已经确定了一个对虾白斑症病毒的受体蛋白，可以经过测序得到此受体蛋白的氨基酸序列进而得到其基因序列，再通过基因工程去掉对虾体内的受体基因，有可能培育出抗白斑症病毒的虾苗，从而能够彻底解决白斑症病毒对世界养虾业的困扰。总之，单抗II在今后的科研和生产中具有很大的开发潜力。
及其
具体实施例方式
图1为本发明的单抗II的功能示意图。
图2为本发明的单抗II制备的工艺流程方框图。
图3为体外结合实验制备单抗II采用斑点免疫印迹方法筛选结果图。
图4为体外结合实验制备单抗II采用酶联免疫吸附方法筛选结果图。
图5为本发明的单抗II应用于鉴定中国对虾血细胞膜上的白斑症病毒受体分子量的结果图。
图6为本发明的单抗II应用于鉴定其它虾类血细胞膜上的白斑症病毒受体分子量的结果图。
图7为本发明的单抗II应用于鉴定蟹类血细胞膜上的白斑症病毒受体分子量的结果图。
图1中所示中国对虾血细胞膜1上的白斑症病毒受体2首先与单抗II3特异性结合，白斑症病毒4就不可能吸附于白斑症病毒受体与其结合，这样白斑症病毒就不可能由该受体感染对虾血细胞。
图2中的筛选方法1为斑点免疫印迹方法筛选单抗II。筛选方法2为酶联免疫吸附方法筛选单抗II。筛选方法3为原代对虾血细胞培养筛选单抗II。
图3中的A.为对虾血细胞膜和无封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由斑点免疫印迹得到的结果。B.为对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由斑点免疫印迹得到的结果。C.为对照(对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和失去活性的地高锌标记的白斑症病毒孵育)由斑点免疫印迹得到的结果。图中的1和2是两组平行。
图4中的1.为对虾血细胞膜和无封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒反应，由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果。2.为对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒反应，由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果。3.为对照(对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和失去活性的地高锌标记的白斑症病毒反应)由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果。
图5采用转印免疫印迹方法确定单抗II在中国对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量。1为标准分子量蛋白的蛋白银染色结果；2为中国对虾血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；3为本发明的单抗II在中国对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为175kDa。
图6采用转印免疫印迹方法确定单抗II在南美白对虾、日本对虾和克氏原螯虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量。1为标准分子量蛋白的蛋白银染色结果；2为日本对虾血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；3为本发明的单抗II在日本对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为175kDa；4为南美白对虾血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；5为本发明的单抗II在南美白对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为200kDa；6为克氏原螯虾血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；7为本发明的单抗II在克氏原螯虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为200kDa。
图7采用转印免疫印迹方法确定单抗II在中华绒螯蟹和梭子蟹血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量。1为标准分子量蛋白的蛋白银染色结果；2为中华绒螯蟹血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；3为本发明的单抗II在中华绒螯蟹血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为200kDa；4为梭子蟹血细胞蛋白由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，经蛋白银染色的结果；5为本发明的单抗II在梭子蟹血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为200kDa。
参见图1--7本发明研制的一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体。该杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200418，其分泌的特异性抗白斑症病毒受体的单克隆抗体具有与对虾血细胞的细胞膜上的白斑症病毒受体特异性结合，从而封闭该受体，阻断病毒进入细胞，使病毒不能感染对虾血细胞的功能；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖，在倒置相差显微镜下观察生长状态良好的细胞外观饱满、浑圆、透亮、大小均一、贴壁性好；长势良好的杂交瘤细胞在其培养液内常规培养2--3天，培养液即由桃红色转变为黄色，该培养液中含有大量杂交瘤细胞分泌出的单克隆抗体——单抗II；经间接免疫荧光方法检测，该单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，在荧光显微镜下观察，血细胞膜呈现明亮的黄绿色荧光，血细胞内的细胞核区域没有荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值的比值不小于2。
所述的该制备方法是用中国对虾血细胞免疫balb/c小白鼠，经瘤细胞与被免疫鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到抗中国对虾血细胞的单克隆抗体——即单抗I；再从该单抗I中，选择筛选单抗II的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的该单抗II，通过转印免疫印迹方法，能够确定对虾血细胞的细胞膜上识别白斑症病毒受体的分子量。
所述的白斑症病毒受体的分子量为175--200kDa。如图5--图7所示。
所述的从单抗I中筛选单抗II的方法之一为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用斑点免疫印迹方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的从单抗I中筛选单抗II的方法之二为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用酶联免疫吸附方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
所述的从单抗I中筛选单抗II的方法之三为采用原代对虾血细胞培养筛选抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
实施例1.研制单抗I1)抗原的制备取体长18-20cm的健康海捕中国对虾，用酒精棉球消毒对虾头胸甲后缘，用吸取预冷抗凝剂(氯化钠8.2g/L，柠檬酸5.5g/L，葡萄糖19.8g/L，柠檬酸钠8.8g/L，pH5.6)的5ml一次性医用注射器插入对虾心脏等比例抽取血液，离心400g，10分钟，4℃。
去除上清液，用抗凝剂重悬血细胞沉淀，再离心。如此重复3次，得到纯的对虾血细胞。用0.01M磷酸盐缓冲液(137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，8.09mM磷酸氢二钠，1.47mM磷酸二氢钾，pH7.4)调整血细胞的浓度达到2×108个/毫升。
2)免疫用提纯的中国对虾血细胞，免疫4周龄balb/c雌性小白鼠，每次的免疫剂量为0.1ml，共计2×107个血细胞。免疫分4次进行第一次，基础免疫用酒精棉球消毒小白鼠右腹部，把吸取0.1ml血细胞悬液的1ml注射器插入小白鼠腹腔，注射完毕，用酒精棉球消毒注射部位以防感染。
第二次，加强免疫第一次免疫的2周之后进行第二次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠右腹部，把吸取0.1ml血细胞悬液的1ml注射器插入小白鼠腹腔，注射完毕，用酒精棉球消毒注射部位以防感染。
第三次，二次加强免疫第二次免疫的1周之后进行第三次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取0.1ml血细胞悬液的1ml注射器插入小白鼠尾部静脉，注射完毕，用酒精棉球消毒注射部位以防感染。
第四次，融合前的扩增免疫第三次免疫的1周后进行第四次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取0.1ml血细胞悬液的1ml注射器插入小白鼠尾部静脉，注射完毕，用酒精棉球消毒注射部位以防感染。
3)融合
经过4次免疫后的第三天，处死小白鼠，取出脾细胞，与P3U1骨髓瘤细胞进行细胞融合。细胞融合操作步骤如下(1)乙醚麻醉免疫供脾小鼠，无菌取出脾脏和胸腺细胞(饲养细胞)后，分别过100目网筛，用RPMI1640(-)溶液吹下形成单细胞悬液。
(2)将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000转/分钟离心3分钟，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI1640(-)溶液重悬，胸腺细胞沉淀用RPMI1640(-)选择性培养基(含10％小牛血清和1％HAT)重悬。
(3)取3×107个处于对数生长期的P3U1骨髓瘤细胞，1000转/分钟离心3分钟，去上清液后，用RPMI1640(-)溶液重悬P3U1骨髓瘤细胞沉淀。
(4)将脾细胞悬液与P3U1骨髓瘤细胞悬液混合均匀后，1000转/分钟离心3分钟，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状。
(5)将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，用吸管吸取预温到37℃的聚乙二醇溶液1ml，并缓缓滴加到细胞沉淀中，然后在水浴中静置5分钟。
(6)继续滴加已经预温到37℃的RPMI1640(-)溶液15ml，使聚乙二醇稀释而失去作用。加的方法是前半分钟，加1ml；后半分钟，加3ml；然后在第2分钟内加完15ml。
(7)补加RPMI1640(-)溶液至40ml，经1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液。
(8)将沉淀的细胞轻悬于3ml RPMI1640(-)选择性培养基中，冻存2ml后，补加RPMI1640(-)选择性培养基和饲养细胞，混合均匀后每孔100微升滴加到96孔板内，放置在CO2浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件的CO2培养箱中培养细胞。
4)筛选和克隆融合后两周左右，杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底面积1/3时，采用间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞。
间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞的步骤(一)抗原的固定(1)用酒精棉球消毒对虾头胸甲后缘，用吸取预冷抗凝剂的5ml一次性注射器插入中国对虾心脏等比例抽取血液。
(2)把抽取的血细胞悬液离心400g，10分钟，4℃。
(3)去除上清液，用抗凝剂重悬血细胞沉淀，再离心。如此重复3次，得到纯的血细胞，用0.01M磷酸盐缓冲液重悬血细胞。
(4)把血细胞悬液滴在干净的载玻片上，在室温下湿盒中沉降1小时。
(5)从湿盒中取出载玻片室温下风干。
(6)放入丙酮中固定20分钟，取出风干。
(7)保存在-20℃的冰箱中备用。
(二)间接免疫荧光反应(1)以杂交瘤上清(杂交瘤培养液)为第一抗体，加在载玻片的血细胞样品上。
(2)37℃湿盒中孵育45分钟。
(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。
(4)以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在血细胞样品上。
(5)37℃湿盒中孵育45分钟。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。
(7)甘油封片。
(8)荧光显微镜下观察。
(三)采用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，克隆步骤如下
(1)乙醚麻醉小鼠，无菌收出胸腺细胞(饲养细胞)后，在100目网筛上研磨，用RPMI1640(-)溶液吹下形成单细胞悬液。
(2)把胸腺细胞悬液1000转/分钟离心3分钟，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用RPMI1640(-)培养基(加10％胎牛血清)重悬。
(3)把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用RPMI1640(-)培养基(加10％胎牛血清)以10的整次倍稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞的RPMI1640(-)培养基(加10％胎牛血清)悬液中。
(4)细胞悬液用滴管吹打均匀，滴入一个96孔细胞培养板，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞。
(5)把细胞放置在CO2浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件的CO2培养箱中进行培养。
(6)两周后，用间接免疫荧光方法进行检测，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞再克隆一遍，以保证形成单克隆的杂交瘤细胞。
5)冻存待杂交瘤细胞处于对数生长期，用滴管吹打成杂交瘤细胞悬液，加二甲亚砜(9份完全培养液+1份二甲亚砜，二甲亚砜为冷冻保护剂)，使最终细胞密度为3-5×106个/毫升。以1ml细胞悬液分装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放置-70℃超低温冰箱内过夜(8-12小时)后，再浸入液氮内长期保存。
实施例2.从单抗I中筛选单抗II1)白斑症病毒的提纯(1)取白斑症病毒感染的中国对虾的虾头，去掉肝胰脏，称取10克病料，加入2ml25％蔗糖，石英砂研磨3-5分钟(4℃)，使细胞破碎，病毒游离到溶液中，然后加入100ml25％蔗糖，混匀。
(2)把研碎的病料3000转/分钟离心，15分钟。
(3)取上清，5000转/分钟离心，15分钟，4℃。
(4)取上清，8000转/分钟离心，15分钟，4℃。
(5)取上清，25000转/分钟(P7OAT转子)离心，2小时，4℃。
(6)取沉淀，用8ml 25％蔗糖溶液重悬，磁力搅拌器缓慢搅拌1小时，4℃。
(7)把搅拌均匀的病毒粗提液铺于不连续蔗糖密度梯度上面，蔗糖梯度为33％，40％，46％，52％，57％，62％(W/W)，超速离心25000转/分钟(P40ST转子)2小时，4℃。
(8)取46％和52％之间的病毒带，即为纯化的病毒。
2)用地高锌标记提纯的白斑症病毒(1)取1ml提纯的白斑症病毒的悬液(蛋白浓度为1毫克/毫升)，加入7微升二甲亚砜溶解的地高锌溶液，室温，缓慢搅动2小时。
(2)用10ml 0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液封闭Sephadex-G25凝胶层析柱。
(3)用30ml 0.01M磷酸盐缓冲液冲洗柱子。
(4)把地高锌标记的病毒混合液过Sephadex-G25凝胶层析柱，进行分子筛层析。
(5)把层析出的液体用0.5ml离心管收集，5滴/管，共收集50管。
(6)从每管中分别取出0.5微升点在硝酸纤维素膜上，自然晾干。如此准备2张平行的硝酸纤维素膜，标记为1号硝酸纤维素膜和2号硝酸纤维素膜。
(7)把2张硝酸纤维素膜放在0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白中孵育45分钟，37℃。
(8)取出2张硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(9)把1号硝酸纤维素膜放入抗白斑症病毒的单克隆抗体中，把2号硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的抗地高锌抗体中，孵育45分钟，37℃。
(10)分别取出2张硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(11)把1号硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶30000稀释于0.01M磷酸盐缓冲液中)中，孵育45分钟，37℃。把2号硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
(12)取出1号硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(13)把1号硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
从步骤(5)收集的50管溶液中筛选出既能检测到白斑症病毒又能检测到地高锌的病毒溶液，即为地高锌标记好的白斑症病毒。
3)中国对虾血细胞膜的提纯(1)用提膜匀浆缓冲液(10mM羟乙基哌嗪乙磺酸，2mM乙二胺四乙酸二钠，2mM苯甲基磺酰氟，pH7.4)重悬提纯的海捕中国对虾血细胞(提取血细胞方法同前)，放入玻璃匀浆器中手动匀浆，破碎细胞。
(2)把血细胞匀浆液200g离心，20分钟，4℃。
(3)取离心上清液，8000g离心，20分钟，4℃。
(4)取离心上清液，100,000g超速离心，20分钟，4℃。
(5)取血细胞膜沉淀，用0.01M磷酸盐缓冲液重悬，置-80℃冻存备用。
4)斑点免疫印迹方法筛选单抗II(1)取0.5微升提纯的中国对虾血细胞膜悬液，点在硝酸纤维素膜上，自然晾干，放入0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液中封闭45分钟，37℃。取出硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(2)把硝酸纤维素膜放入单抗I中孵育45分钟，37℃。取出硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(3)把硝酸纤维素膜放入地高锌标记的白斑症病毒液中孵育4小时(以灭活的地高锌标记的白斑症病毒代替有活性的地高锌标记的白斑症病毒作为对照)，4℃。取出硝酸纤维素膜，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(4)把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的抗地高锌抗体中孵育45分钟，37℃。取出硝酸纤维素膜用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(5)把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
结果对虾血细胞膜和无封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由于地高锌标记的白斑症病毒与对虾血细胞膜上的所有受体结合，由斑点免疫印迹得到的结果颜色很深；对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由于部分受体被封闭使地高锌标记的白斑症病毒无法与其结合，由斑点免疫印迹得到的结果颜色较浅；对照(对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和失去活性的地高锌标记的白斑症病毒孵育)由于失活的地高锌标记的白斑症病毒不能与对虾血细胞膜上的受体结合，由斑点免疫印迹得到的结果几乎无色(如图3)。
5)酶联免疫吸附方法筛选单抗II
(1)取100微升提纯的中国对虾血细胞膜悬液，在酶标板上包被过夜，加入0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液封闭45分钟，37℃。去除封闭液，用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗酶标板3次，每次5分钟。
(2)把单抗I加入酶标板中孵育45分钟，37℃。用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(3)把地高锌标记的白斑症病毒液加入酶标板中孵育4小时(以灭活的地高锌标记的白斑症病毒代替有活性的地高锌标记的白斑症病毒作为对照)，4℃。用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(4)把碱性磷酸酶标记的抗地高锌抗体加入酶标板中孵育45分钟，37℃。用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
(5)把碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)加入酶标板发色20分钟，2M NaOH终止发色，酶标仪测OD值。如图4所示。
结果对虾血细胞膜和无封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由于地高锌标记的白斑症病毒与对虾血细胞膜上的所有受体结合，由酶联免疫吸附检测得到的OD值较大；对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和地高锌标记的白斑症病毒孵育，由于部分受体被封闭使地高锌标记的白斑症病毒无法与其结合，由酶联免疫吸附检测得到的OD值较小；对照(对虾血细胞膜和有封闭作用的单抗I反应，再和失去活性的地高锌标记的白斑症病毒孵育)由于失活的地高锌标记的白斑症病毒不能与对虾血细胞膜上的受体结合，由酶联免疫吸附检测得到的OD值很小(如图4)。
6)用中国对虾血细胞原代培养方法筛选单抗II(1)实验用基本培养基为Leibovitz’s 2×L-15，加入2.4％氯化钠、2％葡萄糖、100UI/mL青霉素和100μg/ml链霉素，pH7.2-7.4，0.22μm滤膜过滤，细菌培养基培养，无菌落生长。加入20％小牛血清。
(2)75％酒精消毒中国对虾体表，心脏处酒精棉球消毒。
(3)用吸取预冷抗凝剂的5ml一次性医用注射器插入对虾心脏等比例抽取血液。离心400g，10分钟，弃上清。
(4)血细胞沉淀用培养基重悬，滴入96孔细胞培养板，50微升/孔，29℃恒温培养，2小时后，相差显微镜观察细胞贴壁，补加细胞培养液，100微升/孔。
(5)培养的血细胞稳定3天后，吸除培养液，加入待筛选的单抗I孵育1小时，换入0.45μm滤膜过滤除菌的病毒粗提液，29℃孵育1小时，换入细胞培养液，以不加病毒的培养细胞作对照，每个梯度设4个重复。
(6)每天用倒置相差显微镜观察细胞的病理变化。
结果感染病毒的原代培养血细胞的病理变化表现为细胞成堆、悬起、培养液中出现细胞碎片。与无封闭作用的单抗I孵育的原代培养的血细胞第3天就表现出了病理变化；与有封闭作用的单抗I(即单抗II)孵育的原代培养的血细胞出现病理变化较晚，第5天才表现出了病理变化(见表1)。
表1.单抗I的保护效果
注释“-”代表没有表现病理变化；“+”代表表现病理变化的程度，“+”越多表现的病理变化越严重。
实施例3.本发明的单抗II应用之一，采用转印免疫印迹方法确定单抗II在中国对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量表2十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所使用的分离胶及浓缩胶成份
1)将提纯的中国对虾血细胞用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤(1)制胶使用从BIO-RAD公司购买的电泳槽。凝胶由分离胶(Running gel)和浓缩胶(Stackinggel)两部分组成(见表2)。先将分离胶倒入玻璃夹层中，上部用蒸馏水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，用注射器(注射器配上5号牙科长针头)吸出分离胶表面的蒸馏水，然后加入浓缩胶，插入点样梳，待浓缩胶聚合后，拔去点样梳。
(2)中国对虾血细胞处理将中国对虾血细胞用0.01M磷酸盐缓冲液重悬，加入等量样品缓冲液，沸水中煮沸1-2分钟，冷却。
(3)电泳及后处理将夹胶玻璃板固定入电泳槽内，注射器加5号长针头吸除点样孔内的蒸馏水，整理点样孔道，用微量加样器分别吸取待分析样品，每孔内加样品10微升。加电泳缓冲液入上下贮槽内，接通电源，在稳流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束，轻撬开两层玻璃，取出凝胶。切下一条跑道的凝胶，蛋白银染色。用以鉴定十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是否成功。
2)剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22微米)以电转移缓冲液(电转移缓冲液25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面，整个操作中需注意随时用玻璃棒清除硝酸纤维素膜或滤纸与凝胶之间的气泡。按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的″三明治″。
3)准备好电转移槽及其配件(包括泡沫垫和支持板等)。将上述″三明治″放置在两块充分浸湿的泡沫垫之间，最外层再用两块有机玻璃支持板加以支撑，支持板上有小孔，可使电转移缓冲液自由进入″凝胶三明治″中，使液流通过该体系。
4)将″凝胶三明治″置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内。将硝酸纤维素膜面向阳极。
5)电泳稳流200mA，通电5小时。
6)电泳完毕，取出硝酸纤维素膜，将一半硝酸纤维素膜用考马丝亮兰-R250染色，7％乙酸脱去背景颜色，以显示蛋白质区带。
7)将另一半带有重复样品的硝酸纤维素膜用0.01M磷酸盐缓冲液洗10分钟，然后置0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液中封闭45分钟，37℃。
8)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
9)将硝酸纤维素膜置单抗II中，37℃缓慢摇动1小时或4℃过夜。
10)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
11)将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶30000稀释于0.01M磷酸盐缓冲液中)，37℃缓慢摇动1小时。
12)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
13)把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
14)用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
结果本发明的单抗II在中国对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为175kDa(见图5)。
实施例4.本发明的单抗II应用之二，采用转移免疫印迹方法确定单抗II在日本对虾、南美白对虾和克氏原螯虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量1)将提纯的日本对虾、南美白对虾和克氏原螯虾血细胞用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤(1)制胶使用从BIO-RAD公司购买的电泳槽。凝胶由分离胶(Running gel)和浓缩胶(Stackinggel)两部分组成(见表2)。先将分离胶倒入玻璃夹层中，上部用蒸馏水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，用注射器(注射器配上5号牙科长针头)吸出分离胶表面的蒸馏水，然后加入浓缩胶，插入点样梳，待浓缩胶聚合后，拔去点样梳。
(2)对虾血细胞处理将对虾血细胞用0.01M磷酸盐缓冲液重悬，加入等量样品缓冲液，沸水中煮沸1-2分钟，冷却。
(3)电泳及后处理将夹胶玻璃板固定入电泳槽内，注射器加5号长针头吸除点样孔内的蒸馏水，整理点样孔道，用微量加样器分别吸取待分析样品，每孔内加样品10微升。加电泳缓冲液入上下贮槽内，接通电源，在稳流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束，轻撬开两层玻璃，取出凝胶。切下一条跑道的凝胶，蛋白银染色。用以鉴定十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是否成功。
2)剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22微米)以电转移缓冲液(电转移缓冲液25mmol/L Tris-Base，192mmol/L 甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面，整个操作中需注意随时用玻璃棒清除硝酸纤维素膜或滤纸与凝胶之间的气泡。按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的″三明治″。
3)准备好电转移槽及其配件(包括泡沫垫和支持板等)。将上述″三明治″放置在两块充分浸湿的泡沫垫之间，最外层再用两块有机玻璃支持板加以支撑，支持板上有小孔，可使电转移缓冲液自由进入″凝胶三明治″中，使液流通过该体系。
4)将″凝胶三明治″置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内。将硝酸纤维素膜面向阳极。
5)电泳稳流200mA，通电5小时。
6)电泳完毕，取出硝酸纤维素膜，将一半硝酸纤维素膜用考马丝亮兰-R250染色，7％乙酸脱去背景颜色，以显示蛋白质区带。
7)将另一半带有重复样品的硝酸纤维素膜用0.01M磷酸盐缓冲液洗10分钟，然后置0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液中封闭45分钟，37℃。
8)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
9)将硝酸纤维素膜置单抗II中，37℃缓慢摇动1小时或4℃过夜。
10)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
11)将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶30000稀释于0.01M磷酸盐缓冲液中)，37℃缓慢摇动1小时。
12)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
13)把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
14)用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
结果本发明的单抗II在日本对虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量为175kDa；在南美白对虾血细胞和克氏原螯虾血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量均为200kDa。(见图6)。
实施例5.本发明的单抗II应用之三，采用转移免疫印迹方法确定单抗II在中华绒螯蟹和梭子蟹血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量1)将提纯的中华绒螯蟹和梭子蟹血细胞用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，注意加样品时，在同一块凝胶上按加样顺序做一份重复加样，以备最后显色时采用两种方法呈色，便于分析结果。
蛋白质十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)制胶使用从BIO-RAD公司购买的电泳槽。凝胶由分离胶(Running gel)和浓缩胶(Stackinggel)两部分组成(见表2)。先将分离胶倒入玻璃夹层中，上部用蒸馏水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，用注射器(注射器配上5号牙科长针头)吸出分离胶表面的蒸馏水，然后加入浓缩胶，插入点杆梳，待浓缩胶聚合后，拔去点样梳。
(2)中华绒螯蟹和梭子蟹血细胞处理将中华绒螯蟹和梭子蟹血细胞分别用0.01M磷酸盐缓冲液重悬，加入等量样品缓冲液，沸水中煮沸1-2分钟，冷却。
(3)电泳及后处理将夹胶玻璃板固定入电泳槽内，注射器加5号长针头吸除点样孔内的蒸馏水，整理点样孔道，用微量加样器分别吸取待分析样品，每孔内加样品10微升。加电泳缓冲液入上下贮槽内，接通电源，在稳流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束，轻撬开两层玻璃，取出凝胶。切下一条跑道的凝胶，蛋白银染色。用以鉴定十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是否成功。
2)剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22微米)以电转移缓冲液(电转移缓冲液25mmol-L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面，整个操作中需注意随时用玻璃棒清除硝酸纤维素膜或滤纸与凝胶之间的气泡。按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的″三明治″。
3)准备好电转移槽及其配件(包括泡沫垫和支持板等)。将上述″三明治″放置在两块充分浸湿的泡沫垫之间，最外层再用两块有机玻璃支持板加以支撑，支持板上有小孔，可使电转移缓冲液自由进入″凝胶三明治″中，使液流通过该体系。
4)将″凝胶三明治″置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内。将硝酸纤维素膜面向阳极。
5)电泳稳流200mA，通电5小时。
6)电泳完毕，取出硝酸纤维素膜，将一半硝酸纤维素膜用考马丝亮兰-R250染色，7％乙酸脱去背景颜色，以显示蛋白质区带。
7)将另一半带有重复样品的硝酸纤维素膜用0.01M磷酸盐缓冲液洗10分钟，然后置0.01M磷酸盐缓冲液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液中封闭45分钟，37℃。
8)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
9)将硝酸纤维素膜置单抗II中，37℃缓慢摇动1小时或4℃过夜。
10)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
11)将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶30000稀释于0.01M磷酸盐缓冲液中)，37℃缓慢摇动1小时。
12)用0.01M磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
13)把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色(蓝色)清晰为止。
14)用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
结果单抗II在中华绒螯蟹血细胞膜和梭子蟹血细胞膜上识别的白斑症病毒受体的分子量均为200kDa(见图7)。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
本发明所用试剂及仪器如下地高锌试剂盒(购于Roch公司)；碱性磷酸酶标记的抗地高锌抗体(购于Roch公司)；磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(购于Sigma公司)；硝酸纤维素膜(购于PALL公司)；碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)(购于Sigma公司)；牛血清白蛋白(购于Sigma公司)；异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体(购于Sigma公司)；酶标仪(购于MOLEULAR公司)；Leibovitz’s L-15(购于GIBCO公司)；胎牛血清(购于Hyclone公司)；RPMI(-)1640(购于GIBCO公司)；电泳槽(购于BIO-RAD公司)；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(购于Sigma公司)；丙烯酰胺(购于Sigma公司)；亚甲叉双丙烯酰胺(购于Sigma公司)；Tris-Base(购于Sigma公司)；十二烷基磺酸钠(购于Sigma公司)；过硫酸铵(购于Sigma公司)；四甲基乙二胺(TEMED)(购于Sigma公司)；疏基乙醇(购于Sigma公司)；甘油(购于Sigma公司)；溴酚兰(购于Sigma公司)；Tris-Base(购于Sigma公司)；甘氨酸(购于Sigma公司)；十二烷基磺酸钠(购于Sigma公司)；考马斯亮蓝-R250(购于Sigma公司)；4-硝基酚磷酸盐(pNPP)(购于Sigma公司)。
权利要求
1.一种由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，其特征在于该杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200418其分泌的特异性抗白斑症病毒受体的单克隆抗体(以下简称单抗II)具有与对虾血细胞的细胞膜上的白斑症病毒受体特异性结合，从而封闭该受体，阻断病毒进入细胞，使病毒不能感染对虾血细胞的功能；长势良好的该杂交瘤细胞在其培养液内常规培养2——3天，养液即由桃红色转变为黄色，该培养液中含有大量杂交瘤细胞分泌出的单克隆抗体——单抗II；经间接免疫荧光方法检测，该单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，在荧光显微镜下观察，血细胞膜呈现明亮的黄绿色荧光，血细胞内的细胞核区域无荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，其OD值与阴性对照的OD值的比值不小于2。
2.权利要求1所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于该制备方法是用中国对虾血细胞免疫balb/c小白鼠，经瘤细胞与被免疫鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到抗中国对虾血细胞的单克隆抗体——即单抗I；再从该单抗I中，选择筛选单抗II的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
3.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的该单抗II，通过转印免疫印迹方法，能够确定对虾血细胞的细胞膜上白斑症病毒受体的分子量。
4.根据权利要求3所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的白斑症病毒的受体抗原的分子量为175——200kDa。
5.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择筛选单抗II的方法之一为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用斑点免疫印迹方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
6.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择筛选单抗II的方法之二为将对虾血细胞膜与该单抗I在体外结合，采用酶联免疫吸附方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
7.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择筛选单抗II的方法之三为采用原代对虾血细胞培养筛选抗白斑症病毒受体的单克隆抗体的方法，筛选能封闭病毒受体的单克隆抗体——抗白斑症病毒受体的单克隆抗体，即单抗II。
全文摘要
本发明是由杂交瘤细胞分泌的抗白斑症病毒受体的单抗II，该瘤细胞保藏号CCTCC－C200418，其分泌的单抗II具有与对虾血细胞的细胞膜上的该病毒受体特异性结合，从而封闭该受体，阻断该病毒进入细胞，使该病毒不能感染对虾血细胞的功能；该杂交瘤细胞在常规培养2－3天的培养液内显示由桃红色变为黄色，此时该培养液中含有大量该瘤细胞分泌的单抗II；经间接免疫荧光方法检测，该单抗II与血细胞的细胞膜上的受体特异性结合，在荧光显微镜下观察，血细胞膜呈现黄绿色荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值，其OD值与阴性对照OD值的比值不小于2。该单抗II可大批量工业生产，为预防或治疗对虾白斑症病毒病起积极作用。
文档编号A61P31/00GK1660908SQ200410075529
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者战文斌, 张志栋 申请人:中国海洋大学