专利名称：猪繁殖与呼吸综合症病毒受体cd163敲除猪及培育方法
技术领域：
本发明提供了ー种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，同时还公开了该猪的培育方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
猪繁通与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁通与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrom virus,PRRSV)引起的以流产、死胎、胎儿木乃伊化和呼吸道疾病为特征的传染病。在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为“蓝耳病”。近几年，该病在国内呈现明显的高发趋势，对养猪业造成了重大损失，已成为严重威胁我国养猪业发展的 重要传染病之一。完全分化的原代猪肺泡巨噬细胞是PRRSV感染的靶细胞。CD163又名M130，是富含半胱氨酸的清道夫受体家族成员之一，是单链跨膜糖蛋白分子，也是ー种巨噬细胞分化的抗原。研究发现，CD163具有单核细胞-巨噬细胞特异性，在全身各种含丰富巨噬细胞的器官上高表达。该蛋白在非易感的细胞表达，能使细胞获得感染PRRSV的能力，还能产生子代病毒，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。因此，CD163基因的功能研究可以为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染相关研究提供理论依据，而CD163基因敲除的研究将为进ー步研究CD163受体在PRRSV感染过程中发挥的具体作用奠定基础。目前CD163基因敲除的转基因动物尚未见报道。
发明内容
本发明公开了ー种猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。本发明还提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163敲除猪的培育方法，适用于人工制备⑶163基因敲除猪。本发明提供的猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，其特征在于
在敲除猪体内⑶163基因不表达。本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪的培育方法，包括以下步骤
I) PRRSV受体⑶163基因敲除载体的构建
分别克隆猪CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后将上述同源臂亚克隆至含正向筛选基因Neo和负向筛选基因TK的pSSC-9载体，构建含正负筛选标记的⑶163基因敲除载体 pSSC-Larm-Sarm-CD163 ；
I. I)用PCR扩增猪的⑶163基因同源左臂和同源右臂序列 用同源臂扩增引物分别扩增CD163基因同源左臂和同源右臂序列；
1.2)将CD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接，分别构建成pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ；
I. 3)用 BamHI 和 HindIII 酶切 pGM-T-Sarm_CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；将0)163基因同源左臂与同源右臂先后连接至PSSC-9载体上，构建成含正负筛选标记的⑶163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163 ；
2)CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞系的建立
将上述构建的基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163线性化后，用脂质体法转染到猪胚胎成纤维细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行基因敲除的鉴定，对鉴定确证发生同源重组的细胞冻存；
2. I)载体线性化提取pSSC-Larm-Sarm-CD163质粒，用I酶切，然后こ醇沉淀，用无菌ddH20溶解；
2.2)脂质体转染将线性化的载体按照脂质体Fugene HD转染小型猪成纤维细胞，5 %CO2, 39 °C培养;
2.3)核供体细胞的获得用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用PCR方法对所获得的细胞进行鉴定，得到CD163基因敲除猪成纤维细胞；该细胞即为核供体细胞；
3)利用体细胞核移植技术构建CD163基因敲除猪
采用体细胞核移植技木，以母猪做代孕母猪，构建CD163基因敲除猪。本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于
⑶163基因敲除载体为pSSC-Larm-Sarm-⑶163，该载体含有⑶163基因同源左臂和同源右臂，參见图I。本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于
用于扩增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下
同源左臂的扩增引物
PCDE2-3F:5’ -ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，
PCDE3-4R:5’ -ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’ ；
同源右臂的扩增引物
PCDE5-6F:5， -AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3，，
PCDE5-6R:5’ -AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。本发明采用PCR方法对⑶163基因敲除猪进行鉴定。目前已经成功获得了 3头健康猪，该基因敲除猪已经过鉴定具有⑶163基因缺失的特性。本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的PCR鉴定方法，用于基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定，其特征在于引物序列如下
鉴定引物对I (JDYffl)
5’ -TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’，
5’ -AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’ ；
鉴定引物对2 (JDYff2)
5， -AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3，，
5’ -ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’ ；
鉴定引物对3 (NEOl)
5’ -TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，5’ -GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’ ；
鉴定引物对4 (NE02)
5’ -AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，
5，-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3，。本发明的积极效果在于建立猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。
图 I 为 pSSC-Larm-Sarm-CD163 载体 图2为⑶163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞(4X )；
图3为CD163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞鉴定结果 图4.基因敲除猪PCR鉴定。
具体实施例方式以下实施例证明本发明的效果，下列实施例g在进ー步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例I
PRRSV受体⑶163基因敲除载体的构建
I质粒形成的重要的中间质粒有pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163。2实验过程以小型猪基因组为模板，采用PCR法(參见表2)分别扩增克隆猪CD163同源左臂和同源右臂JfCD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接，分别构建成 pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ；用 BamHI 和 hindIII 酶切pGM-T-Sarm-CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用 SalI 酶切 pGM-T-Larm_CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；将CD163基因同源左臂与同源右臂分别与含正向筛选基因Bip-Neo和负向筛选基因HSV-t的打靶载体pSSC_9相连接，构建含正负筛选标记的CD163基因敲除载体(见附图I)。扩增同源臂用的PCR引物由金斯瑞公司合成(引物序列见表I)。表I用于同源臂扩增的PCR引物
权利要求
1.ー种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，其特征在于 在敲除猪体内⑶163基因不表达。
2.权利要求I所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪的培育方法，包括以下步骤 1)PRRSV受体⑶163基因敲除载体的构建 分别克隆猪CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后将上述同源臂亚克隆至含正向筛选基因Neo和负向筛选基因TK的pSSC-9载体，构建含正负筛选标记的⑶163基因敲除载体 pSSC-Larm-Sarm-CD163 ； I. I)用PCR扩增猪的⑶163基因同源左臂和同源右臂序列 用同源臂扩增引物分别扩增CD163基因同源左臂和同源右臂序列； 1.2)将CD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接，分别构建成pGM-T-Sarm-CD163 和 pGM-T-Larm_CD163 ； 1.3)用 BamHI 和 HindIII 酶切 pGM-T-Sarm_CD163，回收 CD163 基因同源右臂 Sarm 片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；将0)163基因同源左臂与同源右臂先后连接至PSSC-9载体上，构建成含正负筛选标记的⑶163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163 ； 2)CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞系的建立 将上述构建的基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163线性化后，用脂质体法转染到猪胚胎成纤维细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行基因敲除的鉴定，对鉴定确证发生同源重组的细胞冻存； 2.I)载体线性化提取pSSC-Larm-Sarm-CD163质粒，用I酶切，然后こ醇沉淀，用无菌ddH20溶解； 2.2)脂质体转染将线性化的载体按照脂质体Fugene HD转染小型猪成纤维细胞，5 %CO2, 39 °C培养; 2.3)核供体细胞的获得用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用PCR方法对所获得的细胞进行鉴定，得到CD163基因敲除猪成纤维细胞；该细胞即为核供体细胞； 3)利用体细胞核移植技术构建CD163基因敲除猪 采用体细胞核移植技木，以母猪做代孕母猪，构建CD163基因敲除猪。
3.根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于 ⑶163基因敲除载体为pSSC-Larm-Sarm-⑶163，该载体含有⑶163基因同源左臂和同源右臂，參见图I。
4.权利要求2或3所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于 用于扩增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下 同源左臂的扩增引物PCDE2-3F:5’ -ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，PCDE3-4R:5’ -ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’ ； 同源右臂的扩增引物PCDE5-6F:5， -AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3，，PCDE5-6R:5’ -AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。
5.权利要求I所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的PCR鉴定方法，其特征在于，用于基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定的引物序列如下 鉴定引物对I (JDYffl)5’ -TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’， 5’ -AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’ ； 鉴定引物对2 (JDYff2)5， -AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3，，5’ -ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’ ； 鉴定引物对3 (NEOl)5’ -TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，5’ -GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’ ； 鉴定引物对4 (NE02)5’ -AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，5，-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3，。
全文摘要
本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，同时还公开了该猪的培育方法，构建的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163是以中国实验小型猪基因组为模板，采用PCR法分别扩增猪CD163基因同源左臂和同源右臂；将克隆得到的CD163基因同源左臂和同源右臂分别亚克隆到pSSC-9载体上；培养的猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。
文档编号C12N5/10GK102715132SQ20121013579
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者于飞飞, 任林柱, 宋娜, 曹宇航, 李莉, 杨鑫, 欧阳红生, 赖良学, 逄大欣, 陈福旺 申请人:吉林大学