专利名称：一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明涉及用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测
方法，更具体地涉及RT-PCR —步法检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的 试剂盒和4企测方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综'合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),亦称蓝耳病，是一种新的有高度传染性的猪病，主 要表现为妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎以及产弱仔等繁殖障碍 以及各年龄猪发生呼吸道症状，仔猪死亡率高，感染猪出现免疫抑制 等现象。该病最早于1987年在美国和1990年在欧洲^皮发现以来，已 传遍世界所有养猪国家，本病隐性感染率高，并呈周期性暴发。据统 计，PRRS每年给美国养猪业造成的直接经济损失为5.6亿美元，而 美国用于该病的防控研究经费高达6亿美元。因此，国内外许多知名
专家和学者将该病称为对养猪业最具危害的两大杀手之一。国际兽疫 局(OIE)将其列为需要通报的B类传染病，我国亦将其列为二类传染 病。值得注意的是，自2006年5月份以来，我国从江西开始发病， 后波及到浙江、江苏、安徽、湖南、山东、河南等许多省市，初步估 算，到2007年初，我国发病地区生猪存栏量已锐减了近三分之一， 造成了极大的经济损失，也给许多生猪养殖场(户)造成了毁灭性地打 击。
国外和国内均已建立了 RT-PCR检测方法。国外应用PCR诊断 PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列， 设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。该方法
4直接从PAM分离培养物、临床样品(肺泡巨噬细胞、血清和血浆，肺 脏组织以及精液等)中扩增出预期的片断，但该方法仅应用了一对引
物，通过PCR扩增产生一个核苦酸片段。众所周知，RNA病毒具有 高度变异能力，同时PRRSV是一种高度传染性的病毒，因此现有的 检测方法不具有快速，敏感和准确的特点。因此需要研制并开发出快 速，敏感、准确以及价格便宜的PRRSV检测试剂盒和检测方法，以 弥补我国在PRRSV检测上的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动 物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是快速、敏感、准确以及低成本地检测 猪繁殖与呼吸综合征病毒。
为解决上述问题，本发明提供了 一组针对猪繁殖与呼吸综合症病 毒的引物，所述引物包括
第一对的上游引物，其序列为SEQIDNO:l;
第一对的下游引物，其序列为SEQIDNO:2;
第二对的上游引物，其序列为SEQIDNO:3，
第二对的下游引物，其序列为SEQIDNO:4;
第三对的上游引物，其序列为SEQIDNO:5，
第三对的下游引物，其序列为SEQIDNO:6;
或者上述序列SEQIDNO:l至SEQIDNO:6的向5，端和/或3，端 延长的序列；
或者与上述序列SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:6同源性大于85 % 的序列；
或者与上述序列SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:6碱基互补的序列。 本发明还提供了 一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测试剂 盒，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无 RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO:6引物的混合物。
其中所述One Step RNA PCR混合液包含PCR緩沖液、dNTP和
Mg2+。
所述阴性对照为无RNA酶水空白对照。
所述阳性对照为为PRRSV HuN4细胞林的RNA，其浓度为0.25
所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/|iL, AMV逆转录酶的浓度为 5U/nL， Taq酶的浓度为5U/|uL，引物的浓度为50 pM/pL, One Step RNA PCR混合液中PCR緩冲液的浓度为10 x ， dNTP的浓度为10 mM和Mg2+的浓度为25 mM。
本发明还提供了用所述检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病 毒的方法，所述方法包括以下步骤
a. ^是耳又样品总RNA;
b. 使用本发明所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，其中条件 如下50。C反转录30分钟，94。C预变性2分钟，94。C40秒，退火温 度57°C 40秒，72°C 50秒，30个循环后72。C延伸8分钟；
c. 电泳；
d. 结果分析，与DL 2000标准分子量对照，如果阳性对照出现 490bp、 345bp及228bp三条条带，样品扩增产物出现228 bp、 345 bp 以及490 bp中的任何一条条带，而阴性对照无扩增条带，则可判定 该样品为阳性。
所述样品可以是待测猪的肺泡巨噬细胞、血清和血浆、肺脏组织 以及精液。
本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完 成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的2-3小时，从而有 利于快速检测。同时本发明使用了三对引物，从而使该方法与普通的 PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于PRRSV的防控和隐形带毒 动物的剔除，避免造成大范围的传染。所述方法适用于任何实验室和基层单位，例如我国各级防控单位、基层兽医站和大中小型养殖场等。
附图1为待测样品PCR产物的电泳结果图。
具体实施例方式
引物的设计和制备
参照GenBank查找多个毒林，进行序列比对，根据比对结果设 计相对保守的三对特异引物，引物序列如下 490 bp条带的引物序列为
上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。
阳性3于照
本发明试剂盒的阳性对照是PRRSVHuN细胞林的RNA。从患高 热病猪体内分离得到一林猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN抹)，按照常 规方法提取其RNA,浓度为0.25吗/mL。
样品1的制备
(1)从待测猪身上取下肺脏组织，加上一定量TRIzol进行研磨， 取500 组织样品研磨上清液置于1.5 mL eppendorf管中，加入500
7^L三氯曱烷，快速振荡数秒，8000转/分和4。C离心5分钟。
(2) 取上清液200 置于l.5 mL eppendorf管中，加入1000 pL TRIzol，反复混匀，冰上放置5分钟。
(3) 力。200 (iL三氯甲烷，小心盖上盖子，用力振摇15秒，室温 放置5分钟。
(4) 12000转/分和4。C离心15分钟，分为三层。
(5) 将上层水相转移至另一 eppendorf管中，加入500 (iL异丙醇， 混匀，室温放置15分钟，力卩6 (iL核酸助沉剂。
(6) 12000转/分和4。C离心10分钟，在eppendorf管底部可见胶 才羊RNA沉淀。
(7) 弃去上清，用1000)iL75。/()乙醇(使用前用无RNA酶水配制， -20°。预冷)漂洗沉淀两次，10000转/分和4°C离心5分钟。
(8) 室温充分干燥RNA沉淀。加10pL无RNA酶水，即可用于 PCR扩增。其余RNA沉淀-20。C保存备用。
样品2的制备
从待测猪的全血中制备样品2，操作步骤基本同样品1的制备， 只是不对全血进行处理而直接从步骤(2)开始相关操作。
样品3的制备
从待测猪的血清中制备样品3，操作步骤基本同样品1的制备， 只是不对血清进行处理而直接从步骤(2)开始相关操作。
本发明试剂盒
本发明试剂盒由以下组分组成
a. One Step RNA PCR混合液，浓度为10 x
b. RNA酶抑制剂，浓度为40 U L
c. AMV,浓度为5 U/pLd. Taq酶，浓度为5 U小L
e. 三对引物，各自浓度均为50Pm/pL
f. 无RNA酶水
g. 阳性对照，浓度为0.25吗/mL
用本发明试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病毒
PCR反应总体系为25 pL。分别将本发明试剂盒中(l) One Step RNA PCR混合液10 ^L; (2) RNA酶抑制剂0.5 (3) AMV 0.5 (4) Taq酶0.5 (iL; (5)三对引物1.5pL; (6)无RNA酶水7(iL,加入 到5根0.2mL扩增管中，
然后分别向扩增管1、扩增管2、扩增管3、扩增管4和扩增管5 中加入阳性对照5 pL、样品1的RNA模板5 pL、样品2的RNA模 板5 pL、样品3的RNA模板5 和无RNA酶水空白对照5 ^L。混 匀，高速离心5-30秒。将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下 扩增50。C反转录30 min, 94。C预变性2min, 94°C 40 s，退火温度 57°C 40 s, 72°C 50 s, 30个循环后72。C延伸8分钟。
称取1.5 g琼月旨糖，加入100 mL lxTAE緩冲液中，加热融化， 加入5 pL(lOO mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中， 胶板厚度为约5mm。依据样品数选用适宜的梳子，待凝胶冷却后拔 出梳子，将凝胶放入电泳槽中，力。1 xTAE緩冲液淹没胶面。
分别取5 pL上文所得PCR扩增产物和2 (iL緩冲液，混匀，加入 加样孔中。同时上样标准DNA Marker。
80 V-100 V电压或40 mA-50 mA电流电泳15 min-25 min。
取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察并拍摄照片，结 果见图1,其中泳道l为阳性对照、泳道2、泳道3和泳道4分别为 样品1 、样品2和样品3,泳道5为空白对照，泳道M为DL2000 Marker。
如图1所示，与DL 2000标准分子量对照可知，样品1、样品2 和样品3的电泳结果出现了三条不同的条带，即490 bp(序列见SEQ
9ID NO:7)、 345 bp(序列见SEQ ID NO:8)以及228 bp(序列见SEQ ID NO:9)。样品1 、样品2和样品3的DNA条带与阳性对照相符，同时 空白对照无扩增条带，判定判样品l、样品2和样品3为阳性，即所 述样品对应的待测猪包含猪繁殖与呼吸综合症病毒。<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> —种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测
方法
<160> 9
<170> Patentln version 3.5
<210> <211> <212> <213> <400>
1
21
DNA
人工序列 1
ccccgccaac cccgagaata g 21
<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
aatcccasag cgtgccatca atcc 24 <210> 3
<211> 22 ' <212> DNA <213> 人工序列 <楊> 3
agccagcctt cgccctatcc at 22
<210> 4 <211> 21 <212> DNA<formula>formula see original document page 12</formula>gatgcatctc ctaagttact cgcccgccac gggccgggaa acactgggat tgatggcacg 480 ctttgggatt 490
<210> 8 <211> 345 <212> DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒 <400> 8
agccagcctt cgccctatcc ataaatatag ccgcgcgtgc attggtgccg gctatatggt 60 gggcccctcg gtgtttttag gcacccctgg ggttgtgtca tactatctca caaaatttgt 120 tagaggcgag gctcaagtgc ttccggagac agtcttcagc accggccgaa ttgaggtaga 180 ttgtcgagag tatcttgatg atcgggagcg agaagttgct gagtccctcc cacatgcctt 240 catcggcgat gtcaaaggta ccaccgttgg gggatgtcat cacgttacct ccaaatacct 300 tccgcgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggtcggg gtttc 345
<210> 9 <211> 228 <212> DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒 <400> 9
cccgggttga aaagcctcgt gttgggtggc agaaaagctg ttaagcaggg agtggtaaac 60 cttgttaaat atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca 120 gccagtcaat cagctgtgcc aaatgctggg taagatcatc gcccaacaaa accagtccag 180 aggcaaggga ccggggaaga aaaataggaa gaaaaacccg gagaagcc 228
1权利要求
1. 一组针对猪繁殖与呼吸综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物包括第一对的上游引物，其序列为SEQ ID NO1；第一对的下游引物，其序列为SEQ ID NO2；第二对的上游引物，其序列为SEQ ID NO3，第二对的下游引物，其序列为SEQ ID NO4；第三对的上游引物，其序列为SEQ ID NO5，第三对的下游引物，其序列为SEQ ID NO6；或者上述序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6的向5’端和/或3’端延长的序列；或者与上述序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6同源性大于85％的序列；或者与上述序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6碱基互补的序列。
2. —种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无 RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:6引物的混合物。
3. 权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述One Step RNAPCR混合液包含PCR緩冲液、dNTP和Mg2+。
4. 权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照 为无RNA酶水空白对照。
5. 权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照 为PRRSV HuN4细胞林的RNA，浓度为0.25吗/mL。
6. 权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA酶抑 制剂的浓度为40 U/pL, AMV逆转录酶的浓度为5 U/|iiL， Taq酶的 浓度为5 U/|iL,引物的浓度为50 pM/pL, One Step RNA PCR混合液中PCR緩冲液的浓度为10 x , dNTP的浓度为10 mM和Mg2 +的浓 度为25 mM。
7. —种用权利要求2所述的检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合 症病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a. 才是耳又样品总RNA;b. 使用权利要求2所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，其中 条件如下50。C反转录30分钟，94。C预变性2分钟，94。C40秒，退 火温度57°C 40秒，72°C 50秒，30个循环后72。C延伸8分钟；c. 电泳；d. 结果分析，如果样品扩增产物出现228bp、 345bp以及490bp 中的任何一条条带，而阴性对照无扩增条带，则可判定该样品为阳性。
8. 权利要求7所述的方法，其特征在于所述样品可以是待测 猪的肺泡巨噬细胞、血清和血浆、肺脏组织以及精液。 全文摘要
一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6引物的混合物，所述检测包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤。所述方法能快速、敏感、准确以及低成本地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。
文档编号C12Q1/70GK101463395SQ20081024170
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者刘湘涛, 吴锦艳, 尚佑军, 尹双辉, 宏 田, 野 靳 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所