专利名称：一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体是一种检测高致病性 猪繁殖与综合症病毒变异株诊断方法和专用试剂盒。2、 背景技术2006年夏天我国爆发猪"高热病"，目前农业部己确定高致病性猪繁殖与 综合症病毒变异株为此病的原发病原。针对高致病性猪繁殖与综合症病毒变异 株国内很多学者做了大量的工作。目前检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异 株的方法主要有病毒分离鉴定、过氧化物酶单层试验(IPMA)和RT-PCR诊断方 法。分离鉴定和过氧化物酶单层试验(IPMA)技术要求较高，只能在实验室进 行，而且对实验人员要求较高，很难大规模应用于现地检验。针对目前我国国 内普遍流行的高热病的现状，急需一种能够应用于大规模现地检样的诊断方法。3、 发明内容本发明的目的是针对目前我国"高热病"普遍存在，给养猪业带来严重经 济损失的现状，提供一种能够应用于大规模现地检样的诊断方法。本发明专利是通过以下技术方案实现的 1. 1引物设计根据2006年后发生的高致病性猪繁殖与呼吸综合症都是在Nsp2区域出现缺失的特点，设计了一对特异性引物，该引物能将此缺失片断包 括在内，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为 494bp。特异性引物如下PSX1: 5' -TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3，PSX2: 5， -GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3' 1.2病料的处理将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用无菌细胞培养液l: 4倍稀释，取病毒悬液-2(TC反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液-80 "C保存备用。 1.3病毒RNA的提取① 取研磨液300 uL加入600 yLRNAout，振荡混匀室温静置5 min;② 加入200 UL氯仿用力颠倒，离心管混匀后静置5 min， 12000 rpm离心 10 min。4③ 取上清，加入500 iiL异丙醇，振荡混匀后，室温放置10min， 12000 rpm 离心10 min。
④ 轻轻弃去上清，加入lmL75X乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500 rpm 离心5 min。
⑤ 弃上清，室温静置5-15min，使RNA沉淀干燥。
⑥ 加入10 u L的DEPC水溶解RNA，用于反转录。 1.4反转录
取提取的RNA7HL， Oligo(dT)l叱70。C作用10min，后于冰上加入5Xbuffer 4叱、dNTP Mixture 3叱、Rnase Inhibitor l叱、ddH20 3PL 、 M-MLV 1PL， 42 "C水浴lh。用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的cDNA为模板进行PCR反应。
1.5聚合酶链式反应(PCR)
IOX反应缓冲液 5.0 iiL
dNTP (2.5 pMol/uL) 4. 0 u L
Primer (+)(25 pMol/uL) 1.0 uL
Primer (-)(25pMol/uL) 1.0 uL
MgCl2(25 mMol) 4. 0 y L
cDNA 5. 0 uL
Taq DNA聚合酶(5 u/uL) 0. 5 u L
无菌^0 加至 50.0 ix L
反应条件为(D95。C 5min; (2)94°C 1 min， 54. 5°C 1 min， 72°C 1 min， 共28个循环；(3)72°C 5 min。 PCR扩增产物于-2(TC保存。 1. 6电泳电压100 V电泳40 min，取凝胶在含10 mg/mL的溴化乙锭(EB)水 溶液中染色15 min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。
本发明自行设计特异性引物，提取病毒RNA并反转录为cDNA，在此基础上 利用PCR方法检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株，并在此基础上研制成 功了专用试剂盒，与现有技术相比，该诊断方法和专用试剂盒具有很强的特异 性、敏感性，与病毒分离和IPMA方法相比符合率可达90。/。以上，可广泛用于临 床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测。
图中M: DL2000 (2000， 1000， 750， 500， 250， 100bp); 1-8:临床样本，其余为空泳道。 具体实施例方式
1) 引物
根据2006年后发生的高致病性猪繁殖与呼吸综合症都是在Nsp2区域出现 缺失的特点，设计了一对特异性引物，该引物能将此缺失片断包括在内，扩增 变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp。 由TaKaRa生物技术有限公司合成。
PSX1: 5' -TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3，
PSX2: 5， -GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3'
2) 病料的处理
将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用无菌细胞培养液l :4倍稀释，取 病毒悬液-2(TC反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液-80。C保存备用。
3) 病毒RNA的提取
① 取研磨液300 uL加入600 uLRNAout，振荡混匀室温静置5 min;
② 加入200 uL氯仿用力颠倒，离心管混匀后静置5 min， 12000 rpm离心 10 min。
③ 取上清，加入500 uL异丙醇，振荡混匀后，室温放置10min， 12000 rpm 离心10 min。
④ 轻轻弃去上清，加入lmL75X乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500 rpm 离心5 min。
⑤ 弃上清，室温静置5-15 min，使RNA沉淀千燥。
⑥ 加入10 u L的DEPC水溶解RNA，用于反转录。
4) 反转录
取提取的RNA7PL， Oligo(dT)lML 7(TC作用10min，后于冰上加入5Xbuffer 4PL、 dNTP Mixture 3叱、Rnase Inhibitor 1化、ddH20 3化、M-MLV l叱，42 。C水浴lh。用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的cDNA为模板进行PCR反应。
5) 聚合酶链式反应(PCR)
IOX反应缓冲液 5. 0 uL
dNTP (2.5 pMol/uL) 4. 0 w LPrimer (+) (25 pMol/yL) Primer (-) (25pMol/uL) MgCl2(25 mMol)
1.0 uL
1.0 uL
4.0 ii L
5. 0 iiL
Taq DNA聚合酶(5 u/y L) 无菌H20 加至
0. 5
50.0 iiL
6) 不同引物分别采用如下温度程序 PSX1/PSX2 :
(D95。C 5 min; (2)94°C 1 min， 54. 5°C 1 min， 72°C 1 min，共28个循 环；(3)72°C 5 min PCR扩增产物于-20。C保存。
试验设猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒阴性对照。
7) 电泳
电压100 V电泳40 min，取凝胶在含10 mg/mL的溴化乙锭(EB)水溶液中 染色15 min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。 结果
1) RT-PCR的特异性
利用合成的引物对猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒均未扩增出与 预期大小一致的条带。
2) 病料的检测
对山东省2006年以后采集的疑似为高致病性猪繁殖与呼吸综合症的病料用 PSX1/PSX2引物进行RT-PCR检测，结果在病料中都扩增出变异株特异性片段， 图1所示为部分样本的检测结果。
权利要求
1、一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒，其特征在于用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测的特异性引物PSX1/PSX2，特异性扩增PRRSV NSP2变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp，制备步骤如下1)试剂盒采用的引物为PSX15’-TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3’PSX25’-GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3’，退火温度为54.5℃，采用28个循环，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp；2)病料的处理将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用无菌细胞培养液1∶4倍稀释，取病毒悬液-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液-80℃保存备用。3)病毒RNA的提取①取研磨液300μL加入600μL RNAout，振荡混匀室温静置5min；②加入200μL氯仿用力颠倒，离心管混匀后静置5min，12000rpm离心10min。③取上清，加入500μL异丙醇，振荡混匀后，室温放置10min，12000rpm离心10min。④轻轻弃去上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500rpm离心5min。⑤弃上清，室温静置5-15min，使RNA沉淀干燥。⑥加入10μL的DEPC水溶解RNA，用于反转录。4)反转录取提取的RNA7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、Rnase Inhibitor 1μL、ddH2O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的eDNA为模板进行PCR反应。5)聚合酶链式反应(PCR)10×反应缓冲液 5.0μLdNTP(2.5pMol/μL)4.0μLPrimer(+)(25pMol/μL)1.0μLPrimer(-)(25pMol/μL)1.0μLMgCl2(25mMol)4.0μLcDNA 5.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL)0.5μL无菌H2O 加至 50.0μL6)反应条件为(1)95℃5min；(2)94℃1min，54.5℃1min，72℃1min，共28个循环(3)72℃5min。PCR扩增产物于-20℃保存。1.6电泳电压100V电泳40min，取凝胶在含10mg/mL的溴化乙锭(EB)水溶液中染色15min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。
全文摘要
本发明提供一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒。通过自行设计特异性引物PSX1/PSX2，提取病毒RNA并反转录为cDNA，利用PCR方法检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp。该专用试剂盒，与现有技术相比，具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IPMA方法相比符合率可达90％以上。该引物对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒的扩增结果均为阴性，能够区分NSP2变异株与传统株；该方法可检出12.8ng/L的PRRSV，可广泛用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测。
文档编号C12Q1/70GK101220397SQ20081001406
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者任慧英, 刘玉庆, 吴家强, 顺 周, 张秀美, 时建立, 俊 李, 温建新, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所