专利名称：共表达prrsv orf5及orf6双基因核酸疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说是一种能够有效控制猪繁殖与呼吸 综合症的共表达PRRSV 0RF5及0RF6双基因的核酸疫苗，用于对猪提供针对猪繁 殖与呼吸综合症病毒的免疫保护作用。2、 背景技术猪繁殖与呼吸综合症可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道症 状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相继出现 高致病性PRRSV为主要病原的猪"无名高热综合症"，给我国的养猪业造成了严重 的经济损失。猪繁殖与呼吸综合症病毒为单股正链RNA病毒，长约15Kb。 ORF5编码 约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞免疫。0RF6编码M蛋 白，该蛋白位于病毒囊膜内。M - GP5聚合物在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒 侵染中起重要作用。目前用于预防PRRS的弱毒苗和灭活苗已在我国广泛应用，但 是猪繁殖与呼吸综合症仍未得到有效控制。核酸疫苗可将病毒保护性抗原的基因 以质粒的方式导入动物体，其表达蛋白既可刺激产生体液免疫又可产生细胞免疫， 本发明中将PRRSV 0RF5及0RF6基因同时插入真核重组表达载体构建的核酸疫苗尚 未见报道。3、 发明内容本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合症的共表达PRRSV 0RF5及0RF6双基因的核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合症难以防治的现状得以突破。 本发明的目的是按以下方式实现的共表达PRRSV 0RF5及0RF6双基因的核酸疫苗，是在哺乳动物真核表达载体 的2个多克隆位点中分别插入了 PRRSV 0RF5及0RF6完整基因，获得重组质粒 pIRES-0RF5及0RF6双基因核酸疫苗，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达 PRRSV的GP5及M蛋白。上述核酸疫苗通过以下方法构建而成 1) 0RF5及0RF6的扩增根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株0RF5及0RF6的引物，引物序列如下 P5s: 5' -AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3' P5r: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ，扩增702bp。 P6 s:5 ， -AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3 ， P6r: 5 ， -AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3 ， 扩增607bp 。 以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增0RF6基因。2) pIRES-0RF5及0RF6真核重组表达载体的构建将0RF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将0RF6插入 pIRES，构建pIRES-0RF6重组质粒；再将0RF5的PCR片段与pIRES—0RF6重组质 粒经Xba I和Not I双酶切，将0RF5插入pIRES — 0RF6，构建pIRES—0RF5及0RF6 重组质粒。3) pIRES-0RF5及0RF6真核重组表达载体的转染将pIRES-0RF5及0RF6转染CH0细胞，建立稳定表达的细胞系。通过RT-PCR 检测0RF5及0RF6的转录情况，通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的 表达和免疫活性，通过间接免疫荧光试验进一步检测目的蛋白在细胞内的表达情 况。上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达。本发明的有益效果是该核酸疫苗首次在哺乳动物细胞真核表达载体中插入 了 PRRSV 0RF5及0RF6基因，突破了 PRRSV常规灭活疫苗及弱毒疫苗的局限性， 避免了弱毒疫苗使用后毒力返强情况的发生，弥补了灭活疫苗免疫后不能产生细 胞免疫的缺陷，又可使针对GP5的抗体优先产生，改变了 PRRSV感染后针对GP5 的中和抗体产生慢而且产生量少的不足。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产 生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫 保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。
附图1是pIRES-0RF5及0RF6转染后细胞中GP5蛋白和M蛋白的SDS-PAGE 检测结果；附图l标记说明其中1)是蛋白质分子量标准；2)是pIRES-0RF5及0RF6 转染细胞的上清；3)是pIRES转染细胞。附图2 pIRES-0RF5及0RF6转染细胞的间接免疫荧光检测结果。附图2标记说明A质粒转染的细胞；B病毒感染的细胞；C阴性对照。
具体实施方式
1) PCR引物设计合成根据pIRES MCSA、 MCSB多克隆位点的序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5 及0RF6基因阅读框架，同时在起始密码子的前面加入Kozak序列，分别设计了针 对0RF5及0RF6的引物P5s及P5r， P6s及P6r。P5s: 5， -AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3，P5r: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ，扩增702bp。P6 s:5 ， -AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3 ，P6r: 5 ， -AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3' 扩增607bp 。2) 病毒RNA的提取将PRRSV SD1株接种Marc-145细胞，当细胞出现75%左右病变并开始脱落时， 冻融3次收集病毒液，用Trizol试剂盒提取病毒总RNA，操作方法按说明书进行。3) 反转录取提取的RNA 7叱，Oligo (dT) l叱70。C作用10min，后于冰上加入5Xbuffer 4礼、dNTP Mixture 3叱、RNase Inhibitor 1PL、 ddH20 3叱、M-MLV lPL， 42°C 水浴lh。以此合成的cDNA为模板进行PCR反应。4) PCR扩增以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增0RF5，通过P6s及P6r 扩增0RF6基因。10XPCRBuffer 5tiL， 25pmo1及L上、下游引物各2uL， lO腿ol 及L dNTPs 4 u L， 1: 200稀释的质粒模板2 u L，水34 u L， Taq E 1 w L。0RF5基因扩增条件预变性95°C 5min;变性94°C lmin退火5CTC lmin 延伸72°C lmin共30 Cycles最终延伸72°C 10min。0RF6基因扩增条件预变性95°C 5min; 变性94°C lmin退火59.6°C lmin延伸72°C lmin共30 Cycles最终延伸72°C lOmin。5) pIRES—0RF6真核重组表达载体的构建将0RF6 PCR产物和pIRES经EcoR I和Nhel 37。C双酶切5h，胶回收双酶切 产物，并在16。C保温90min进行连接获pIRES _0RF6。将pIRES -0RF6转化感受 态细胞DH5a后按照上海生工质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。后经PCR鉴 定、双酶切鉴定和测序鉴定。6) pIRES — 0RF5及0RF6真核重组表达载体的构建及鉴定将0RF5 PCR产物和pIRES-0RF6经Xba I和Not I双酶切，胶回收双酶切产物，并在16°C保温90min进行连接获pIRES-0RF5及0RF6。将pIRES-0RF5及0RF6 转化感受态细胞DH5a后按照上海生工质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。并 进行PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒用Wizard PureFection PLasmid DNA Purification System试剂盒进行纯化，紫外分光光 度计测定其含量。7 ) pIRES-0RF5及ORF6重组质粒的转染将对数生长期的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)用胰酶及EDTA常规消化，以1X 108 个及mL铺于D-多聚赖氨酸(lmg及mL)包被的6孔板中，每孔2mL，培养18 24h。 待细胞铺满90%及以上时，用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染试剂 盒转染。在无菌1.5mL离心管中配置溶液A: pIRES-0RF5及0RF6质粒，溶 液B: 5叱Lipofectamine 2000，分别溶于250叱DMEM (无血清)培养基。在5min 内将溶液A溶液B混合，轻轻摇动，室温放置30min后，加入0. 5mL DMEM培养基， 轻轻摇动。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37°C 5% C0^中 保温6h，后加入含血清的DMEM培养液。24h传代至新鲜培养基中，48h后加入筛 选抗生素。48h后加入70(^g及mLG418的选择培养基，对转染的CH0细胞进行加 压筛选，以获得稳定转染的CH0细胞。每4d换液1次，加压筛选至对照组(未转 染的CH0细胞)全部死亡。将G418浓度降为350 ^g及mL，继续培养至转染组细胞 生长汇合，即可转至30ci^的培养瓶中持续加压筛选培养。加压筛选后20d内，对 照组细胞全部死亡；自加压后12d开始，转染pIRES-0RF5及0RF6的细胞开始增 殖，第15 23(5汇片达80%左右，未见细胞漂浮，表明已筛选出稳定转染的CH0细 胞。8) 基因的转录鉴定收集筛选后稳定表达的细胞，按常规方法提取细胞总RNA，用1中介绍的引物 RT-PCR分别检测0RF5、0RF6基因的转录情况。均可扩增出与预期大小一致的条带。9) SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和免疫活性 收集筛选后稳定表达的细胞上清液按1: 1比例与2XSDS (2.0mL Tris-Cl0. 5m。1及L p朋.8， 10% SDS， 2. 0mL 1%溴酚蓝，2.0mL甘油)上样缓冲液，沸水 中煮15min，进行SDS-PAGE。将转膜后的硝酸纤维素膜放在一个平皿中，用15mL 1XPBS洗两次，每次10min。加封闭液(5%脱脂奶粉)，浸过膜即可，室温下轻 振2h。然后用20mL 1XPBST洗3次，每次10min，再用15mL 1 XPBS洗10min。 加10mL用封闭液按1: 100稀释的PRRS高免血清，室温下轻振2h。重复清洗步骤， SEQUENCE LISTING<110〉山东省农业科学院畜牧兽医研究所 〈120〉共表达PRRSV 0RF5及0RF6双基因核酸疫苗的制备方法 〈160> 4〈170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1 〈211〉 25 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈220〉 〈223>引物 〈400> 1aatctagagc cgccaccatg ttgga 25〈210> 2 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223>引物 〈400〉 2gcgcggccgc tcactggcgt gtag 24〈210〉 3 〈211〉 26 〈212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223>引物 〈400〉 3agctagccgc caccatgggg tcgtcc 26 〈210〉 4〈211〉 28 '<212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物<400> 4agaattctgg caccagctga ttgactgg 28
权利要求
1.共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，其特征在于通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将PRRSV SD1株的完整ORF5及ORF6插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6双基因核酸疫苗；该共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗是通过以下方法构建而成1)ORF5及ORF6的扩增根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF5及ORF6的引物，引物序列如下P5s5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’P5r5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp；P6s5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’P6r5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp；以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因；2)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建将ORF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF6插入pIRES，构建pIRES-ORF6重组质粒；再将ORF5的PCR片段与pIRES-ORF6重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES-ORF6，构建pIRES-ORF5及ORF6重组质粒；3)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的转染将重组质粒pIRES-ORF5及ORF6转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS-PAGE和Westernblot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性，并通过间接免疫荧光检测到转染质粒的CHO细胞内有PRRSV特异性的蛋白表达。
全文摘要
本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6，将重组质粒转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS-PAGE和Western blot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/40GK101401937SQ200810014058
公开日2009年4月8日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者任慧英, 吴家强, 顺 周, 张秀美, 徐绍建, 俊 李, 温建新, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所