BGIos040基因、构建体及其应用的制作方法

专利名称：BGIos040基因、构建体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域。具体地，本发明涉及BGIOS040基因、构建体及其应用。更具体地，本发明涉及分离的寡核苷酸、构建体、重组细胞、制备转基因植物细胞的方法、转基因植物细胞或其培养物，以及制备转基因植物的方法。
背景技术：
分蘖是决定水稻产量的重要农艺性状，在生产实践中主要通过栽培措施和育种手段来增加有效分蘖，减少无效分蘖。目前，随着水稻分子育种理论与技术的不断成熟和完善，遗传转化体系的建立和优化，新型测序技术结合基因组学方法鉴定受人工选择的基因资源，使得利用基因组重测序技术发掘分蘖相关基因和遗传转化成为可能。然而，现阶段分蘖相关基因的发掘和遗传转化研究仍有待改进。

发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够提高植物持续分蘖能力及产量的手段。需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人从野生稻中发现了分蘖相关基因BG1s040基因，然后通过多次实验验证了 BG1s040基因的转化能够显著提高受体植物的持续分蘖能力，提高其后代植株的分蘖数目，进而能够显著提高其产量。具体地，发明人从野生稻中扩增出分蘖相关基因BG1s040基因——制备含有该基因的构建体(即重组表达载体)——通过直接法将该构建体转化
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404--利用上述农杆菌转化水稻愈伤组
织——愈伤组织⑶S染色——再生植株⑶S染色——转基因小苗移植到大田中进行性状观察，并测定其产量——转基因植物Tl、T2代植株田间种植及农艺性状观测。从而，证明了BG1s040基因为植物分蘖相关基因，利用该基因转化植物能够显著提高受体植物的持续分蘖能力，提高其T2代植株分蘖数目，进而能够显著提高植物的产量。由此，本发明提出了 BG1s040基因，包含该基因的构建体及其在提高植物持续分蘖能力中的用途。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。其中，该分离的寡核苷酸即为BG1s040基因。发明人惊奇地发现，将该分离的寡核苷酸引入植物细胞中，能够显著提高植物细胞中BG1s040基因的表达，进而能够显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的寡核苷酸。发明人惊奇地发现，利用该构建体能够有效地将该分离的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物细胞中，进而，能够通过植物细胞中表达BG1s040基因而显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株的分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。根据本发明的实施例，本发明的构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。根据本发明的一些优选实施例，本发明的构建体呈质粒的形式。由此，能够有效提高利用本发明的构建体进行遗传转化的效率。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞含有前面所述的分离的寡核苷酸或构建体。发明人发现，利用该重组细胞转染植物细胞，能够有效地将该分离的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物细胞中，进而，能够通过在植物细胞中表达BG1s040基因而显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株的分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。根据本 发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物细胞的方法。根据本发明实施例，该方法包括:使用前面所述的构建体转化受体植物细胞；以及分离转基因植物细胞。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效制备包含BG1s040基因的转基因植物细胞，进而利用该转基因植物细胞能够有效获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的一个实施例，在本发明的制备转基因植物细胞的方法中，转化是通过农杆菌转染法进行的。由此，能够显著提高遗传转化效率。根据本发明的一个实施例，在本发明的制备转基因植物细胞的方法中，受体植物细胞和转基因植物细胞均呈细胞、组织或器官的形式，优选呈组织的形式，更优选呈愈伤组织的形式。根据本发明的一个实施例，采用愈伤组织进行转化。由此，能够显著提高遗传转化效率。根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种转基因植物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，该转基因植物细胞或其培养物是通过前面所述的制备转基因植物细胞的方法获得的。由此，利用该转基因植物细胞或其培养物，能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:利用前面所述的制备转基因植物细胞的方法，制备转基因植物细胞；以及对该转基因植物细胞进行培养，以便获得转基因植物。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，后代植株分蘖数目明显提高，植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因植物或其后代。根据本发明的实施例，转基因植物或其后代是通过前面所述的制备转基因植物的方法获得的。相对于野生型，该转基因植物或其后代，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高。根据本发明的再一方面，本发明还提供了另一种制备转基因植物方法。根据本发明的实施例，该方法包括:1)将权利要求2或3所述的构建体转化入植物愈伤组织，或利用权利要求4所述的重组细胞感染植物愈伤组织；2)利用所述愈伤组织培育转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，特别优选水稻，进一步优选日本晴。利用该方法能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强、后代植株分蘖数目明显提高、植物产量显著提高的转基因植物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1显示了实施例3中制备的经重组根癌农杆菌EHA105-p6+BG1s040转化的水稻愈伤组织与对照的GUS染色结果；图2显示了根据本发明一个实施例，经含有p6+BG1s040重组载体的根癌农杆菌转化的水稻幼苗及对照的根GUS染色结果；图3显示了实施例5中筛选获得的TO代BG1s040基因转基因苗及野生型对照的根系形态图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。发明人发现并证明了 BG1s040基因是与控制水稻分蘖性状相关的功能基因，进而提出了下述的本发明的提高植物持续分蘖能力及产量的手段。分离的寡核苷酸、构建体及重组细胞根据本发明的 一个方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。其中，该分离的寡核苷酸即为BG1s040基因。发明人惊 奇地发现，将该分离的寡核苷酸导入植物细胞中，能够显著提高植物细胞中BG1s040基因的表达，进而能够显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。其中，BG1s040基因的核苷酸序列如下所示:ATGAGGAAGGAAATTGTCATCAGGCTGCAGAGCTCTGAGAAGGGCCACAAGAAAGCTATCAAGGTTGCTGCTGCAGTCTCCGGTGTGGAATCCGTGACGCTCGCCGGCGAGGACAAGAACCTGCTGCTGGTGATCGGCTTCGGGGTGGACTCCAACGACCTCACCGAGAAGCTGCGGAGGAAGGTCGGCCACGCCGAGGTGGTGGAGCTGCGCACCGTCGACGCCGACGAGCTCATGCGCGTCGCCGCCGCCAACCAGTACCCGTACCGCTACTACCCCGGCGCGCCGCCCCCGGCCCCGTACTACGGCAACGGCGGGTACCCTCCTCCTCACCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGCTACTACACGCCGATGACGATGGCCACGGGTGGCTACTACGGCGGCGGCGGCGGCGGGTACCCGCAGTACGGGCAGTCGTCGTCGTACCCGCAGTACGGGCAGTCGTCGTCGTACTACCCGCCGGCGGCGGCGGCGACGACGAACACGCACACCGTCGTGCACCACCAGTACGCCAACAACGACCCGGACAGCTGCGCCATCATGTAG (SEQ ID NO:7)需要说明的是，本发明中所采用的BG1s040基因来源于普通野生稻元江(普通野生稻元江种子于2010年9月6日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:P201011)o根据本发明的另一些实施例，本发明的分离的寡核苷酸可以具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。根据本发明的再一些实施例，本发明的分离的寡核苷酸还可以为选自下列变体的任意一种:I)在高等严紧条件下能够与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列杂交的寡核苷酸，2)对SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰而获得的寡核苷酸，以及3)与SEQ ID NO:7所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一丨丨生的寡核苷酸。为了便于理解，下面将对高等严紧条件下进行杂交进行解释。首先，可以根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来对杂交条件进行分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据进行衡量。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm - 50C (低于探针Tm5°C )高等严紧性”发生在Tm以下约5 — 10°C 中等严紧性”发生在探针Tm以下约10 - 200C ;“低严紧性”发生在Tm以下约20 — 25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC=极低严紧性；3XSSC=低至中等严紧性；1XSSC=中等严紧性；0.5XSSC=高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。因而,本领域技术人员可以理解,实验人员能够通过改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度等，容易地控制杂交严紧性。根据本发明的一些具体示例，本发明前面所述的“在高等严紧条件下能够与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列杂交的寡核苷酸”，其所述的杂交的高严紧条件为:用 5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (pH8.0)溶液预洗；在 60-65。。或 65_70°C下在5XSSC中杂交过夜；随后用含0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 需要说明的是，在高等严紧条件下能够与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列杂交的寡核苷酸，其具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促进植物分蘖数目增多的活性。另外，在本发明中，所述“对SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰而获得的寡核苷酸“，是指分别或同时在SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个,或者不超过4-15个,或者不超过5-10个,或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。需要说明的是，该“对SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰而获得的寡核苷酸“具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促进植物分蘖数目增多的活性。在本文中所述的“与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”指的是这样一种寡核苷酸:相对于SEQ ID NO:7所不的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，除了 10个核苷酸不同外，该寡核苷酸的其他核苷酸序列与参考序列均相同。其中，本领域技术人员可以理解，“与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”可以通过下列方法的至少之一获得:以SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列为参考序列，将该参考序列中多达10%的核苷酸删除或用另一核苷酸替代；将一些核苷酸插入到该参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列总核苷酸数的5% ;在参考序列的基础上，选取一些核苷酸进行删除、插入和替换的组合，其中被删除、插入或替换的核苷酸可多达参考序列总核苷酸数的5%。其中，需要说明的是，上述对参考序列进行的变形可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，而与参考序列不同的核苷酸或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。根据本发明的实施例，可以通过BLAST、BLAST2.0 (执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得)确定序列同一性和序列相似性百分数(例如可参见 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402 和 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410，通过参照将其全文并入本文)。其中，在本发明中，所述“与SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”包括与SEQ ID N0:7所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当通过例如采用标准参数的BLAST分析确定序列同一性时，该寡核苷酸是指与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相比具有至少90%序列同一性，优选至少具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。需要说明的是,上述“与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促进植物分蘖数目增多的活性。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的寡核苷酸。发明人惊奇地发现，利用该构建体能够有效地将该分离的寡核苷酸即BG1s040基因导入植物细胞中，进而，能够通过在植物细胞中表达BG1s040基因显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株的分蘖数目，从而能够有效
提高植物产量。在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬 菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。根据本发明的实施例，构建体中还可以包含其他的元件，从而为构建体赋予额外的有益效果。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包含启动子序列和终止子序列。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在植物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列即BG1s040基因的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中BG1s040基因的表达效率。根据本发明的一些具体示例，本发明的构建体进一步包括玉米泛素(ubi)启动子和NOS终止子。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的植物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，该筛选标记基因可以为选自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和羧苄青霉素抗性基因的至少一种，优选霉素抗性基因和羧苄青霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源构建体的重组细胞的效率。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用:比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地确定构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。上面对根据本发明 实施例的构建体进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞含有前面所述的分离的寡核苷酸或构建体。根据本发明的一些实施例，该重组细胞可以为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选为农杆菌细胞。发明人发现，利用该重组细胞转染植物细胞，能够有效地将该分离的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物细胞中，进而，能够通过在植物细胞中表达BG1s040基因而显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株的分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。转基因细胞、植物及其制备方法根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物细胞的方法。根据本发明实施例，该方法包括:使用前面所述的构建体转化受体植物细胞；以及分离转基因植物细胞。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效制备包含BG1s040基因的转基因植物细胞，进而利用该转基因植物细胞能够有效获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的实施例，本发明的制备转基因植物细胞的方法，所适用的植物并不受特别限制，即受体植物细胞的来源不受特别限制。根据本发明的一些实施例，该受体植物细胞可以来源于单子叶植物。根据本发明的另一些实施例，该单子叶植物包括但不限于水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，优选为水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，津原101以及日本晴(其中，上述水稻品种均为市售可得的品种，例如可购自安徽徽商农家福有限公司)。根据本发明的一个优选实施例，该宿主细胞来源于日本晴水稻。根据本发明的实施例，使用本发明的构建体转化受体植物细胞的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以通过农杆菌转染法进行所述转化。由此，可以提高将构建体引入受体植物细胞中的效率，并且可以方便地筛选目的核酸序列与受体植物细胞的染色体成功地发生整合的转基因细胞，进一步能够提高制备转基因植物细胞的效率。需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞(即受体植物细胞)中的操作。根据本发明的一个实施例，在本发明的制备转基因植物细胞的方法中，受体植物细胞和转基因植物细胞均呈细胞、组织或器官的形式，优选呈组织的形式，更优选呈愈伤组织的形式。根据本发明的一个实施例，采用愈伤组织作为转化受体。由此，能够显著提高遗传转化效率。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“分离转基因植物细胞”是指，根据构建体所携带的核酸序列例如筛选标记基因或报告蛋白基因，以及所采用的遗传转化方法，选择相应的筛选方法，以便区分接受目的基因的细胞与未接受目的因的细胞，分离选择出接受构建体的植物细胞。例如，当构建体携带有筛选标记基因例如药物抗性基因时，能够通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来；当构建体携带有报告蛋白例如发光蛋白或者荧光蛋白时，可以采用:比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测，则连同载体接受并表达报告蛋白基因的细胞发出荧光。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地区分接受目的基因的细胞与未接受目的因的细胞，进而筛选分离出转基因植物细胞。根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种转基因植物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，该转基因植物细胞或其培养物是通过前面所述的制备转基因植物细胞的方法获得的。由此，利用该转基因植物细胞或其培养物，能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高的转基因植物。这里所使用的术语“培养物”指的是，将转基因植物细胞在适于生长的条件下进行培养，所得到的细胞衍生物，这些细胞衍生物具有与原始的转基因植物细胞相同的基因组。根据本发明的实施例，本发明的转基因植物细胞的来源不受特别限制。根据本发明的一些实施例，本发明的转基因植物细胞可以来源于单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因植物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:利 用前面所述的制备转基因植物细胞的方法，制备转基因植物细胞；以及对该转基因植物细胞进行培养，以便获得转基因植物。需要说明的是，这里所使用的术语“培养”应作广义理解，其涵盖了从转基因植物细胞获得植物个体过程中所经历的各种为细胞/细胞集合体提供能量的操作。需要说明的是，对转基因植物细胞进行培养的条件不受特别限制，任何能够实现“培养”的各种操作条件均可。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，后代植株分蘖数目明显提高，植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的一些实施例，在本发明的制备转基因植物的方法中，该转基因植物可以为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因植物或其后代。根据本发明的实施例，转基因植物或其后代是通过前面所述的制备转基因植物的方法获得的。相对于野生型，该转基因植物或其后代，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高。根据本发明的一些实施例，本发明的转基因植物可以为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴。根据本发明的再一方面，本发明还提供了另一种制备转基因植物方法。根据本发明的实施例，该方法包括:1)将权利要求2或3所述的构建体转化入植物愈伤组织，或利用权利要求4所述的重组细胞感染植物愈伤组织；2)利用所述愈伤组织培育转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，特别优选水稻，进一步优选日本晴。利用该方法能够有效地获得相对于野生型，持续分蘖能力显著增强、后代植株分蘖数目明显提高、植物产量显著提高的转基因植物。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种促进植物分蘖的方法。根据本发明的实施例，该方法为:根据前面所述的任意一种制备转基因植物的方法，制备转基因植物，使所述转基因植物表达水稻BG1s040基因。由此，能够有效地使得转基因植物或其后代，持续分蘖能力显著增强，植物产量显著提高。其中，根据本发明的一些实施例，所述植物为水稻。由此，获得的转基因水稻，相对于野生型，持续分蘖能力显著增强，产量明显提高。
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需要说明的是，本发明的BG1s040基因、构建体及其应用，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作才发现以及完成的。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。实施例1构建体制备一、BG1s040基因的PCR扩增和pMD18_T+BG1s040重组载体的构建1.PCR 扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号:DP320_02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongon Yuanjiang)(其由中国科学院昆明动物研究所董杨提供)的基因组DNA(gDNA)。根据BG1s040基因的碱基序列，设计一对PCR特异性扩增引物:上游引物Fl (SEQ ID NO:1)包含限制性酶切位点Spel，下游引物Rl(SEQ ID NO:2)包含限制性酶切位点BamHI。以上述提取的元江gDNA为模板，利用上游引物F1、下游引物Rl和高保真Ex TaqTM (TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系如表I所示。表1:BG1s040基因的PCR扩增体系
权利要求
1.一种分离的寡核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。
任选地，所述分离的寡核苷酸具有与SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列， 任选地，所述分离的寡核苷酸为选自下列变体的任意一种 1)在高等严紧条件下能够与SEQID NO :7所示的核苷酸序列杂交的寡核苷酸， 2)对SEQID NO :7所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰而获得的寡核苷酸，和 3)与SEQID NO 7所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一'丨生的寡核苷酸。
2.—种构建体，其特征在于，包含权利要求I所述的分离的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所的构建体，其特征在于，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式， 任选地，所述构建体呈质粒的形式。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求I所述的分离的寡核苷酸或权利要求2或3所述的构建体， 任选地，所述重组细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选为农杆菌细胞。
5.一种制备转基因植物细胞的方法，其特征在于，包括 使用权利要求2或3所述的构建体转化受体植物细胞；以及 分离转基因植物细胞， 任选地，所述受体植物细胞来源于单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴， 任选地，所述转化是通过农杆菌转染法进行的， 任选地，所述受体植物细胞和转基因植物细胞均呈细胞、组织或器官的形式，优选呈组织的形式，更优选呈愈伤组织的形式。
6.一种转基因植物细胞或其培养物，其是通过权利要求5所述的方法获得的， 任选地，所述转基因植物细胞来源于单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴。
7.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括 利用权利要求5所述的方法，制备转基因植物细胞；以及 对所述转基因植物细胞进行培养，以便获得转基因植物， 任选地，所述转基因植物为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，更优选水稻，进一步优选日本晴。
8.一种制备转基因植物方法，其特征在于，包括 1)将权利要求2或3所述的构建体转化入植物愈伤组织，或利用权利要求4所述的重组细胞感染植物愈伤组织； 2)利用所述愈伤组织培育转基因植物， 其中，所述植物为单子叶植物，优选水稻、谷子、小麦、高粱和玉米，特别优选水稻，进一步优选日本晴。
9.一种促进植物分蘖的方法，其特征在于， 根据权利要求7或8所述的方法，制备转基因植物，使所述转基因植物表达水稻BGIos040 基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了分离的寡核苷酸、构建体及其应用。其中，该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。将该分离的寡核苷酸引入植物细胞中，能够显著提高植物细胞中BGIos040基因的表达，进而能够显著增强植物的持续分蘖能力，提高其后代植株分蘖数目，从而能够有效提高植物产量。
文档编号C12N1/21GK103255149SQ20131016337
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者张耕耘, 全志武, 邹洪锋, 倪雪梅 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司