一株淡水小球藻及其在固定CO₂和生产微藻油脂中的应用的制作方法

专利名称：一株淡水小球藻及其在固定CO₂和生产微藻油脂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微藻生物技术领域。具体涉及一株淡水小球藻Chlorellasorokiniana XJ02及其在固定CO2和生产微藻油脂中的应用。
背景技术：
因全球化石燃料的大量使用，“温室效应”日益加重，而CO2作为对“温室效应”贡献最大的气体，约占总效应的65%以上。据世界气象组织2011年温室气体年度公报报道，大气中CO2浓度从工业化前的约280ppmv已增加到2010年的约390ppmv。目前，大气中CO2浓度的持续升高已经导致了严重的气候及环境问题。因此，在全球共同面对气候变化挑战、推进经济社会可持续发展的形势下，CO2减排及能源问题已成为世界各国政府关注的热点。近些年来，一些发达国家采用各种物理、化学和生物方法研究CO2的收集、浓缩及固定和转化。但比起传统物理化学CO2固存方法成本高、能耗大、环境友好性差等特点，生物CO2固定法是地球上最主要和最有效的固碳方式，，是环境友好型与资源节约型的可持续发展方法。生物CO2固定是指生物体如高等植物、光合细菌和微藻等以CO2为所需碳源经由光合作用的方式，将CO2转化为 生物质的过程，其所需能源直接来源于太阳光能。与植物及光合细菌相比，藻类具有光合速率高、繁殖快、环境适应性强、处理效率高、可调控以及易与其他工程技术集成等优点，且可获得高效、立体、高密度的培养，同时固碳后产生的大量藻体具有很好的利用价值，例如，可作为饲料、食品添加剂、生物乙醇及生物柴油等的制备原料。因此，微藻固碳减排技术不仅具有环保、经济效益，也为人类解决能源、环境问题提供了一条全新而有效的模式。随着社会经济发展及对能源需求的持续增长，石化资源的匮乏日渐突显，因此寻找一种持续可再生、环境友好型的能源形式成为各国科学家关注的重点。在众多的可再生能源(风能、地热能、水能、太阳能等)中，生物柴油以其在能量密度、燃烧性等方面与石化柴油具有极高相似性，甚至超过石化柴油，且具有易降解、基本不含硫及芳烃类化合物、对环境友好等特性，受到世界各国的广泛关注。一些发达国家于20世纪90年代初便开始了生物柴油的商业化生产，并主要以大豆和菜籽油为生产原料。我国生物柴油产业兴起较晚，目前，我国生产生物柴油的原料主要是大豆、油菜等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实及废餐饮油等。但是，这种以传统农业为基础的生物柴油生产方式，不仅产量低、成本高，而且不符合“不与农业争粮争地”的根本原则，因此不能满足生物柴油产业对原料持续增长的需求。研究发现许多藻类可以快速生长并在体内产生大量的油脂，被称为产油藻。产油微藻，即在一定条件下，微藻将CO2、碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为微藻细胞内大量贮存的油脂，且油脂含量超过生物总量20%的微型藻类。微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量大等优点而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。微藻在固定CO2的同时生产油脂以制备生物柴油技术已成为世界各国研究的热点。美国1978年启动了耗资2500万美元的水生物种项目，旨在利用微藻生产生物柴油，是开发微藻生物柴油起步最早的国家，但后来因经费精简、藻类制油成本过高于1996年终止，但美国科学家已经培育出了富油的工程小环藻。这种藻类在实验室条件下的脂质含量可达到60%以上(比自然状态下微藻的脂质含量提高了 3 12倍)，户外生产也可增加到40%以上，为后来的研究提供了坚实基础。2006 2008年，石油价格一度大幅上扬，大大刺激了微藻生物柴油产业化技术的开发，美国等发达国家的政府和企业在该领域纷纷投入巨资，在国际上掀起了一股势不可挡的热潮。2006年,美国Green Fuel技术公司和Arizona公共服务公司报道了以微藻为生物质原料制备生物柴油研发所取得的进展，两公司在亚利桑那州建立了可与1040兆瓦电厂烟道气相联接的商业化系统，成功地利用烟道气的CO2,大规模光自养培养微藻，并将微藻转化为生物燃料。同时由美国著名实验室和科学家组成的National Alliance,该联盟中的Live Fuels公司宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”，即微藻能源计划，计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。2010年6月29日美国能源部向个研究团队资助2400万美元以解决微藻可再生能源商业化规模生产各环节中的关键问题。2008年，美国国防部宣布投入2000万美元基金进行微藻生物柴油研究工作，旨在在2010年前证实海藻的生物质燃料能够实现商业化并成为JP-8喷气燃料的替代品，该项目由遍布美国的各个机构共同实施，包括美国加州大学圣地亚哥分校的Scripps海洋研究所、夏威夷生物能源研究所以及北达科他大学能源环境研究中心等。目前，美国的微藻能源公司已经占到世界的78%。此外，澳洲、日本、西欧、印度和南非的政府或企业也投入巨资进行微藻生物柴油的研究。如日本国际贸易和工业部曾资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目。该项目利用微藻来生物固定CO2,并着力开发密闭式光生物反应器技术，通过微藻吸收火力发电厂烟气中的CO2来生产生物质能源。2008年，英国碳基金公司启动了目前世界上最大的藻类生物燃料项目，投入2600万英镑用于发展相关技术和基础设施，该项目预计到2020年实现商业化。荷兰AlgaeLink公司是一家拥有工业化藻类培养设备和藻油加工技术的跨国公司，该公司向全球销售其反应器，并提供相关技术支持。2008年4月该公司与荷兰航空公司签订了利用藻油开发航空燃油的协议。此外，以色列一家公司于2007年对外展示了利用海藻吸收CO2，将太阳能转化为生物质能的技术，每5千克藻类可生产I升燃料。近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划的重点项目之一。各高校和科研院所都开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。目前，一些企业及研究机构也正在进行微藻生产生物柴油的中试培养。新奥科技发展有限公司的“C02—微藻一生物柴油”关键技术研究项目已经通过中试,并在内蒙古达拉特旗建设280hm2的微藻养殖基地。2009年，中国石化股份有限公司与中科院联合启动了“微藻生物柴油成套技术”项目，目标计划到2015年完成万吨级工业生产装置。虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石燃油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前低下的市场需求，且因微藻的大规模培养水平尚有限，这也使得微藻生物柴油的价格居高不下；二是微藻生物质资源不足且获得困难。而将“微藻生物柴油生产”及“co2减排”高度耦合研究，不仅可以降低微藻生物柴油生产成本，实现温室气体的减排并且可获得其 它高附加值产品来创造额外的生态及社会经济效益，而且可实现二氧化碳从“处理工艺”向“生产工艺”的转化。这种新理念为缓解当前能源紧缺和温室效应的形势提供了新途径，也为微藻生物柴油的生产提供了一种可行性研究方案，能创造一种双赢的局面。

发明内容
本发明的目的是提供一株淡水小球藻，该小球藻株在生产高产量微藻油脂的同时可以耦连高浓度CO2的高效固定，以解决当前微藻油脂生产成本过高的问题。一株淡水小球藻Chlorella sorokiniana XJ02，其保藏号是CCTCC NO:M2013104。所述的小球藻株固定CO2的同时生产微藻油脂的方法，包括以下步骤:I)将经过指数培养的藻株接种于BG-1l灭菌培养液中，接种终浓度为IXlO7 6X IO7个/ml，，培养温度为20 35°C，培养基pH5 9，光照强度为2500 60001ux，光照时间为12h/d，通气量为0.2 0.5vvm，其中CO2体积含量为0.03 30%，培养10-14天后收获；2)油脂提取:将收获藻液离心分离，所得藻泥经恒温干燥后提取。

所述藻株培养温度优选为28°C ;所述藻株培养时pH值优选为8.0 ;所述藻株培养时光照强度优选为35001ux ;所述藻株培养时通气量优选为0.3vvm ;所述藻株培养时CO2体积含量优选为0.03 20% ;所述藻株培养时间优选为12天。步骤2)所述的恒温干燥的温度为60 80°C。从取自甘肃天水发电厂附近微酸性废水样中分离筛选到一株小球藻Chlorellasorokiniana XJ02，其保藏号是CCTCC NO:M2013104。培养基为BG-11培养液，该藻株呈球状或卵形，直径在3 4μηι之间，每个细胞内有一个周生、杯状或片状的色素体,具有I个细胞核；细胞壁较薄。普通通气培养条件下，测定其蛋白含量为30%左右，油脂含量为18 29%之间，多糖含量为25%左右，富含绿叶素。经形态学鉴定和18S rRNA、ITS-2扩增序列分析，确定该藻株为小球藻，该藻株适合培养温度和pH范围较广,分别是20 35°C和5 9之间，可以耐受的CO2浓度范围为0.03 30%之间，比较适合在日照较好、温度较高、水体偏酸性的内陆地区培养。本发明油脂提取与测定:将收获藻液离心分离，所得藻泥经60 80°C恒温干燥后测定CO2固定效率及采用氯仿甲醇法分析油脂含量，利用气相色谱法分析油脂脂肪酸组成。(均为常规分析过程)与已报道的一些小球藻相比，本发明提供的淡水小球藻Chlorella sorokinianaXJ02具有以下优势:I)应用潜力好:微生物油脂是目前唯一可以完全替代石化燃油的生物质柴油原料来源，本发明筛选到了一株小球藻，环境适应能力强，能够在微酸性环境中很好的生长，在PH5 9的环境中均可较好的生长；而且耐受温度范围较广，在20 35°C下生长良好；C02耐受范围较广，能够耐受0.03 30%的C02，而且在20%C02 (烟道气排放CO2的最高浓度)条件下也具备较高的CO2固定效率，为240mg/L/d，表明该藻株具备可固定烟道气CO2的潜能；另外，该藻株的油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，表明其具备优质生物柴油生产的潜能。该藻株与已报道的其他小球藻株相比优势显著。2)副产品经济价值高:该小球藻在一般通气培养条件下蛋白质含量为30%左右(Bradford法测定)，多糖含量为25%左右(硫酸-蒽酮法测定)，不饱和脂肪酸及各种维生素等物质普遍存在于小球藻等单细胞绿藻中，在提取油脂的同时这些高附加值物质也可以被闻效利用，可提闻经济效益。3)培养周期短、产率高:本发明的藻株生长周期较短，一般培养12-14天便能达到生长稳定期；且能够在高效固定0.03 20%的CO2的同时获得较高的干藻粉生物量和油脂含量，其中在5%C02条件下培养12天的干藻粉生物量得率达2250mg/L，在20%C02条件下培养12天的油脂含量可达41% (油脂占细胞干重)，油脂产率为52mg/L/d。与现有生物柴油生产原料植物种子等(生产周期一般为半年或一年时间，含油量一般为10%左右)相比，产率大大提高，培养周期和干藻粉得率均优于现已报道的其他小球藻株。本发明藻株保藏信息如下:小球藻Chlorella sorokiniana XJ02 ；保藏号为:CCTCCNO:M2013104保藏日期:2013年3月26日；保减单位名称:中国典型培养物保减中心；保藏单位地址:中国武汉，武汉大学。


图1为本发明的淡水小球藻Chlorella sorokiniana XJ02的藻细胞显微照片；其中a, b分别为光学显微镜和扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有10ml BG-1l灭菌培养液的小试管中，于光照培养箱28°C温度，35001ux光照强度下静置培养，生长到指数末期后以1:10接种比例扩大培养，具体操作为:将此IOml微藻培养液转接到装有100ml BG-1l灭菌培养液的三角瓶中，于光照培养箱28°C温度，35001UX光照强度下静置培养，待其生长到指数末期时为已扩大培养好的微藻细胞液。配制BG-1l培养基IL于气升式光合生物反应器中，接入已扩大培养的微藻细胞液，使培养基中细胞密度为6X IO7个/ml。初始pH8.0，温度28°C，35001ux光照强度下，通入0.23vvm的空气(CO2含量为0.03% (C02体积含量))，培养12天。离心收集藻细胞，60 80°C恒温干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为720mg/L，生物量产率为70mg/L/d，CO2固定效率为130mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为29.2%。油脂脂肪酸组成主要为C16、C18的短链脂肪酸。实施例2按照实施例1的方法扩大培养好微藻细胞液。配制BG-1l培养基IL于气升式光合生物反应器中，接入已扩大培养的微藻细胞液，使培养基中细胞密度为6X IO7个/ml。初始pH8.0，温度28°C，35001ux光照强度下，通入0.23vvm的空气(CO2含量为5%)，培养12天。离心收集藻细胞，60 80°C恒温干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2250mg/L，生物量产率为187mg/L/d，CO2固定效率为343mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为30%。油脂脂肪酸组成主要为C16、C18的短链脂肪酸。实施例3按照实施例1的方法扩大培养好微藻细胞液。配制BG-1l培养基IL于气升式光合生物反应器中，接入已扩大培养的微藻细胞液，使培养基中细胞密度为6X IO7个/ml。初始pH8.0，温度28°C，35001ux光照强度下，通入0.23vvm的空气(CO2含量为20%)，培养12天。离心收集藻细胞，60 80°C恒温干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为1520mg/L，生物量产率为127mg/L/d，CO2固定效率为240mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为41%。油脂脂肪酸组成主要为C16、C18的短链脂肪酸。实施例4按照实施例1的方法扩大培养好微藻细胞液。配制BG-1l培养基IL于气升式光合生物反应器中，接入已扩大培养的微藻细胞液，使培养基中细胞密度为6X IO7个/ml。初始pH8.0，温度28°C，35001ux光照强度下，通入0.23vvm的空气(CO2含量为30%)，培养12天。离心收集藻细胞，60 80°C恒温 干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为950mg/L，生物量产率为79mg/L/d，CO2固定效率为145mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为38%。油脂脂肪酸组成主要为C16、C18的短链脂肪酸。
权利要求
1.一株淡水小球藻Chlorella sorokiniana XJ02,其特征在于,保藏号是CCTCC NO:M2013104。
2.权利要求1所述的小球藻株固定CO2的同时生产微藻油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将经过指数培养的藻株接种于BG-1l灭菌培养液中，接种终浓度为IXIO7 6X IO7个/ml，培养温度为20 35°C，培养基pH5 9，光照强度为2500 60001ux，光照时间为12h/d，通气量为0.2 0.5vvm，其中CO2体积含量为0.03 30%，培养10-14天后收获； 2)油脂提取:将收获藻液离心分离，所得藻泥经恒温干燥后提取。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述藻株培养温度为28°C； 所述藻株培养时pH值为8.0 ;所述藻株培养时光照强度为35001ux ;所述藻株培养时通气量为0.3vvm ;所述藻株培养时CO2体积含量为0.03 20% ;所述藻株培养时间为12天。
4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于:步骤2)所述的恒温干燥的温度为60 80。。。
全文摘要
本发明公开了一株淡水小球藻Chlorella sorokiniana XJ02及其在固CO2定和生产微藻油脂中应用，该小球藻株保藏号为CCTCC NOM 2013104。此发明的小球藻株能够高效固定0.03～20%的CO2，CO2固定效率为130～343mg/L/d，生物量(干重)浓度为720～2250mg/L，油脂含量为29.2～41%，其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。此小球藻株与已报道的微藻藻种相比具有更高的CO2固定效率及生物量产量，并可通过选择适合的培养条件，得到高产量的微藻油脂，因此可以大大降低微藻油脂生产成本，为高效固定环境中CO2及微藻油脂制备生物柴油提供了一株优良的生产藻种。
文档编号C12R1/89GK103215190SQ20131016301
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者夏金兰, 金雪洁, 巩三强, 聂珍媛 申请人:中南大学