专利名称：强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及一类强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用。
背景技术：
蛋白质的分泌系统不仅是蛋白质分选、定位和实现生理功能的前提，更是基因工程及蛋白质工程技术开发的重要手段。人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。大肠杆菌表达系统以其遗传背景清楚、操作简单、能在廉价培养基中迅速生长及易于大规模发酵培养等特点而备受关注；目前大肠杆菌体系已用于制备多种酶制剂，甚至一些药用蛋白质，如干扰素、胰岛素和人血清蛋白等，在生物技术领域取得了令人瞩目的成果O在大肠杆菌中，重组蛋白在原则上可以被以下几种方式生产:1、可溶性蛋白胞内生产；2、包涵体胞内生产；3、分泌至周质空间或胞外培养基中。大肠杆菌体系适合于生产翻译后无需修饰加工的蛋白质，且由于大肠杆菌缺乏蛋白折叠过程中需要的辅助因子，往往使中间体大量积聚，易形成包涵体沉淀，还须经过复性等繁琐过程；而周质氧化型的氧化还原环境有利于蛋白质的折叠。如果蛋白质跨过细胞的内膜定位于周质空间，甚至穿过细胞外膜直接分泌至胞外培养基中，可以极大简化下游复性及分离纯化工艺，减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢负担，显著提高表达量。现有的分泌表达体系大多数是分泌到周质空间，获取重组蛋白仍然需要细胞破碎和纯化。少数分泌到胞外的则由于大肠杆菌本身的蛋白质分泌系统不够完善，或人类对其分泌系统认识的局限性，导致了分泌效率极低及融合蛋白的后加工问题。信号肽是一类10-60个氨基酸左右的多肽，一般位于分泌蛋白的N端。利用信号肽分泌表达蛋白，一般操作方法是将目的蛋白的编码基因克隆到信号肽序列后端，在宿主中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合，依靠蛋白质前体N端信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或分泌信号识别颗粒的结合、膜定位或分泌出胞外。尽管胞外分泌表达策略相比其他表达方式有着显著的优势，但是目前在大肠杆菌体系中广泛运用此种策略仍有诸多限制。因此，拥有能够携带目的蛋白分泌出胞外的信号肽是先决条件，并且即使信号肽具有介导蛋白胞外分泌的能力，也并不表明特定的信号肽对所有的重组蛋白具有这种介导能力或者具有同样水平的介导能力。每个重组蛋白具有自己特定的编码基因，信号肽和重组蛋白的过渡点序列不同，而且重组蛋白自身的结构也有差异，因而重组蛋白的分泌水平取决于其信号肽的最优化水平、目标蛋白有利的跨膜结构以及它们之间的匹配度水平。大肠杆菌表达系统中，分泌蛋白穿越质膜的基本分泌途径以Sec或Tat这两种系统为主，例如外膜 蛋白(OmpA)信号肽、果胶酸脂裂解酶(PelB)信号肽通过Sec途径，三甲胺N氧化物还原酶(TorA)信号肽通过Tat途径，这两种类型的信号肽都有成功运用于分泌表达外源蛋白的案例。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种具有增强信号肽分泌效率的功能的强分泌性信号肽增强小肽模序，使得通过在诸如ompA信号肽或pelB信号肽前端融合添加本发明的小肽模序，可以实现上述信号肽在大肠杆菌体系中的分泌表达外源蛋白的能力。本发明的另一个技术目的在于提供上述具有增强信号肽分泌效率的功能的强分泌信号肽增强小肽模序的应用，即将此小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。本发明中的术语“分泌”，是指蛋白质或肽的分子被转运到细菌细胞的外部，而且它也包括这样的情况:其中蛋白质或肽分子最终以完全游离的形式置于培养基中，以及其中部分蛋白质处在细菌外部或部分蛋白质存在于细菌的周质空间。本发明中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义:蛋白质氨基酸或多核苷酸的“变体”是指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述“改变”可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可以具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。“缺失”是指氨基酸序列或核苷酸序列中的一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。“插入”或“添加”是指氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与原先分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下:一、强分泌性信号肽增强小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列:Μ( α X β Y Y /α Υβ X Y )η,其中X代表酸性氨基酸；Y代表碱性氨基酸；α为0-2个中性氨基酸；β代表0-2个中性氨基酸；y代表1-10个中性氨基酸；η 为 1-3。其中，通式中的“ / ”为“或者”之意。进一步的，X代表的酸性氨基酸优选为Glu或Asp。进一步的，Y代表的碱性氨基酸优选为Arg或Lys。进一步的，中性氨基酸优选为Ala、Cys、Leu、Val、He或者Phe。进一步的，当n=l时，本发明的小肽膜序的增强分泌效果较佳。进一步的，作为本发明的一个最优选的实施例，当α为I个中性氨基酸，β为O个中性氨基酸，Y为2-5个中性氨基酸，X为Glu，Y为Arg时，该小肽膜序的增强分泌效果最佳。
因此，根据上述通式得出的本发明所保护的小肽模序，其例如原始小肽模序为:MERACVAV ;则其衍生的类似物可以如下变化:MREACVAVMAERACVAV ；MEARACVAV ；MDKACVAV ；MERLIVFAV;...。或小肽模序的叠加如MERACVA+VEARLIVFAV等，更多衍化类型详见本发明具体实施方式
。二、本发明还要求保护本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的变体，其具有对本发明的强分泌性信号肽增强小肽模序的其中I个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或性质相似的氨基酸取代I个或多个氨基酸残基。根据本领域技术人员的公知常识可知，这种变体仍具有信号肽的特性或增强分泌的功能，因此，其也应当属于本发明要求保护的强分泌性信号肽增强小肽模序的范围。三、编码具有本发明所示的强分泌性信号肽增强小肽模序的多肽、类似物或衍生物的多核苷酸。根据本领域技术人员的公知常识可知，这种类似物或衍生物的多核苷酸仍具有信号肽的特性或增强分泌的功能，因此，其也应当属于本发明要求保护的强分泌性信号肽增强小肽模序的范围。四、一种含有外 源多核苷酸的重组载体，其是由本发明第三点所述的多核苷酸与质粒载体构建而成的重组载体。五、一种含有外源多核苷酸的遗传宿主细胞，它是由第四点所述的重组载体转化或转导的宿主细胞。六、本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，即将本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。具体的，是指通过在信号肽前端融合添加本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，以此构建的分泌载体转化进大肠表达宿主后诱导表达，以实现强分泌性信号肽增强小肽模序的增强分泌功能。在本发明的具体实施方式
中,采用Arthrobacter arilaitensis来源的果糖苷酶FRU6和来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis的葡聚糖酶BGL作为目标蛋白，普通的信号肽选自外膜蛋白的ompA和来自果胶酸脂裂解酶的pelB信号肽。通过在ompA或pelB信号肽前端融合添加本发明的小肽模序，以此构建的分泌载体转化进大肠表达宿主后诱导表达，通过检测方法验证本发明的小肽模序的增强分泌功能。本发明采用的宿主为E.coil BL21 (DE3)，以大肠杆菌pET_22b作为载体构建的基本框架，去除原pET-22b中的peIB信号肽序列。通过重叠PCR的方法融合ompA信号肽/peIB信号肽和果糖苷酶FRU6或葡聚糖酶BGL，设计上游引物将小肽模序基因添加到信号肽基因序列前。通过酶切位点的酶切和连接操作，构建成分泌增强型表达载体pET-EompA-FRU6和pET-EpelB-FRU6 以及 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL。将含有融合的增强分泌型信号肽与果糖苷酶FRU6 (或葡聚糖酶BGL)基因的重组质粒载体 pET-EompA-FRU6 和 pET-EpelB-FRU6 (或 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL)转化进宿主大肠杆菌BL21后，分别命名为BL21/pET-EompA-FRU6和BL21/pET_EpelB_FRU6 (或BL21/pET-EompA-BGL 和 BL21/pET-Epe 1B-BGL )。在 LB 培养基进行诱导表达,诱导剂为 IPTG。上述两种目标蛋白分泌表达后的结果通过检测培养基细胞内外的酶活以及SDS-PAGE 分析。本发明采用的分泌实例为果糖苷酶？冊6以及3-1，3-1，4葡聚糖酶86匕果糖苷酶FRU6 (分子量约为55kDa,来源于Arthrobacter arilaitensis NJEM01,菌种保藏号CCTCC M2012155)。果糖苷酶系统分类号为EC3.2.1.80，是一种胞外酶，特异性地催化水解由β -D-果糖组成的果聚糖分子中的非还原性末端2，l-β -糖苷键或2，6-β -糖苷键，此夕卜，还可水解菊糖、蔗糖、棉子糖等。在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值。葡聚糖酶BGL(分子量约为28kDa，EC3.2.1.73，β -葡聚糖酶，来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis)是一种内切水解酶，能高效、转移性地水解β -葡聚糖中与β -1, 3糖苷键毗邻的β -1，4糖苷键，从而减少谷物中葡聚糖给工业生产带来的负面影响，在啤酒酿造业、饲料业等领域有着十分重要的应用。除上述以外，本发明的有益效果还在于:本发明的可增强分泌功能的小肽模序，其对目标蛋白的增强分泌效果显著。运用在果糖苷酶FRU6的分泌表达实例的实验显示，在ompA信号肽前添加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了达5.1倍，在pelB信号肽前添加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了达5.4倍。运用在葡聚糖酶BGL的分泌表达实例显示，小肽模序对ompA信号肽最高提高了 2.3倍，对PelB信号肽最高提高了 2.5倍。另夕卜，本发明所构建的分泌表达载体可以运用到多种重组蛋白生产上。
图1重组载体pET-EompA_FRU6的图谱；其中，ompA SP:外膜蛋白A信号肽编码序列；FRU6:果糖苷酶FRU6编码序列；Ampsequence:氨节霉素抗性基因编码序列`；T7promoter:T7启动子。图2小肽模序增强分泌效率与发酵时间的关系。图3LB 培养基中 BL21/pET-EompA-FRU6 和 BL21/pET_EpelB_FRU6 与阴性对照发酵上清液酶活力比较。图4LB培养基中BL21/pET-EompA-FRU6发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白质Marker ; I和2:阴性对照，果糖苷酶FRU6前不含信号肽序列的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4:BL21/pET-ompA-FRU6菌株发酵液上清和菌体破碎上清。5和6:BL21/pET-EompA-FRU6菌株发酵液上清和菌体破碎上清。(pET-EompA-FRU6质粒中，ompA信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为果糖苷酶FRU6成熟肽分子量大小位置。图5LB培养基中BL21/pET-EpelB-FRU6发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白质Marker ;1和2:阴性对照，果糖苷酶FRU6前不含信号肽序列的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4:BL21/pET-pelB-FRU6菌株发酵液上清和菌体破碎上清。5和6:BL21/pET-EpelB-FRU6菌株发酵上清和菌体破碎上清。(pET-EpelB-FRU6质粒中，pelB信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为果糖苷酶FRU6成熟肽分子量大小位置。
图6LB培养基中BL21/pET-EompA-BGL发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白质Marker ;1和2:阴性对照，葡聚糖酶BGL前不含信号肽序列的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4:BL21/pET-ompA-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清。5和6:BL21/pET-EompA-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清。(pET-EompA-BGL质粒中，ompA信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为葡聚糖酶BGL成熟肽分子量大小位置。图7LB培养基中BL21/pET-EpelB-BGL发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M为蛋白质Marker ；1和2:阴性对照，葡聚糖酶BGL前不含信号肽序列的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4:BL21/pET-pelB-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清；5和6:BL21/pET-EpelB-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清。(pET-EpelB-BGL质粒中，peIB信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为葡聚糖酶BGL成熟肽分子量大小位置。
具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用涉及质粒、试剂等材料均可从商业途径获得。实施例1.小肽增强模序在果糖苷酶分泌表达上的应用首先,本实施例所述的果糖苷酶Fru6基因的来源是:Arthrobacter arilaitensisNJEMOl菌，为本发明人的在先中国专利申请CN102732456A，该菌株的保藏编号为=CCTCCNO:M2012155o 本实施例所涉及的所有引物均由英骏公司合成，见表I。以下引物编号统一用“P”加序号来表示，例如，表2中的第45号引物，其代码即P45，其在序列表的编号为SEQ ID NO:45。表I实施例1所需的引物和合成序列的核苷酸序列
SEQiDNO引物核苷酸序列(S’-3’)^
1G ('C AC t G Λ Λ (:(:: AG TG(X: TC G
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3Λ!(；ΛΛΛΛΛ(；Λ( Λ ；(ΤΛ1 i,t (,4(::TGGT r<::GGTGG( AG( TTGGGi TAC GG I AGf GAAA
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_10_CCGGAATTCTTACTTTCCTACTCCTTTGCC_注:表中下划线部分所示为限制性酶切位点。(I)果糖苷酶FRU6基因获取:以 Arthrobacter arilaitensis NJEMOl 菌的基因组为模板，采用引物Pl和P2进行PCR反应扩增出果糖苷酶FRU6的基因片段(不含该酶自身信号肽序列)。克隆到克隆载体PMD18-T载体中，得到PMD-T-FRU6，转化进克隆宿主DH5 α中，DNA序列测定以验证其正确性。(2)信号肽与果糖苷酶基因的融合:人工合成ompA和pelB信号肽基因序列(即引物Pll和引物P12)，提取第(I)步中的质粒PMD-T-FRU6。通过设计重叠PCR引物P3-P6或P7-P10,分别将果糖苷酶FRU6和信号肽ompA或pelB融合，其中P6和PlO均带有EcoR I酶切位点。(3)增强分泌型载体的设计:以小肽模序氨基酸序列为MERACALA，更多小肽模序见表2和表3。以第二步中的融合基因为模板，通过设计上游引物P45与P46，P45与P46分别均带有Nde I酶切位点。通过普通PCR反应，引物P45与P6联用可以使得小肽模序基因添加到ompA信号肽基因前；引物P46和PlO联用可以使得小肽模序基因(如小肽模序氨基酸序列为MERACALA)添加到pelB信号肽基因前。经Nde I和EcoR I双酶切获得黏性末端的目的片段。将pET_22b载体(英骏公司购得)也用限制酶Nde I和EcoR I进行酶切降解，回收去除pelB信号肽序列的质粒大片段。然后将回收的质粒大片段和增强分泌型信号肽与果糖苷酶融合基因的酶切产物，经T4连接酶连接后得到pET-EompA-FRU6 (质粒图谱见图1)和pET-EpelB-FRU6(质粒图谱与前者类似，故略)。转化进克隆宿主大肠杆菌DH5 α中，DNA序列测定以验证其正确性。表2对应果糖苷酶涉及的增强分泌的小肽模序氨基酸序列及引物和酶活
权利要求
1.强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于其具有如下通式的氨基酸序列Μ(αΧβΥγ/α ΥβΧγ)η, 其中X代表酸性氨基酸； Y代表碱性氨基酸； α为0-2个中性氨基酸； β代表0-2个中性氨基酸； Y代表ι- ο个中性氨基酸； η 为 1-3。
2.根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的X代表的酸性氨基酸为Glu或Asp。
3.根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的Y代表的碱性氨基酸为Arg或Lys。
4.根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的中性氨基酸为 Ala、Cys> Leu、Val、Ile 或者 Phe。
5.根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的η为I。
6.根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的α为I个中性氨基酸，β为O个中性氨基酸，Y为2-5个中性氨基酸，X为Glu，Y为Arg。
7.权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的变体，其具有权利要求I的强分泌性信号肽增强小肽模序的其中I个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或性质相似的氨基酸取代I个或多个氨基酸残基。
8.编码具有权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的多肽、类似物或衍生物的多核苷酸。
9.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其是由权利要求8所述的多核苷酸与质粒载体构建而成的重组载体。
10.一种含有外源多核苷酸的遗传宿主细胞，它是由权利要求9所述的重组载体转化或转导的宿主细胞。
11.权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，其特征在于将强分泌性信号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。
全文摘要
本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及一类强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用。本发明的强分泌性信号肽增强小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列M(αXβYγ/αYβXγ)n，其中X代表酸性氨基酸；Y代表碱性氨基酸；α为0-2个中性氨基酸；β代表0-2个中性氨基酸；γ代表1-10个中性氨基酸；n为1-3。本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，即将本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。
文档编号C12N9/42GK103254277SQ20131016245
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者何冰芳, 陈文华, 米兰, 吴珊珊, 朱芸, 陈珊珊 申请人:南京工业大学