专利名称：一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌鉴定领域，具体涉及一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒及其应用。
背景技术：
引起奶牛乳房炎的病原菌较常见的有20多种。但国内外学者的大量研究结果表明临床上以葡萄球菌和链球菌感染弓I起的乳房炎较为常见，约占总致病菌的90 % -95 %。其中无乳链球菌引起的乳房炎在乳房炎总发病率中占非常大的比例。李宏胜等(2004)从2858份临床型、隐性乳房炎奶样和健康奶样中分离鉴定出与乳房炎有密切关系的病原菌12种1968株，其中无乳链球菌总检出率最高(38.47%)，并且证实无乳链球菌可引起奶牛的急性、亚急性和慢性乳房炎，而且临床上经常导致乳房炎经久不愈，给奶牛业造成非常严重的损失。黄瑛等(2007)从临床型乳房炎的105份样品中分离到76株病原菌，其中无乳链球菌所占比例高达76.32%。邓海平等(2009)从内蒙古地区采集的100份奶样中分离到124株致病菌，其中无乳链球菌和金黄色葡萄球菌所占比例最高，均为29.03%。易明梅等(2009)从在上海郊区4个奶牛场采集的临床型和隐性乳房炎患牛的126份奶样中共分离到3种主要病原菌107株，其中无乳链球菌占分离菌株的25.23%。王旭荣等(2012)对山西采集的76份乳房炎奶样中分离的无乳链球菌所占比例为11.24%ο可见，无乳链球菌在奶牛乳房炎致病病原中占有非常重要的地位。无乳链球菌不仅是引起奶牛乳房炎的主要病原菌，也是引起人类新生儿发病和死亡的最重要感染病原，该病原菌在人医上亦称B群链球菌(GBS)，主要引起婴幼儿的肺炎、脑膜炎、败血症等。资料显示，在非怀孕成人中，侵袭性GBS病的发病率有所增加，这些病例大多见于有糖尿病、神经损伤、乳腺癌和肝硬化等疾病的人，65岁以上成人死于侵袭性GBS病的危险性最高。而且GBS作为在非 妊娠女性和男性泌尿生殖道感染病原菌的作用也受到了医务人员的重视。林伟华等(2010)在58份链球菌阳性样品中检出B型无乳链球菌阳性率为33%。众多研究发现GBS出现了不同耐药谱的菌株，而且不同地区和不同部位分离的GBS的耐药谱和耐药程度都不太相同，但值得注意的是GBS的耐药谱在不断增大，对青霉素、红霉素、林可霉素等多种药物的耐药率呈上升趋势。牛源性无乳链球菌的耐药谱也在扩大，耐药强度增加，对青霉素、氨苄青霉素、链霉素、红霉素、恩诺沙星和复方新诺明等有了较强的耐药性，其耐药率有的甚至高达61.74%-85.22%。目前对于牛源性无乳链球菌的鉴定主要还是以形态学观察和生化鉴定为主，而PCR扩增和基因测序等方法在临床上使用的还很少。国内外学者研究结果表明，对于无乳链球菌的鉴定，单纯使用一种方法去鉴定都不可避免出现结果不确定及准确率不高的问题。因此，要准确鉴定该菌必须应当考虑到联合应用这些方法。目前临床上使用最多的形态学观察和生化鉴定的程序繁琐复杂，主要包括细菌分离、镜检、纯化、生化反应及结果判断等。常规生化鉴定项目主要包括七叶苷、CAMP反应、马尿酸钠、甘露醇、山梨醇、甘油、美兰牛奶、
6.5%NaCl、PH9.6肉汤和胆汁等十多项试验。使用商品化生化检测试剂，即使试验顺利也需要7-10天才能获得全部的生化鉴定结果，如果试验不顺利或者样品增多所花费的时间会更长，而且有些病原菌还会出现无法判定结果的情况。而目前国际上通用的梅里埃API细菌鉴定试剂条(生化鉴定)与本发明鉴定所需时间差不多，但也存在操作复杂，鉴定成本昂贵，鉴定结果有时会出现不确定性的缺陷。单纯的PCR有时会出现非特异性条带的干扰出现结果不准确的现象。基因测序虽然准确率很高，但存在成本高、时间长等缺陷，影响了其在临床上的大量推广使用。中国发明专利申请CN201210368104公开了一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，通过反转录的方法将菌体内单拷贝的cfb基因转变为多拷贝，再通过环介导等温扩增技术对目标基因进行检测，从而大大提高检测灵敏度。中国发明专利申请CN201210260204公开了一种应用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及检测方法，可用于鱼类养殖场的病原检测。中国发明专利申请201110169835.6的专利公开了一种主要是针对鱼源无乳链球菌的一种检测方法。中国发明专利申请200580031188公开了一种采用酯酶活性来检测无乳链球菌，其特征在于使用含有至少一种酯酶酶促底物的反应培养基。中国发明专利申请200580031157.X公开了一种采用α -葡糖苷酶活性检测无乳链球菌，特征是使用含有至少一种α -葡糖苷酶酶促底物的反应培养基来检测和鉴定无乳链球菌。
发明内容
本发明的目 的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种将细菌形态学观察、3%H202、CAMP试验和优化的PCR检测方法联合使用，简化鉴定程序，提高鉴定的敏感性和特异性，降低细菌分离鉴定的成本和时间的无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，所述试剂盒中包括以下试剂:绵羊脱纤血平板、3%Η202、金黄色葡萄球菌株、特异性PCR反应液、阳性对照DNA。进一步的，上述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，所述特异性PCR反应液由Premix Ex 酶、引物Ρ1、引物Ρ2组成；
所述引物序列为:
Pl:5/ -CTATTGACATCGACAATGGCAGC-3;；
Ρ2:5/ -ATACGTGAACGTGGTCATAGTGG-3';预期扩增片段为 1270 bp。本发明的第二个目的是提供了一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用。进一步的，上述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤:
1)细菌分离:将待检样品无菌接种于绵羊脱纤血平板上，划线进行细菌分离；
2)镜检:将步骤I)分离的细菌，置37°C温箱中培养18-20h，将肉眼观察菌落为灰白色或毛玻璃色、湿润、隆起、边缘整齐的小的单个菌落挑取到营养肉汤管中，37 0C温箱中培养18-20 h ;将待鉴定的细菌菌液涂片，革兰氏染色，显微镜观察后，以革兰氏阳性、正圆或椭圆、成丛或成对、短链或长链排列的，初步判定为G+球菌属；
3)接触酶试验:将步骤2)得到的初步判定为G+球菌属的样品进行接触酶试验，以结果为阴性的，初步判定为链球菌属；
4)CAMP试验:将步骤3)中初步判定为链球菌属的样品进行CAMP试验，以CAMP试验结果为阴性判定为非无乳链球菌，以CAMP试验结果为阳性判定可进行下一步鉴定；
5)PCR检测:将步骤4)中，CAMP试验结果为阳性的菌株的肉汤培养物提取细菌DNA，加入特异性PCR反应液中进行特异性PCR扩增；PCR反应体系为特异性PCR反应液27 μ L，待检细菌DNA模板60-120ng，补充灭菌超纯水至终体积50 μ L ;阳性对照的反应体系为:特异性PCR反应液27 μ L，阳性对照DNA 5 μ L，补充灭菌超纯水至终体积50 μ L ;所述PCR的反应条件为:95°C预变性5min后进入循环，循环参数94°C lmin，45°C 1.5min，72°C 1.5min，30个循环后，72°C延伸IOmin ;反应结束后，取PCR产物10 μ L在10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。以待检细菌样品为革兰氏阳性球菌、接触酶阴性、CAMP阳性和PCR扩增出特异性1270bp的目的片段进行判定为无乳链球菌。本发明的有益效果为:本发明提供的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，将细菌形态学观察、接触酶试验、CAMP反应和PCR检测联合使用，能够简化检测程序，特异性强，敏感性提高15%以上，且鉴定成本低、耗时短(只需3天)，既可以分离获得无乳链球菌菌株，又可以准确鉴定，可用于人或奶牛的乳样、宫颈粘液、阴道拭子等样品的分离鉴定。
图1为CAMP试验结果图。图2为无乳链球菌的特异性扩增产物的电泳图。其中，M.DL2000 DNA标准，泳道1-3为无乳链球菌的特异性扩增产物。图3为无乳链球菌和对照菌株的特异性扩增产物电泳图。其中，M.DL2000 DNA标准，泳道I为无乳链球菌的特异性扩增产物；泳道2_8分别为乳房链球菌、停乳链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓隐秘杆菌的扩增产物；泳道9为空白对照。图4为PCR方法的灵敏性检测结果图。其中，M.DL2000 DNA 标准，
泳道1:模板DNA含量为180ng的扩增产物；
泳道2:模板DNA含量为160ng的扩增产物；
泳道3:模板DNA含量为120ng的扩增产物；
泳道4:模板DNA含量为IOOng的扩增产物；
泳道5:模板DNA含量为80ng的扩增产物；
泳道6:模板DNA含量为60ng的扩增产物；
泳道7:模板DNA含量为40ng的扩增产物；
泳道8:模板DNA含量为20ng的扩增产物；
泳道9:模板DNA含量为IOng的扩增产物。
具体实施例方式实施例1:
1、材料准备:普通肉汤、革兰氏染色试剂(南京建成生物工程研究所产品，货号D008)、革兰氏阳性细菌总DNA提取试剂(OMEGA公司产品，货号D3350-01)。普通肉汤的配制方法:按营养肉汤(广东环凯微生物科技有限公司产品，商品号022010)的使用方法配制，最终pH7.2-7.4，试管分装，每支约2 mL，12rC高压灭菌15 min。2、细菌分离:
用钼耳圈将待检样品无菌接种于绵羊脱纤血平板上，划线进行细菌分离，置37°C温箱中培养18-20h，将肉眼观察菌落为灰白色或毛玻璃色、湿润、隆起、边缘整齐的小的单个菌落挑取到营养肉汤管中，37°C温箱中培养18-20 h。3、染色镜检:
将待鉴定的细菌菌液涂片，革兰氏染色，在显微镜下观察，如果出现革兰氏阳性(G+)，正圆或椭圆，成丛或成对、短链或长链排列的，可初步定为G+球菌属。4、接触酶试验:
取3% H2O2 1-2滴置于干净玻片上，然后加一钼耳圈被检细菌菌落或肉汤培养的沉淀菌体，与H2O2滴液搅开，立即产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。如果接触酶试验(H2O2)阴性，则初步定为链球菌属。5、CAMP 试验:
用钼耳圈蘸取β溶血性金黄色葡萄球菌，在血琼脂平皿上划一条竖线，再将待检菌株沿金黄色色葡萄球菌线旁划一横线(于金葡萄线垂直)，但不要与金葡萄线相连，37°C培养20-24 h判定。如图1所示，在·金葡菌线于被检菌线形成的直角处，呈现半圆形或三角形的β溶血区，很像一个箭头，即为CAMP阳性，不溶血者为CAMP阴性。6、无乳链球菌的PCR鉴定:
1)将所要检测的细菌在肉汤中复壮，取对数生长期菌液1.5mL提取细菌总DNA ；
2)反应体系为50.0UL:特异性PCR反应液μ L，细菌DNA模板60-120 ng，补充灭菌超纯水至终体积50.0 111^反应条件:95 1:预变性5.0 min后进入循环，循环参数为940C 1.0 min,45°C 1.5min,72 °C 1.5min，30个循环后，72°C延伸 10.0 min ;反应结束后，取PCR产物10.0 μ L在10.0g/L的琼脂糖凝胶上电泳；在紫外凝胶成像仪上观察电泳结果，若出现1270 bp的条带，则为特异性目的片段阳性，如图2所示，反之则为特异性目的片段阴性。7、结果判定:
如果待检的细菌为革兰氏阳性(G+)球菌、接触酶阴性、CAMP阳性，且PCR方法扩增出特异性目的片段，则可判定该菌为无乳链球菌。8、PCR方法的特异性验证:
用无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓隐秘杆菌提取的DNA进行PCR扩增，结果所有参试的无乳链球菌均能扩增出预期大小的特异性条带，而对照菌株则扩增不出任何条带，如图3所示。9、PCR方法的灵敏性检测:
将提取的DNA测定含量后，稀释不同倍数进行灵敏性试验，结果最低能检测到25ng的无乳链球菌，模板DNA为60-120ng的检测结果最好,如图4所示。10、本发明方法与其它鉴定方法符合率比较:对65株通过基因测序鉴定为无乳链球菌的菌株，采用下面3种方法进行复核，对其灵敏性和耗时进行对比，结果发现本发明方法比常规生化鉴定法的敏感性提高15%以上，无乳链球菌3种鉴定方法的效果对比如表I所示。
权利要求
1.一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括以下试剂绵羊脱纤血平板、3%H202、金黄色葡萄球菌株、特异性PCR反应液、阳性对照DNA。
2.根据权利要求I所述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，其特征在于，所述特异性PCR反应液由Premix Ex 酶、引物P1、引物P2组成； 所述引物序列为Pl 5‘ -CTATTGACATCGACAATGGCAGC-3;； P2 5’ -ATACGTGAACGTGGTCATAGTGG-3';预期扩增片段为 1270 bp。
3.一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤 1)细菌分离将待检样品无菌接种于绵羊脱纤血平板上，划线进行细菌分离； 2)镜检将步骤I)分离的细菌，置37°C温箱中培养18-20h，将肉眼观察菌落为灰白色或毛玻璃色、湿润、隆起、边缘整齐的小的单个菌落挑取到营养肉汤管中，37 °C温箱中培养18-20 h ;将待鉴定的细菌菌液涂片，革兰氏染色，显微镜观察后，以革兰氏阳性、正圆或椭圆、成丛或成对、短链或长链排列的，初步判定为G+球菌属； 3)接触酶试验将步骤2)得到的初步判定为G+球菌属的样品进行接触酶试验，以结果为阴性的，初步判定为链球菌属； 4)CAMP试验将步骤3)中初步判定为链球菌属的样品进行CAMP试验，以CAMP试验结果为阴性判定为非无乳链球菌，以CAMP试验结果为阳性判定可进行下一步鉴定； 5)PCR检测将步骤4)中，CAMP试验结果为阳性的菌株的肉汤培养物提取细菌DNA，加入特异性PCR反应液中进行特异性PCR扩增；PCR反应体系为特异性PCR反应液27 μ L，待检细菌DNA模板60-120ng，补充灭菌超纯水至终体积50 μ L ;阳性对照的反应体系为特异性PCR反应液27 μ L，阳性对照DNA 5 μ L，补充灭菌超纯水至终体积50 μ L ;所述PCR的反应条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数94°C lmin，45°C I. 5min，72°C I. 5min，30个循环后，72°C延伸IOmin ;反应结束后，取PCR产物10 μ L在10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以待检细菌样品为革兰氏阳性球菌、接触酶阴性、CAMP阳性和PCR扩增出特异性1270bp的目的片段进行判定为无乳链球菌。
全文摘要
本发明公开了一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，所述试剂盒中包括以下试剂绵羊脱纤血平板、3%H2O2、金黄色葡萄球菌株、特异性PCR反应液、阳性对照DNA。本发明的有益效果为本发明提供的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，将细菌形态学观察、接触酶试验、CAMP反应和PCR检测联合使用，能够简化鉴定程序，特异性强，敏感性提高15%以上，且鉴定成本低、耗时短(只需3天)，既可以分离获得无乳链球菌菌株，又可以准确鉴定，可用于人或奶牛的乳样、宫颈粘液、阴道拭子等样品的分离鉴定。
文档编号C12N1/20GK103255090SQ201310161818
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者王旭荣, 李宏胜, 张世栋, 杨峰, 罗金印, 李新圃, 陈炅然 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所