专利名称：用于检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
百合无症病毒属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，暂时无科。主要分布在瑞典、英国、德国、丹麦、荷兰、比利时、意大利、拉脱维亚、美国、加拿大、日本等国家。限于百合科，多为系统侵染。LSV —般不会造成明显症状，但会造成百合采后下部叶片提前黄化，影响瓶插寿命，与黄瓜花叶病毒(CMV)复合侵染时，可造成脉明、花叶、畸形、坏死斑等症状。自然条件下由蚜虫非持久性传播，介体蚜虫有棉蚜、桃蚜，百合汁液和种子不传。病毒粒子弯曲状，大小为640X17-18nm，外壳分子量为32KD，由292个氨基酸组成，核酸约占粒体重的8.3 %，由单一 RNA组成。病毒颗粒沉降系数为172S, A260/280=l.20-1.43，致死温度为 65_70°C，稀释限点为 10'LSV为RNA病毒，其基因组全长8393bp，共有6个开放阅读框(0RF)，只编码5个蛋白，从5’端到3，端分别为25KD、12KD、7KD、32KD和16KD，其中最长的ORF为876bp，编码32KD病毒外壳蛋白。现有用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物其特异性相对不够强，灵敏性相对较差，这往往会造成检测结果准确性不高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及方法，利用该引物及检测方法检测百合无症病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。为了达到上述目的，本发明采用以下方案:一种用于检测百合无症病毒的引物，其特征在于:引物序列: LSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’，LSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ 。一种检测百合无症病毒的试 剂盒，其特征在于该试剂盒包括有:A、EnzymeM丄久100 μ I
B、Buffer625 μ 1X2
C、LSVPrimer-150 μ I
D、LSVPrimer-250 μ I
E、PositiveControl50 μ I
F、RNaseFree dH201 000 μ I ；其中所述的LSV Primer-1 序列为 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ；所述的 LSVPrimer-2 序列为 5’ -CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’。如上所述的一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl225mM、dNTPslOmM ;所述Positive Control为百合无症病毒的核酸；所述RNase Free dH20为除去RNA酶后的去离子水。一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤:A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液；B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物LSVPrimer-1和LSV Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的LSVPrimer-1 序列为 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3，;所述的 LSV Primer-2 序列为5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ ；C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；D、若存在297bp的DNA条带，则证明所检测用品中带有百合无症病毒。本发明中所述297bp的DNA条带序列为:AAGATGAAAGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCA AGATAGCGTCAGACATCGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCGTCAGTAATA TTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCTGCGTTCCTTGACCCTGAGGG CAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCACTGCGATCATGAAGA AGCACGCTGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATGCCCCTATCGTGTGGAACAGCATGCTTGTG。如上所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品RNA提取,具体包括如下步骤:al、选取0.1-0.2g表现可疑症状的百合叶片组织，同时用等量健康组织作为对照；将百合叶片组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中；
a2、在离心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，颠倒混合均匀；a3、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；a4、取上清，加入400 μ L苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混合均匀；a5、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；
a6、取上清，加入400 μ L氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿、异戊醇的体积比为24:1，颠倒混合均匀；a7、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；a8、取上清，加入1000 μ L无水乙醇和40 μ L3M醋酸钠ρΗ5.2，颠倒混合均匀；a9、台式冷冻离心机4°C 12000g离心IOmin ；alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20μ L无RNA酶的水中。如上所述的一种RT-PCR检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述模板RNA溶液反转录成cDNA，具体包括以下步骤:在0.5mL离心管中加入去离子水9.5 μ L，加入总RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，浓度为10mmol/L的dNTP sl μ L, 70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm离心30s ；再加入 5XcDNA 第一链合成缓冲液 4yL，0.lmol/L DTTl μ L ;RNase 抑制剂 I μ L(30U)；M-MLV 反转录酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。如上所述的一种RT-PCR检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤:在0.2mL离心管中加入10 X PCR扩增缓冲液2.5 μ L，浓度为25mmol/L的MgCl22 μ L,浓度为 10mmol /I,的 dNTPsl μ L, Primer-1l μ M (50pmol), Primer-21 μ M(50pmol), cDNA第一链合成反应液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU)；PCR 循环条件:94°C变性 3min ;然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，循环 35 次;最后 72°C延伸IOmin ;4°C保存反应产物。如上所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤:Cl、用I XTAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60 0C ； C2、加入SYBR GREEN I核酸染料或浓度为I μ g/mL的溴化乙锭，混合均匀，倒入
凝胶平台上，插上样品梳；c3、待凝胶凝固后,拔出梳子,加入适量的TAE缓冲；c4、取I μ L加样缓冲液与5 μ L PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm ;c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。本发明检测方法中所采用到的试剂:IPCR检测试剂2RNA抽提缓冲液:20mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0lmmol/L EDTA, pH8.0
1%SDS, 0.2% β -巯基乙醇3ΤΕ缓冲液
IOmmoI/L Tris-HCl, ρΗ8.0lmmol/L EDTA, pH8.04TAE 缓冲液40mmol/L Tris-HAc,lmmol/L EDTA, pH8.056 X加样缓冲液溴酚蓝0.25%6引物合成根据LSV保守序列设计特异性引物:BSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’BSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’本发明检测方法中使用的仪器和用具包括:1、PCR 扩增仪
2、电泳仪3、台式高速冷冻离心机4、凝胶成像系统5、电子分析天平6、移液器(0.1-2 μ L, 2-10 μ L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)7、研钵8、0.2mL、0.5mL、1.5mL 离心管综上所述，本发明的有益效果:本试剂盒专门用于检测香蕉线条病毒BSV。阳性对照是含有发病香蕉叶片中克隆出来的BSV基因的载体；使用本试剂盒，只要加入待检样品的核酸和本试剂盒中的BSV的一对引物，便可以进行PCR反应，大大地简化了操作过程，减少了 PCR操作过程中的污染，同时使检测效率大幅度提高，检测灵敏度也非常高，可以达到0.1pg ;另外使用本制品扩增得到的PCR产物:V端还附有一个“A”碱基，可直接克隆于T-Vector中。
图1为本发明中用RT-PCR方法检测百合无症病毒的凝胶电泳图。其中，1:分子量标准；2:阳性对照；3-7:样品检测；8:阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步描述:实施例1本发明试剂盒:1、用途:PCR法检测百合植株中的LSV。
2、包装量:50 μ I的RT-PCR反应体系50次量。3、制品说明本试剂盒采用一步(One St印)RT-PCR法，对百合植株中的LSV进行检测。本试剂盒包含酶混合试剂、缓冲液、LSV检测引物和阳性对照。实验操作简单方便，防止交叉污染。本试剂盒具有以下特点:3.1进行高效的RT-PCR扩增，检测灵敏度为0.lpg。3.2使用本试剂盒扩增得到的目的产物3，端附一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector 中。4、制品内容(50次量)
权利要求
1.一种用于检测百合无症病毒的引物，其特征在于: 引物序列:LSV Primer-1:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ，LSV Primer-2:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ 。
2.一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有: A、EnzymeMix100 μ I B、Buffer625 μ 1X2 L LSV Primer-150P I D' LSV Primer-250P IE、PositiveControl50 μ IF、RNaseFree dH201 000 μ I ； 其中所述的 LSV Primer-1 序列为 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3，;所述的 LSVPrimer-2 序列为 5’ -CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’。
3.根据权利要求2所述的一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于所述的EnzymeMix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl225mM、dNTPslOmM ;所述Positive Control为百合无症病毒的核酸；所述RNase Free dH20为除去RNA酶后的去离子水。
4.一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤: A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液； B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物LSVPrimer-1和LSV Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的LSV Primer-1序列为 5’ -AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’ ；所述的 LSV Primer-2 序列为5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’ ； C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析； D、若存在297bp的DNA条带，则证明所检测用品中带有百合无症病毒。
5.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品RNA提取，具体包括如下步骤: al、选取0.1-0.2g表现可疑症状的百合叶片组织，同时用等量健康组织作为对照；将百合叶片组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中； a2、在离心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，颠倒混合均匀； a3、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a4、取上清，加入400 μ L苯 酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混合均匀； a5、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a6、取上清，加入400 μ L氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿、异戊醇的体积比为24:1，颠倒混合均匀； a7、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a8、取上清，加入1000 μ L无水乙醇和40 μ L3M醋酸钠ρΗ5.2，颠倒混合均匀； a9、台式冷冻离心机4°C 12000g离心IOmin ； alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20 μ L无RNA酶的水中。
6.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述模板RNA溶液反转录成cDNA,具体包括以下步骤: 在0.5mL离心管中加入去离子水9.5 μ L，加入总RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，浓度为IOmmoI/L的dNTPsl μ L，70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm离心30s ;再加入 5 X cDNA 第一链合成缓冲液 4 μ L，0.lmol/L DTTl μ L ；RNase 抑制剂 I μ L (30U) ；M-MLV反转录酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。
7.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤: 在0.2mL离心管中加入10 X PCR扩增缓冲液2.5 μ L，浓度为25mmol/L的MgCl22 μ L，浓度为 10mmol/L 的 dNTPsl μ L, Primer-1l μ M (50pmol), Primer-21 μ M (50pmol), cDNA 第一链合成反应液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU) ;PCR循环条件:94°C变性 3min ;然后 94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，循环 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存反应产物。
8.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤: c 1、用I X TAE缓冲液和琼脂糖按1.5 %的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60 0C ； C2、加入SYm作I核酸染料或浓度为I μ g/mL的溴化乙锭，混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳； c3、待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲； C4、取I μ L加样缓冲液与5 μ L PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中； c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm ； c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。
全文摘要
本发明公开了用于检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法，本发明所述引物的序列为LSV Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，LSV Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。本发明所述的试剂盒及检测方法中包含上述引物LSV Primer-1和LSV Primer-2。利用该引物及检测方法检测百合无症病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。
文档编号C12N15/11GK103243175SQ20131016281
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者陈定虎, 陈祖华, 王宏 申请人:陈定虎