专利名称：一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种植物转基因方法，特别涉及一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法。
背景技术：
农杆菌介导的水稻遗传转化研究最早始于1986年，Babat等通过PEG法将农杆菌原生质球与水稻原生质体融合，获得了部分能够合成胭脂碱的水稻愈伤组织。1992年Chan以成熟胚、离体根为起始材料进行研究，但未能获得转基因再生植株。1993 1994年，农杆菌介导的水稻遗传转化研究取得了重大突破，Chan等首次通过农杆菌介导获得了转基因植株，随后，Hiei等实现了对粳稻的高频转化，转化率达到28.6%，表明粳稻的农杆菌介导转化体系已基本建立起来，该研究同时也证明水稻盾片是良好的外植体来源，且农杆菌携带的双元载体能够明显提高粳稻比如越光稻的转化频率。此后的十几年，农杆菌介导水稻遗传转化研究得到了迅速发展。Rashid等将农杆菌介导转化法应用于优质籼稻Basmati370水稻取得成功，且发现乙酰酊香酮在共培养阶段是必不可少的。Dong等报道农杆菌转化在爪睡稻Gulfmont和Jefferson上取得成功；Hoque等于2005年建立了适合于孟加拉籼稻种质的农杆菌介导转化体系，并证明水稻幼胚作为外植体较成熟胚有更高的转化率，共培养时间为3d最优；Hiei和Komari2006年建立了一套适合籼稻I群体的高效转化体系，证实转化效率与凝胶剂的种类和共培养基成分密切相关。林拥军等建立了农杆菌介导的粳稻品种牡丹江8号的高效转基因体系。王逸群等采用农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因导入到谷杆两用水稻中，GUS组织化学染色、PCR扩增、Southern杂交等分析都表明，该基因已经整合到水稻基因组中；他们对9株转基因水稻叶片赖氨酸含量进行测量，发现大部分植株的赖氨酸含量都有明显的提高，最高幅度达到了 22.71%。胡昌泉和苏军等采用农杆菌介导法将胚乳特异性表达谷蛋白I (GlutelinLGtl)基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因SSS导 入籼稻恢复系明恢86，共获得53个独立转化再生植株，PCR检测表明，sss基因已整合进水稻的基因组中。直链淀粉含量测定结果表明，转基因植株后代直链淀粉含量较对照有较大幅度的下降；胡利华，吴慧敏等利用根癌农杆菌介导法将柠檬酸合成酶(citrate synthase)基因CS导入杂交籼稻优良恢复系明恢86，共获得48株Ttl再生植株，通过分子检测，证明有阳性植株产生。总的来说，农杆菌介导水稻遗传转化在近十年里取得了显著进展，不仅为水稻品种的遗传改良奠定了基础，而且为水稻的分子生物学提供强有力的实验证据。上述农杆菌介导的水稻转基因方法，除了 PEG融合法外，都是用农杆菌浸染水稻愈伤来获得转基因植株，但是在诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异较大，转化周期较长，且水稻各个品系(品种)间转基因条件也存在较大的差距，随着转基因技术的不断发展，越来越多的外源基因待转移到水稻(植物模式植物)中，而农杆菌介导的浸染水稻愈伤的方法存在一些不足，因此，寻找能摆脱组织培养的限制，在自然环境下大规模进行水稻转基因的方法十分重要。
发明内容
针对上述现有的技术，本发明提供了一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法，目的在于提供一种在自然环境下的水稻转基因方法，能快速获得转基因植株，进行植物的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作简单，成本低廉，可以在短时间内获得转基因植株。一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法，包括以下步骤:
(1)试验材料的栽培:水稻种子用多菌灵浸泡后，置于适宜的容器中，放入恒温培养箱30°C催芽，当水稻芽生长至0.S^lcm时，开始用作试验受体；
(2)农杆菌工程菌转化液的配制:将含有目的基因的农杆菌接种到含有筛选压的液体培养基进行扩大培养，当菌液0D_值达到0.6^1.0时，离心分离菌体，用含有筛选压的AAM液体培养基重悬浮，加入乙酰丁香酮和吐温20，使菌液0D_值为2.(Γ2.5，农杆菌转化液配制完成，待用；
(3)试验受体的预处理:在水稻芽生长至0.flcm时，用刀片在离胚约Imm处切断幼苗，用Iml —次性注射器刺伤水稻幼苗的生长点；
(4)农杆菌浸染:把(3)预处理好的材料，马上放入到农杆菌转化液中，25 28°C下用农杆菌转化液浸泡1(Γ12小时，浸染结束后，把材料移入到泥中，30 33°C光照培养，当苗有5cm以上时，移入到到大盆中生长，在生长过程中及时除去分蘖，只留主茎；
(5)对转基因植株进行转基因鉴定:待水稻苗有4飞叶片时，对其进行⑶S组织染色筛选；待水稻苗有6 8叶片时，对其进行Hyg抗性筛选；当水稻剑叶成长至IOcm以上时，对其进行PCR检测。所述步骤(2)中的农杆菌转化液中的乙酰丁香酮的浓度为400mmol/L，吐温20的体积百分浓度为0.01%。`更具体地，本发明的一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法，包括以下步骤:
(1)试验材料的栽培:用50%多菌灵可湿性粉剂与水按为Ig:200ml的比例配成药液，室温下浸泡材料水稻种子24小时，中间翻动数次，浸泡后把水稻种子放入适于的容器中，恒温培养箱30°C催芽约一周，当水稻芽生长至0.flcm时(过长或过短都不利于找到生长点)，开始用作试验受体；
(2)农杆菌工程菌转化液的配制:将含有目的基因的农杆菌接种到含有筛选压的液体培养基进行扩大培养，当菌液0D_值达到0.6^1.0时，离心分离菌体，用含有筛选压的AAM液体培养基重悬浮，加入终浓度为400mmol/L乙酰丁香酮(AS)和体积百分浓度为0.01%吐温20，使菌液0D_值为2.(Γ2.5，农杆菌转化液配制完成，待用；
(3)试验材料的预处理:在水稻幼苗生长至0.8 lcm时,用锋利刀片在离胚约Imm处切断幼苗，露出生长点，用Iml —次性注射器适度刺伤的水稻幼苗的生长点；
(4)农杆菌浸染:把(3)预处理好的材料，马上放入到农杆菌转化液(配制到使用不要超过2h)里面，25 28°C用农杆菌转化液浸泡1(Γ12小时(时间不能过长，农杆菌转化液一定要没过材料)，其间适当的摇晃，浸染结束后，直接把材料移入到泥中；
(5)GUS组织染色筛选:待水稻苗有4飞叶片时，剪取0.5cm长的最顶端的嫩叶，浸入⑶S染色液(含有体积分数为20%的甲醇以抑制植物体内的⑶S活性)中染色，37°C保温过夜，先用清水清洗数次，再用体积浓度为75%的乙醇脱色漂洗2次以消除叶绿素的干扰，观察组织染色情况，叶片有染蓝色为⑶S检测呈阳性的转基因苗，反之为阴性苗；
(6)Hyg抗性筛选:待水稻苗有6、叶片时，剪取0.5cm长的最顶端的嫩叶放入2mL的无菌离心管中，加入ImL的Hyg工作液(太多的工作液会使叶片淹没)，放入光照恒温培养箱中，条件为:每天光照16h，黑暗8h，26°C恒温培养，3天后观察叶片情况，叶片有褐化及枯萎等异样判定为Hyg检测呈阳性的转基因苗，反之为阴性苗；
(7)转基因植株PCR检测:当水稻剑叶足够长时，取2cm叶用常规SDS法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，对其进行PCR检测，结果呈阳性的为转基因植株，反之为阴性苗。本发明具有如下有益效果:
I.整个转化过程无需在无菌环境下进行，在自然环境下就可完成。2.转化过程不需进行组织培养且不依赖于植物基因型，可有效的缩短实验时间。
3.实验操作简单，技术要领掌握容易，效率较高，成本低廉，适合大规模实验。4.农杆菌介导的转化法可以准确完整的把外源基因转入到受体细胞中，且能插入到受体基因组中，转基因植物遗传较稳定。
图1为浸泡发芽的水稻种子； 图2为待预处理的水稻种子；
图3为刀片切的位置；
图4为预处理过的水稻幼苗；
图5为浸染过的水稻种子入泥5天后；
图6为移入大盆里的水稻苗；
图7为⑶S组织染色呈阳性的水稻叶片；
图8为⑶S组织染色呈阴性的水稻叶片；
图9为Hyg抗性检测呈阴性的水稻叶片；
图10为Hyg抗性检测呈阳性的水稻叶片；
图11为转基因水稻植株的PCR检测结果，M为Mark，A为阳性对照，B为阴性对照，C为非转基因水稻，D、E、F和G为转基因水稻。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更清楚，下面将结合附图，对本发明的实施例进行详细的描述。本发明实施例以水稻研究对象，本实施例中的水稻品种为明恢86，由福建农林大学基因工程实验室提供，用农杆菌工程菌介导水稻生长点转化法处理水稻幼苗1121株，最终经过GUS组织染色鉴定、潮霉素抗性鉴定和PCR鉴定，获得水稻转基因植株4株。下述实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。—、一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法 1.农杆菌工程菌简介
本发明所使用的是含真核表达载体pTCK303-J0.的农杆菌工程菌，农杆菌为LBA4404菌株，载体为pTCK303，3a-羟类固醇脱氢酶基因(3 a-HSD/CR)编码基因全长774bp，该农杆菌工程菌具有潮霉素(Hyg)抗性、卡那霉素(Kan)抗性和利福平(Rif)抗性。2.水稻幼苗的种植
水稻品种为明恢86，用50%多菌灵可湿性粉剂与水按为Ig:200ml的比例配成药液，室温下浸泡材料水稻种子24小时，中间翻动数次，浸泡后把水稻种子放入培养皿中，培养皿下面放脱脂棉，种子脱脂棉上面，加水适量，光照恒温培养箱30°C培养，当水稻芽生长至0.flcm时(过长或过短都不利于找到生长点，附图1、附图2)，开始用作试验受体。3.农杆菌工程菌转化液的配制
将农杆菌工程菌划线于YEB固体培养基(100 mg/L Rif和100 mg/L Kan)，28°C恒温光照培养箱暗光培养约48 h。挑取农杆菌单菌落接种10 mL YEB液体培养基(100 mg/L Rif和100 mg/L Kan)中，28°C，250 r/min恒温摇床培养约48 h。取I mL菌液于50mL YEB 液体培养基(100 mg/L Rif 和 100 mg/L Kan)中，28°C，250 r/min 恒温摇床培养至OD6tltl值达到0.6^1.0时。10000 rp/m 5 min收集菌体，用AAM液体培养基(100 mg/L Kan、400mmol/L AS和体积百分浓度为0.01%的吐温20，AAM液体培养基配方见表I)重悬浮菌体，农杆菌转化液OD6tltl值为2.(Γ2.5，以上过程都需在无菌条件下进行，农杆菌转化液配制完成，待用。4.水稻幼苗的预处理
在水稻幼苗生长至0.flcm时，用锋利刀片在离胚约Imm处切断幼苗(附图3)，露出生长点，用Iml —次性注射器适度刺伤的水稻幼苗的生长点(附图4)。
5.农杆菌浸染
把4中预处理好的水稻幼苗马上放入盛有农杆菌转化液(配制到使用不要超过2h)的锥形瓶中(农杆菌转化液要没过水稻幼苗)，28°C暗培养12h，期间适度摇晃，使得农杆菌工程菌有足够的活力和时间去侵染植物细胞，浸染结束后，把水稻幼苗移入泥中，32°C光照培养(附图5)，当苗有5cm以上时，移入到到大盆中生长(附图6)，在生长过程中及时除去分蘖，只留主茎。6.⑶S组织染色
待水稻苗有4飞叶片时，剪取0.5cm长的最顶端的嫩叶，浸入GUS染色液(含有体积分数为20%的甲醇以抑制植物体内的GUS活性)中染色，37°C保温过夜，先用清水清洗数次,再用体积浓度为75%的乙醇脱色漂洗2次以消除叶绿素的干扰，观察组织染色情况，叶片有染蓝色为GUS检测呈阳性的转基因苗，反之为阴性苗。7.Hyg抗性筛选
待水稻苗有61叶片时，剪取0.5cm长的最顶端的嫩叶放入2mL的无菌离心管中，加入ImL的45mg/L的Hyg工作液(太多的工作液会使叶片淹没)，放入光照恒温培养箱中，条件为:每天光照16h，黑暗8h，26°C恒温培养，3天后观察叶片情况，叶片有褐化及枯萎等异样判定为Hyg检测呈阳性的转基因苗，反之为阴性苗。8.PCR 检测
根据GenBank上已公布的3 a -HSD/CR全长基因序列(774 bp)，设计一对PCR扩增引
物:
5’ 端引物 HSDl: 5，-CGAATTCATATGTCCATCATCGTGATA-3，划线为 Nde I 酶切位点；3’ 端引物 HSD2: 5’ -CGGGATCCGAACTGTGTCGGGC-3’ 划线为 BamH I 酶切位点。当水稻剑叶足够长时(材料一定要为剑叶，因为这是离穗最近的叶)，取2cm叶用常规SDS法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以HSD1/HSD2为上下游引物进行PCR鉴定，PCR体系为总体积为25 μ L的标准TaqPCR体系，其中含有基因组DNA 2 μ L，PCR反应条件为:94°C 5 min ；94°C 90 s,66°C 45 s,72°C 90s, 30 个循环；72 °C延伸 10 min。取 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。表I AAM液体培养基配方
权利要求
1.一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)试验材料的栽培:水稻种子用多菌灵浸泡后，置于适宜的容器中，放入恒温培养箱30°C催芽，当水稻芽生长至0.S^lcm时，开始用作试验受体； (2)农杆菌工程菌转化液的配制:将含有目的基因的农杆菌接种到含有筛选压的液体培养基进行扩大培养，当菌液0D_值达到0.6^1.0时，离心分离菌体，用含有筛选压的AAM液体培养基重悬浮，加入乙酰丁香酮和吐温20，使菌液OD_值为2.(Γ2.5，农杆菌转化液配制完成，待用； (3)试验受体的预处理:在水稻芽生长至0.flcm时，用刀片在离胚约Imm处切断幼苗，用Iml —次性注射器刺伤水稻幼苗的生长点； (4)农杆菌浸染:把(3)预处理好的材料，马上放入到农杆菌转化液中，25 28°C下用农杆菌转化液浸泡1(Γ12小时，浸染结束后，把材料移入到泥中，30 33°C光照培养，当苗有.5cm以上时，移入到到大盆中生长，在生长过程中及时除去分蘖，只留主茎； (5)对转基因植株进行转基因鉴定:待水稻苗有4飞叶片时，对其进行⑶S组织染色筛选；待水稻苗有6 8叶片时，对其进行Hyg抗性筛选；当水稻剑叶成长至IOcm以上时，对其进行PCR检测。
2.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法，其特征在于:所述步骤(2)中的农杆菌转化液中的 乙酰丁香酮的浓度为400mmol/L，吐温20的体积百分浓度为.0.01%。
全文摘要
本发明涉及一种植物转基因方法，特别涉及一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法。主要步骤包括(1)试验材料的栽培；(2)农杆菌工程菌转化液的配制；(3)试验材料的预处理；(4)农杆菌浸染；(5)转基因植株的检测。本发明目的在于提供一种在自然环境下的水稻转基因方法，能快速获得转基因植株，进行植物的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作简单，成本低廉，可以在短时间内获得转基因植株。本发明中的方法无需无菌操作，可以简单、快速、高效的获得转基因植株，能在自然条件下规模化进行植物转基因工作，对于水稻基因功能的验证及基因工程育种具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/82GK103233039SQ20131016186
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者潘大仁, 符雷, 周以飞, 朱秋强 申请人:福建农林大学