专利名称：一种对虾细胞培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于动物细胞、组织培养技术领域，具体涉及一种新型对虾细胞培养基。
背景技术：
对虾病毒病的频繁爆发一直是困扰对虾养殖业并亟待解决的一个难题，而对虾永生性细胞系是分离和纯化对虾病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。尽管国内外专家学者在对虾细胞的体外培养和建系上进行了大量的探索和不懈的努力，但目前对虾的细胞培养仍然处于原代培养水平，永生性的细胞系一直未成功建立。而找到有效的对虾细胞培养基，是实现对虾细胞成功建系的关键。目前，对虾细胞培养并没有专门商业化的培养基。大部分研究者利用哺乳动物和昆虫的商品化人工培养基为基础培养基，同时添加血清和其它营养因子来开展对虾的细胞培养工作。例如 Leibovitz (L-15)、M199、MEM、TC199、Grace 培养基、TC-100、LHM,CMPLT和RPM1-1640等培养基都曾被用于对虾的细胞培养研究。其中以L-15培养基，尤其是2XL-15培养基的培养效果最好，应用最为广泛。Purushothaman等(1998)在印度对虫下(Penaeus indicus)和斑节对奸(P.monodon)的原代培养中发现,在添加10%小牛血清的条件下，L-15培养基(IX )的培养效果比MEM好。Goswami等(2009)采用L-15培养基(I X )为基础培养基，同时添加20%胎牛血清(FBS)、1%虾血清、0.1%葡萄糖和0.5%NaCl，开展了罗氏沼奸(Macrobrachium rosenbergii)的心脏组织块原代培养,2周后观察到心肌细胞的迁出，并最终获得原代培养细胞单层。Nadala等(1993)采用2XL-15培养基为基础培养基，同时添加20%FBS、8%虾肌肉提取液和20 ng/mL表皮生长因子(EGF)，成功开展了南美蓝对奸(P.stylirostris)和南美白对奸(P.vannamei)的淋巴组织块原代培养,并在I周后获得了原代培养细胞单层。但是同样添加了胎牛血清、虾肌肉提取液和EGF生长因子的其它基础培养基如M199、RPMI1640和Grace昆虫培养基则没有得到满意的培养效果。Ellender等(1992)采用2XL-15培养基(添加20%FBS)成功培养了南美白对虾的血细胞。Hu等(2008)采用2XL-15培养基为基础培养基，同时添加20%FBS、5 g/L NaCl、0.75g/L NaHCO3,1%葡萄糖和20 μ g/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，也成功开展了中国对虫下(P.chinensis)的淋巴组织块原代培养和永生性转化研究。也有研究者通过分析和了解对虾血淋巴的营养组成、pH值和渗透压，然后模拟虾血淋巴来设计对奸细胞培养基。例如，Shimizu等(2001)根据南美蓝对奸血淋巴的营养组成设计了 2个分别以M199和0.2XL-15为基础培养基的对虾细胞培养基，用于对虾卵巢组织的原代培养，并且与2 X L-15培养基(添加20%FBS)的培养效果进行了比较。发现，新设计的2个培养基的培养效果优于2XL-15培养基。最近，Jayesh等(2012)也根据斑节对虾的血淋巴营养组成设计了一个新的对虾细胞培养基，并发现其培养效果优于2XL-15和Grace昆虫细胞培养基。总的来说， 不同研究者所采用的对虾细胞培养基的配方大都是不一样的，其培养效果也基本上没有被其它研究者所重复，而且获得对虾原代培养细胞单层的成功率不高。尽管有人报道所得到的对虾体外培养细胞可在体外存活几个月，但所维持的往往是少量对虾细胞，而不是健康的连续性细胞单层，因而对于对虾细胞建系的帮助不大。因此，有必要提供一种更有效的对虾细胞培养液。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型对虾细胞培养基配方，据此配方配制的培养基可用于对虾细胞的体外培养，并能更好地维持体外培养对虾细胞的存活和生长，从而弥补现有技术的不足。本发明的对虾细胞培养基的保存液，是以1.5XL-15培养基为基础培养基，并添加如下终浓度的组分:体积比为10%的对虾肌肉提取液、5 g/L NaCl,2 g/L葡萄糖、lg/LNaHC03、10 μ g/mL牛磺酸、10 μ g/mL脯氨酸、100 IU/mL青霉素钠和100 μ g/mL硫酸链霉素；pH 为 7.3-7.5。其中对虾肌肉提取液的制备方法如下:将对虾肌肉用2.4% NaCl溶液作为缓冲液匀浆后，于60°C水浴I小时，然后转移到离心管中，低温离心收集上清，滤膜过滤除菌完成制备。
其中对虾肌肉和2.4% NaCl溶液的质量体积百分比为1:3 ；所述的低温离心为4°C,9000 rpm离心1.5小时；本发明的对虾细胞培养基的工作液，是在保存液中还添加有终浓度如下的组分:体积比为15%的胎牛血清(FBS)、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20 ng/mL表皮生长因子(EGF)，培养基渗透压为621 ±20 m0sm/kg，pH值为7.3-7.5。本发明所涉及的新型对虾细胞培养基保存液的配制方法如下:在I升超纯水中溶解20.55 g L-15培养基、5 g NaCl,2 g葡萄糖、I g NaHCO3'0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、100 mL虾肌肉提取液、1.0XlO5 IU青霉素钠和100 mg硫酸链霉素，调节pH值至7.3-7.5 ；在无囷条件下，用0.22 μ m滤I旲将培养基过滤除囷后完成保存液的制备。应用本发明所设计的对奸细胞培养基开展基围奸(Metapenaeus ensis,又称刀额新对虾)的淋巴组织块原代细胞培养，(O能够使对虾原代培养组织块中的细胞快速迁出，在组织块接种后2-3小时内启动细胞的迁出；(2)快速获得对虾原代培养细胞单层，可在组织块接种后16-24小时内形成70%-80%汇合度的细胞单层；(3)能够使原代培养组织块被重复接种和利用；(4)不破坏所培养对虾细胞的病毒敏感性。
图1:本发明所设计的对虾细胞培养基与Shimizu对虾细胞培养基和2XL-15培养基的基围虾淋巴组织块原代细胞培养的培养效果比较；其中:1-1、1_2和1-3分别表示用Shimizu对虾培养基培养对虾淋巴组织原代细胞生长6小时、24小时和36小时的生长状态；2-U2-2和2-3分别表示用2XL-15培养基培养对虾淋巴组织块原代细胞生长6小时、24小时和36小时的生长状态；3-1、3_2和3-3分别表示用本发明所设计的对虾细胞培养基培养对虾淋巴组织块原代细胞生长6小时、24小时和36小时的生长状态；图2:本发明所设计的对虾细胞培养基培养基围虾的淋巴组织原代细胞可存活超过25天的细胞图；图3:基围虾淋巴组织块的重复利用；对虾淋巴组织块原代培养3天后重新悬浮，并接种到新的培养板上后贴壁生长24小时(A)和4天(B)时的细胞生长图；图4:基围虾淋巴组织原代培养细胞接种200yL白斑病毒(WSSV)(滴度为
4X IO6/μ L)后细胞病变效应的光镜照片，其中C0、C1、C2和C3分别为对虾淋巴组织原代细胞单层接种PBS (对照)后O天、I天、2天和5天时的细胞生长光镜照片；V0、V1、V2和V3分别为对虾淋巴组织原代细胞单层接种病毒滴度为4X IO6的WSSV病毒液后O天、I天、2天和5天时的显微图。
具体实施例方式本发明的对虾细胞培养基在组分的选择、浓度的配比上进行了长期的研究，使各组分之间充分发挥互配效果，从而得出了本发明。本发明使用到了对虾肌肉提取液，其具体制备方法如下:取活对虾，酒精棉球消毒体表后，无菌条件下，去除头、尾和肠以及甲壳，取肌肉放入500 mL体积大烧杯中，称重，然后按照Ig组织:3 mL缓冲液的比例加入2.4% NaCl溶液，并用电动匀浆器将肌肉打成浆状。于60°C水浴I小时，期间晃动瓶子混匀数次。然后转移到50 mL离心管中，4°C，9000rpm离心1.5小时。收集上清，先后用0.45 μπι滤膜和0.22 μπι滤膜过滤除菌，_20°C储存备用。 制备20 Pg/mL bFGF母液。具体制备方法如下:取1.5 mL灭菌离心管，称取20Pg bFGF粉末，然后加入I mL PBS缓冲液(配方:每升超纯水中溶解3.0 g Na2HPO4.Iffi2O,0.2 g KH2PO4, 8.0 g NaCl 和 0.2 g KCl，pH 7.2)，颠倒混匀溶解后，用 0.22 μπι 针式滤器过滤除菌，_20°C储存备用。使用时，每100 mL对虾培养基保存液添加100 PL该bFGF母液(20 Pg/mL)。制备20 Pg/mL EGF母液。具体制备方法如下:取1.5 mL灭菌离心管，称取20 μδEGF粉末，然后加入I mL PBS缓冲液(配方同上)，颠倒混匀溶解后，用0.22 μ m针式滤器过滤除菌，_20°C储存备用。使用时，每100 mL对虾培养基保存液添加100 μ 该EGF母液(20 Pg/mL)。配制本发明所涉及的新型对虾细胞培养基保存液。具体配制方法如下:在I升超纯水中溶解20.55 g L-15培养基、5 g NaCl,2 g葡萄糖、I g NaHC03、0.01 g牛磺酸、0.01g脯氨酸、100 mL虾肌肉提取液、1.0XlO5 IU青霉素钠和100 mg硫酸链霉素，调节pH值至7.3-7.5。在无菌条件下，用0.22 μπι滤膜将培养基过滤除菌后，分装于100 mL血清瓶，85 mL/瓶，4°C保存或_20°C冻存。本发明对虾细胞培养基工作液的一种配制方法如下:取85 mL对虾细胞培养基保存液，在超净工作台内，加入15 mL FBSUOO μ 20 Pg/mL bFGF母液和100 μ 20 Pg/mLEGF母液，混匀，4°C保存备用。应用本发明所设计的对奸细胞培养基开展了基围奸(Metapenaeus ensis)的淋巴组织块原代细胞培养，分析其培养效果，并与Shimizu对虾培养基和2 X L-15培养基的培养效果进行了比较。结果表明，本发明的对虾细胞培养基的培养具有很好的效果(图1 )，细胞从组织块中迁出的时间最早(可在组织块接种后2-3小时开始迁出)；细胞生长最快，细胞单层达到70%-80%汇合度所需时间最短(约为组织块接种后16-24小时)；细胞贴壁紧，状态好，生长寿命长达28±3天(图2)。而Shimizu对虾培养基和2XL-15培养基则分别需要72-96小时和48-60小时才能形成70%-80%汇合度的细胞单层，细胞寿命也短得多，分别为10±4天和15±3天。Shimizu对奸培养基的来源和配方:Shimizu等(2001)根据南美蓝对奸血淋巴的营养组成所设计的对虾细胞培养基，配制方法如下:在I升超纯水中溶解2.74 g L-15培养基、16 g NaCl、l g葡萄糖、0.45 g KC1、0.014 g ZnCl2、0.85 g MgCl2U.22 g CaCl2,30 mLPBS,0.04 g 赖氨酸、0.1 g 谷氨酰胺、0.08 g 牛磺酸、0.08 g 脯氨酸、150 mL FBSU.0X105IU青霉素钠和100 mg硫酸链霉素，20 μδ bFGF和20 μδ EGF, pH值7.3_7.5，渗透压为697 ±20 mOsm/kg。2 X L-15培养基的配方:在I升超纯水中溶解27.4 g L-15培养基、5 g NaClU g葡萄糖、I g NaHC03 、100 mL 虾肌肉提取液、150 mL FBS,20 μδ bFGF,20 μδ EGF、1.0X IO5IU青霉素钠和100 mg硫酸链霉素，pH值7.3-7.5，渗透压为747 ±20 mOsm/kg。使用结果还表明，本发明的对虾培养基可支持对虾淋巴组织块重复贴壁后细胞的生长和存活，提高了对虾淋巴组织块的利用率，从而可以更快地获得较多的对虾原代培养细胞(图3)。另外，本发明的对虾培养基中生长的对虾原代培养淋巴细胞仍保留对对虾白斑病毒(WSSV)的敏感性。结果发现，本发明所设计的对虾培养基培养的对虾原代培养淋巴细胞对WSSV具有敏感性，病毒接种后第4天可看到明显的细胞病变效应，因而所培养的对虾细胞可用于该病毒的相关研究(图4)。
权利要求
1.一种对虾细胞培养基的保存液，所述的保存液是以1.5XL-15培养基为基础培养基，并添加如下终浓度的组分:体积比为10%的对虾肌肉提取液、5 g/L NaCl,2 g/L葡萄糖、lg/L NaHCO3UO μ g/mL 牛磺酸、10 μ g/mL 脯氨酸、100 IU/mL 青霉素钠和 100 yg/mL 硫酸链霉素；pH为7.3-7.5。
2.如权利要求1所述的保存液，其特征在于所述的对虾肌肉提取液，是将对虾肌肉用2.4% NaCl溶液作为缓冲液匀衆后,于60°C水浴I小时，然后转移到离心管中，低温离心收集上清，滤膜过滤除菌完成制备。
3.如权利要求2所述的保存液，其特征在于所述的对虾肌肉和2.4% NaCl溶液的质量体积百分比为1:3。
4.如权利要求2所述的保存液，其特征在于所述的低温离心为4°C，9000rpm离心1.5小时。
5.一种对虾细胞培养基的工作液，其特征在于，所述的工作液是在权利要求1所述的保存液中添加有终浓度为15%的胎牛血清、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20 ng/mL表皮生长因子。
6.权利要求1所述的保存液的配制方法如下:在I升超纯水中溶解20.55 g L-15培养基、5 g NaCl>2 g葡萄糖、I g NaHCO3、0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、100 mL奸肌肉提取液、1.0 X IO5 IU青霉素钠和100 mg硫酸链霉素，调节pH值至7.3-7.5 ;在无菌条件下，用0.22 μπι 滤膜将培养基过滤除菌后完成保存液的制备。
全文摘要
本发明涉及一种新型对虾细胞培养基配方，据此配方配制的培养基可用于对虾细胞的体外培养。本发明所设计的对虾细胞培养基可以很好地维持对虾细胞在体外的存活和生长，细胞贴壁紧，外形舒展；用于对虾淋巴器官的组织块原代培养时，可启动淋巴细胞在3小时内从组织块中向外迁移，并在1-2天内形成连续性细胞单层；该培养基不破坏所培养对虾细胞的病毒敏感性。
文档编号C12N5/07GK103232969SQ20131016235
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者郭华荣, 韩倩 申请人:中国海洋大学