专利名称：用于检测椰子败生类病毒的引物、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
椰子败生类病毒Coconut tinangaja viroid(CtiVd)属于马铃薯纺锤形块莖类病毒科(Pospiviroidae)，椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)，是椰子致死性病害,主要发生在关岛，目前我国还没有发现该类病毒，已被列为我国进境的检疫性病原物。椰子是我国重要的经济作物，因此加强对该类病毒的检疫和鉴定技术研究，对严防该类病毒传入我国具有非常重要的意义。椰子败生类病毒主要侵染椰子树，造成椰子植株生长受阻，提前凋亡。椰子败生类病毒的传播途径:自然条件下随种苗传播。椰子败生类病毒的类病毒特性:环状RNA，由254个核苷酸组成。现有用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物其特异性相对不够强，灵敏性相对较差，这往往会 造成检测结果准确性不高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测椰子败生类病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。为了达到上述目的，本发明采用以下方案:一种用于检测椰子败生类病毒的引物，其特征在于:引物序列CTIVD Primer-1:5' -actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3',CTIVD Primer-2:5’-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3’ 。一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有:A> Enzyme Mix100 μ IΒ> Buffer625 μ I X 2C、CTIVD Primer-150 μ ID、CTIVD Primer-250 μ IΕ、Positive Control50 μ IF、RNase Free dH201000 μ I ；其中所述的CTIVD Primer-1序列为:5' -actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'；所述的CTIVD Primer-2 序列为:5，-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3，。如上所述的一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl2 25mM、dNTPs IOmM ;所述的PositiveControl为挪子败生类病毒的核酸；所述的RNase Free dH20为除去RNA酶后的去离子水。一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤:A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液；B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物CTIVD Primer-1和CTIVD Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的CTIVD Primer-1序列为5' -actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3’ ；所述的 CTIVD Primer-2 序列为 5，-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'；C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；D、若存在138bp的DNA条带，则证明所检测用品中待有椰子败生类病毒。本发明中所述138bp的序列为:Gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtcccttccgagcttcgatccgacgccc ggccgcttcctcgccgaagctgctacggagactacccggtggatacaactctttgcagc gccctgtgtaataaaagctcgagt。如上于步骤A中所述待测样品组织总RNA提取，具体包括如下步骤:al、选取0.1-0.2g表现可疑症状的待测样品组织，同时用等量健康组织作为对照；将待测样品组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中；a2、在离心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，颠倒混合均匀；a3、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；a4、取上清，加入400 μ L苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混合均匀；a5、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；a6、取上清，加入400 μ L氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿、异戊醇的体积比为24:1，颠倒混合均匀；a7、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ；a8、取上清，加入1000 μ L无水乙醇和40 μ L3M醋酸钠ρΗ5.2，颠倒混合均匀；a9、台式冷冻离心机4°C 12000g离心IOmin ；alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20μ L无RNA酶的水中。如上所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述模板总RNA溶液反转录成cDNA,具体包括以下步骤:在0.5mL离心管中加入去离子水9.5 μ L，加入总RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，浓度为10mmol/L的dNTPsl μ L, 70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm离心30s ；再加入 5XcDNA 第一链合成缓冲液 4yL，0.lmol/L DTTl μ L ;RNase 抑制剂 I μ L(30U)；M-MLV 反转录酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。如上所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤:
在0.2mL离心管中加入10 X PCR扩增缓冲液2.5 μ L，浓度为25mmol/L的MgCl22 μ L,浓度为 10mmol/L 的 dNTPslμ L, Primer-1l μ M (50pmol), Primer-21 μ M(50pmol), cDNA第一链合成反应液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU)；PCR 循环条件:94°C变性 3min ;然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，循环 35 次;最后 72°C延伸IOmin ;4°C保存反应产物。如上所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤:Cl、用I XTAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60 0C ；c2、加入SYBR GREEN I核酸染料或浓度为I μ g/mL的溴化乙锭，混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；c3、待凝胶凝固后,拔出梳子,加入适量的TAE缓冲；c4、取I μ L加样缓冲液与5 μ L PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中； c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm ;c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。本发明检测方法中所采用到的试剂:1、PCR检测试剂2、RNA抽提缓冲液:20mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0lmmol/L EDTA, ρΗ8.01%SDS, 0.2% β -巯基乙醇3、TE 缓冲液10mmol /T, Tris-HCl, pH8.0lmmol/L EDTA, pH8.04、TAE 缓冲液40mmol/L Tris-HAc,lmmol/L EDTA, pH8.05、6X加样缓冲液溴酚蓝0.25%6、引物合成根据CTIVD保守序列设计特异性引物:CTIVD Primer-1:5'-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'；
CTIVD Primer-2:5，-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3，。本发明检测方法中使用的仪器和用具包括:1、PCR 扩增仪2、电泳仪
3、台式高速冷冻离心机4、凝胶成像系统5、电子分析天平6、移液器(0.1-2 μ L, 2-10 μ L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)7、研钵8、0.2mL、0.5mL、1.5mL 离心管综上所述，本发明的有益效果:本发明试剂盒专门用于检测椰子无症病毒(CtiVD)的椰子株系。使用本试剂盒及检测方法，反转录和PCR扩 增一步完成，不需要分解成二步，因此可以大大降低交叉污染的机率，又使检测效率大幅度提闻，同时检测灵敏度也非常闻，可以达到0.1pg0
图1为本发明中RT-PCR方法检测椰子败生类病毒的凝胶电泳图。其中:1:分子量标准；2:阳性对照；3_7:样品检测；8:阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步描述:实施例1本发明试剂盒:1、用途:PCR法检测椰子植株中的椰子败生类病毒Coconut tinangajaviroid (CtiVd)。2、包装量:50 μ I的RT-PCR反应体系50次量。3、制品说明本试剂盒采用一步(One St印)RT-PCR法，对椰子植株中的CtiVd进行检测。本试剂盒包含酶混合试剂、缓冲液、CtiVd检测引物和阳性对照。实验操作简单方便，防止交叉污染。本试剂盒具有以下特点:3.1进行高效的RT-PCR扩增，检测灵敏度为0.1pgo3.2使用本试剂盒扩增得到的目的产物3，端附一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector 中。4、制品内容(50次量)
权利要求
1.一种用于检测椰子败生类病毒的引物，其特征在于: 引物序列CTIVD Primer-1:5' -actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3',CTIVD Primer-2:5' -gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'。
2.一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有: A、EnzymeMix100 μ I B、Buffer625 μ I X 2 C、CTIVDPrimer-150 μ I D、CTIVDPrimer-250 μ I E> Positive Control 50 μ I F、RNase Free dH201000 μ I ； 其中所述的CTIVD Primer-1序列为: 5' -actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'； 所述的CTIVD Primer-2序列为:5' -gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'。
3.根据权利要求2所述的一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl2 25mM> dNTPs IOmM ;所述的Positive Control为椰子败生类病毒的核酸；所述的RNase Free dH20为除去RNA酶后的去离子水。
4.一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤: A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液； B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物CTIVDPrimer-1和CTIVDPrimer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液； 其中所述的CTIVD Primer-1序列 为:5’-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3’ ；所述的 CTIVD Primer-2 序列为 5’-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'； C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析； D、若存在138bp的DNA条带，则证明所检测用品中待有椰子败生类病毒。
5.根据权利要求4所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品组织总RNA提取，具体包括如下步骤: al、选取0.1-0.2g表现可疑症状的待测样品组织，同时用等量健康组织作为对照；将待测样品组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中； a2、在离心管中加入冰冷的400 μ L RNA抽提液，颠倒混合均匀； a3、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a4、取上清，加入400 μ L苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混合均匀； a5、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a6、取上清，加入400 μ L氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿、异戊醇的体积比为24:1，颠倒混合均匀；a7、台式冷冻离心机4°C, 12000g离心IOmin ； a8、取上清，加入1000 μ L无水乙醇和40 μ L3M醋酸钠ρΗ5.2，颠倒混合均匀； a9、台式冷冻离心机4°C 12000g离心IOmin ； alO、留沉淀，用500 μ L70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20 μ L无RNA酶的水中。
6.根据权利要求4所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述模板总RNA溶液反转录成cDNA，具体包括以下步骤: 在0.5mL离心管中加入去离子水9.5 μ L，加入总RNA2 μ L，Primer-2引物I μ L，浓度为IOmmoI/L的dNTPsl μ L，70°C水浴5min后立即置于冰上2min ;然后3000rpm离心30s ;再加入 5 X cDNA 第一链合成缓冲液 4 μ L，0.lmol/L DTTl μ L ；RNase 抑制剂 I μ L (30U) ；M-MLV反转录酶 I μ L(20U) ；37°C 60min。
7.根据权利要求4所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤: 在0.2mL离心管中加入10 X PCR扩增缓冲液2.5 μ L，浓度为25mmol/L的MgCl22 μ L，浓度为 10mmol/L 的 dNTPsl μ L, Primer-1l μ M (50p mol), Primer-21 μ M (50pmol), cDNA 第一链合成反应液2 μ L，加水至25 μ L，然后加入Taq聚合酶0.5 μ L(IU) ;PCR循环条件:94°C变性 3min ;然后 94°C lmin, 52°C lmin, 72°C lmin，循环 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ;4°C保存反应产物。
8.根据权利要求4所述的一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤: c 1、用I X TAE缓冲液和琼脂糖按1.5 %的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60 0C ； c2、加入SYBR GREEN I核酸染料或浓度为I μ g/mL的溴化乙锭，混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳； c3、待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲； C4、取I μ L加样缓冲液与5 μ L PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中； c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm ； c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。
全文摘要
本发明公开了用于检测椰子败生类病毒的引物、试剂盒及检测方法，其中所述引物的序列为CTIVD Primer-1:5'-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'，CTIVD Primer-2:5'-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'。所述的试剂盒及检测方法中包含所述引物CTIVD Primer-1和CTIVD Primer-2。利用该引物及检测方法检测椰子败生类病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。
文档编号C12Q1/70GK103243177SQ201310163000
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者陈定虎, 陈祖华, 王宏 申请人:陈定虎