苹果潜隐病毒和类病毒的多重rt-pcr检测方法
【专利摘要】本发明提供一种可同时检测苹果树叶片、枝条、花和果实是否携带3种潜隐病毒(苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒)和苹果锈果类病毒属3种类病毒(苹果锈果类病毒、苹果凹果类病毒、苹果皱果类病毒)的多重RT-PCR检测方法。利用该方法进行检测，具有检测结果易于判别、操作简便、反应快速、灵敏度高等优势，克服了现有技术中耗时、步骤繁琐、条带不易区分、灵敏度低等缺点，为苹果病毒病的检测提供了一种便于推广应用的快速检测方法。
【专利说明】苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]在苹果栽培生产过程中，病毒病害一直是严重影响果品产量和品质的主要因素之一。苹果树被病毒侵染后，终生带毒，病毒在树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退，产量下降，品质变劣，不耐贮藏，给我国的苹果生产造成了严重的经济损失。目前，我国已发现和鉴定的病毒主要包括:苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus, ACLSV)、苹果莖沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)、苹果莖痕病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)、苹果镑果类病毒(Apple scar skin viroid, ASSVd) >苹果凹果类病毒(Apple dimple fruit viroid, ADFVd) ? 前 3 种(ACLSV、ASGV、ASPV)为潜隐性病毒，侵染苹果树不引起明显症状，但导致树势衰弱，果实产量和品质严重下降；后2种(ASSVd和ADFVd)为类病毒，同为苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)成员，在果实上表现锈果、花脸、凹陷等症状，严重降低果实经济价值，甚至完全丧失经济价值。ADFVd是于2013年在我国首次发现并报道的危险性类病毒，在我国苹果主产区山东和新疆局部发生，但有快速蔓延趋势。此外，日本学者报道了苹果皱果类病毒(AFCVd)的发生和危害，尽管AFCVd还未在我国发现，因其危害严重，有必要进行监测。
[0003]与其他病害相比，苹果病毒病的发生与危害有几大明显特点，一是多数为潜隐性发生，难以通过观察症状判断是否有病毒；二是类病毒对苹果果实危害严重，在枝条和幼树上无任何症状，经3~5年生长到了结果期，果实发病，果农损失惨重，所以育苗和生产中对苹果锈果类病毒属的3种类病毒应为零容忍；三是一旦被侵染，果树将终生带毒，受到长期且持续的危害；四是目前没有有效的药剂防治，特别是类病毒病发生后，应将病树刨除。这些特点给病害的诊断和控制造成了困难，在苹果嫁接生产过程中不能轻易分辨健康苗和带毒苗，容易造成带毒苗的乱用，使得后续病害大范围快速扩散。为此，亟待开发一种简单、快速、灵敏的检测方法用于检测苹果树和果实是否携带病毒和类病毒。
[0004]目前常见的检测病毒的方法有2种，一是以ELISA为主的血清学检测方法，因该方法灵敏度低，果树病毒含量低，该方法不适合苹果病毒的检测；二是常规PCR方法，由于侵染苹果的病毒种类多，需对每种病毒进行PCR检测，操作繁琐，耗时长，花费高。近些年逐渐发展起来的多重PCR(Multiplex Polymerase Chain React1n),由于可以在一个反应管中同时扩增多个序列，大大缩短了检测时间，实现了对多种病毒的同步检测，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。相比常规PCR，多重PCR效率高，系统性强，节省了检测成本与检测时间，在果树病害的检测中多有报道，但没有关于同时检测3种潜隐病毒与苹果锈果类病毒属3种类病毒的相关文献和专利。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合。
[0006]本发明的另一目的是提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。
[0007]本发明的再一目的是提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法。
[0008]为了实现本发明目的，首先参考现有文献与GenBank中已报道的序列，筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于我国现有已确定的苹果所有潜隐病毒与类病毒，可特异地获得目标片段，且各目标片段可以用琼脂糖凝胶电泳清晰、明确地区分开。由于类病毒基因组较小(仅约330nt)，ASSVd、ADFVd、AFCVd同属Apscarviroid，且苹果栽培生产中，仅一种类病毒存在即引起严重危害，实际生产中不允许任一种类病毒存在，因此根据苹果锈果类病毒属3种类病毒设计通用引物检测3种类病毒。
[0009]本发明的苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，所述引物组合包括:
[0010]用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus, ACLSV)的引物对 I:
[0011]ACLSV-F5; -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
[0012]ACLSV-R5; -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3;
[0013]其中，N为A或 G，M为A或C;
[0014]用于特异性RT-PCR检测苹果莖沟病毒(Apple stem grooving vir us, ASGV)的引物对II:
[0015]ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3;
[0016]ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'；
[0017]用于特异性RT-PCR检测苹果莖痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)的引物对III:
[0018]ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3'
[0019]ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及
[0020]用于特异性RT-PCR检测苹果锈果类病毒属(Apscarviroid) 3种类病毒:苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid)、苹果凹果类病毒(Apple dimple fruit viroid)和苹果皱果类病毒(AFCVd)的通用引物对IV:
[0021]apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
[0022]apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
[0023]为了减少假阳性的产生，加入了更加特异的EF-1 α作为内标基因。因此，所述引物组合中还包括用于特异性RT-PCR检测内参基因ER-1 α的引物对V:
[0024]ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3'
[0025]ER-1a-R 5' -CCTGTCC AGAACCCAATTC-3'。
[0026]本发明还提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。
[0027]所述试剂盒还包括反转录酶、RNase抑制剂、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0028]本发明还提供所述试剂盒在多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒中的应用。
[0029]本发明进一步提供苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤:
[0030]I)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；
[0031]2)以步骤I)中获得的cDNA为模板，利用上述引物组合进行特异性PCR扩增反应；
[0032]3)分析PCR产物。若794bp处有条带表明ACLSV为阳性，若666bp处有条带表明ASGV为阳性，若346bp处有条带表明ASPV为阳性，若220bp处有条带表明apscarviroids为阳性。
[0033]前述的方法，步骤I)具体为:提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品 RNA3.5μ L、10yM 随机引物 0.5 μ LUO μ M Oligo dT0.5 μ L,5XM-MLV 酶缓冲液
4.0 μ LUOmM dNTPsl.0 μ L、RNA 酶抑制剂 0.5 μ L、200U/μ L M-MLV 反转录酶 0.5 μ L，加DEPC ddH20至总体积20 μ L，于42°C反应lh，即得第一条cDNA链。
[0034]其中，所述随机引物为5' -d(NNNNNN)，N*A、G、C*T。
[0035]步骤2)中进行PCR扩增使用的PCR反应体系以25 μ I计为:
[0036]
【权利要求】
1.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括: 用于特异性RT-PCR检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的引物对1:
ACLSV-F 5' -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
ACLSV-R 5' -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3' 其中，N为A或G，M为A或C; 用于特异性RT-PCR检测苹果莖沟病毒(Apple stem grooving vir us)的引物对II: ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3'
ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'； 用于特异性RT-PCR检测苹果莖痘病毒(Apple stem pitting virus)的引物对III: ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3' ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及 用于特异性RT-PCR检测苹果锈果类病毒属(Apscarvi1id) 3种类病毒:苹果锈果类病毒(Apple scar skin vi roid)、苹果凹果类病毒(A pple dimple fruit viroid)和苹果皱果类病毒(AFCVd)的通用引物对IV:
apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中还包括用于特异性RT-PCR检测内参基因ER-1 α的引物对V:
ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3' ER-1a-R 5' -CCTGTCCAGAACCCAATTC-3'。
3.含有权利要求1或2所述引物组合的用于多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、RNase抑制剂、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.权利要求3-5任一项所述试剂盒在多重RT-PCR检测苹果潜隐病毒和类病毒中的应用。
7.苹果潜隐病毒和类病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链； 2)以步骤I)中获得的cDNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行特异性PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤I)具体为:提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA3.5 μ L、10 μ M随机引物0.5 μ L、10 μ M OligodT0.5 μ L、5 XM-MLV 酶缓冲液 4.0 μ L、1mM dNTPs 1.0 μ L、RNA 酶抑制剂 0.5 μ L、200U/ μ LM-MLV反转录酶0.5 μ L，加DEPC ddH20至总体积20 μ L，于42°C反应lh，即得第一条cDNA链。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增使用的PCR反应体系以25 μ I计为:cDNA 模板2.0μ1 1mM dNTPs0.5μ1 20μΜ ACLS^FΙ.Ομ! 20μΜ ACLSV-RΙ,ΟμΙ 20μΜ ASGV^FΙ.ΟμΙ
20μΜ ASGV-R1.ΟμΙ
20μΜ ASPV-F0.4μΙ
20μΜ ASPV-R0.4μ1
20μΜ apscarviroids-F0.5μΙ 20μΜ apscarviroids-R0.5 μL 20μΜ ER-1tt-F0.5μΙ 20μΜ ER-1a-R0.5μΙ SU/μΙ Taq DNA聚合轉0,5μΙ 10 X PCR反应缓冲液5.0μ1ddH20补足至 25μ1?PCR反应条件为:94°C 3分钟；94°C 30秒，53°C 45秒，68°C 2分钟，共35个循环；72°C 10分钟。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。
【文档编号】C12Q1/68GK104164517SQ201410347974
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】周涛, 郝璐, 陈善义, 范在丰, 国立耘, 叶婷 申请人:中国农业大学