专利名称：采用低温处理脱除菊花类病毒的方法
技术领域：
本发明属于植物的提纯复壮和繁育，具体地说是采用低温处理脱除菊花类病毒的方法。
背景技术：
菊花类病毒为支原体病毒，该病毒高温发作，染病菊花植株矮化、叶片局部褪绿或枯斑，病毒感染严重时叶片干枯、整株死亡，发病率达20-30％。热处理加茎尖培养是目前脱除植物病毒最常用的方法，效果较好，但该方法在菊花脱毒方面存在很大的局限性，即一是不能脱除菊花类病毒，二是热处理易导致植株干枯、死亡。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用低温处理脱除菊花类病毒的方法。
本发明的整体技术构思是采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，包括如下步骤(1)低温处理将菊花进行透光低温培养，温度为-2℃-3℃或4℃-6℃，取菊花刚萌动的芽点、根蘖芽或顶芽；(2)消毒处理将步骤(1)中获得的芽点、根蘖芽或顶芽洗净后，消毒；(3)切取茎尖培养；(4)类病毒检测采用RT-PCR方法检测待检瓶苗，获得脱除菊花类病毒的菊花无性系。
(5)脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁。
本发明中各工艺步骤的工艺条件分别为步骤(1)中的低温处理是在自然条件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆透光保温遮盖物，当其根部地温在-2℃-3℃范围时，取菊花刚萌动的芽点或根蘖芽。
因为菊花是宿根类多年生草本植物，在华北冬季地上植株部分死亡，翌年根部萌生新芽生长，根据菊花宿根的特性，利用冬季自然低温进行处理。处理的时间因地区的不同而异，在华北地区为12月-2月份。
步骤(1)中的低温处理还可以选用人工低温处理，即选生长健壮的菊花试管瓶苗置于透光的低温培养箱中，在温度为4℃-6℃条件下，进行90-120天的低温冷处理，然后取顶芽。
步骤(2)中的消毒处理是将步骤(1)获得的芽点、根蘖芽或顶芽，用肥皂水洗净，在超净工作台上依次用70％酒精表面灭菌10-20秒，0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸净芽体表面水分。
步骤(3)中切取茎尖培养是切取步骤(2)中所获得的芽点、根蘖芽或顶芽的茎尖，接种于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+琼脂5g/L组成的培养基上进行培养，获得待检菊花组培无性系，培养基的pH为5.6-5.8，茎尖大小为0.2～0.4cm。其中6-BA为6-苄基氨基嘌呤，IBA为吲哚丁酸(下同)。
步骤(5)中脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁是将经检测脱病毒的菊花源源种，进行分化增殖培养。其中脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁中分化培养基组成为MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+琼脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培养基上25～30天继代一次；待菊花瓶苗长到3～4cm时进行生根培养，生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培养条件温度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后炼苗20-30天移栽，获得脱毒菊花种苗。其中NAA为萘乙酸(下同)。
本发明所取得的技术进步在于采用低温对菊花进行处理，结合茎尖培养，能够有效地脱除菊花类病毒，其工艺方法简单、易行，且效果较好。且对于脱除其他植物类病毒研究具有一定的指导和参考价值。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述实施例1
采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，包括如下步骤(1)低温处理在自然条件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆塑料小拱棚，当其根部地温在-2℃-3℃范围时，取菊花刚萌动的芽点或根蘖芽。；(2)消毒处理将步骤(1)获得的芽点、根蘖芽或顶芽，用肥皂水洗净，在超净工作台上依次用70％酒精表面灭菌10-20秒，0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸净芽体表面水分。；(3)切取茎尖培养切取步骤(2)中所获得的芽点、根蘖芽或顶芽的茎尖，接种于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+琼脂5g/L组成的培养基上进行培养，获得待检菊花组培无性系，培养基的pH为5.6-5.8，茎尖大小为0.2～0.4cm。
(4)类病毒检测采用RT-PCR方法检测待检瓶苗，获得脱除菊花类病毒的菊花无性系。
(5)脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁将步骤(5)中脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁是将经检测脱病毒的菊花源源种，进行分化增殖培养。其中分化培养基组成为MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+琼脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培养基上25～30天继代一次；待菊花瓶苗长到3～4cm时进行生根培养，生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培养条件温度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后炼苗20-30天移栽，获得脱毒菊花种苗。
实施例2本实施例中的步骤(1)低温处理是选生长健壮的菊花试管瓶苗置于透光的低温培养箱中，在温度为4℃-6℃条件下，进行90-120天的低温冷处理，然后取顶芽。其余步骤同实施例1。
权利要求
1.采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于包括如下工艺步骤(1)低温处理将菊花进行透光低温培养，温度为-2℃-3℃或4℃-6℃，取菊花刚萌动的芽点、根蘖芽或顶芽；(2)消毒处理将步骤(1)中获得的芽点、根蘖芽或顶芽洗净后，消毒；(3)切取茎尖培养；(4)类病毒检测采用RT-PCR方法检测待检瓶苗，获得脱除菊花类病毒的菊花无性系。(5)脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁。
2.根据权利要求1所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的低温处理是在自然条件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆透光保温遮盖物，当其根部地温在-2℃-3℃范围时，取菊花刚萌动的芽点或根蘖芽。
3.根据权利要求1所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的低温处理是选生长健壮的菊花试管瓶苗置于透光的低温培养箱中，在温度为4℃-6℃条件下，进行90-120天的低温冷处理，然后取顶芽。
4.根据权利要求1、2、3所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的消毒处理是将步骤(1)获得的芽点、根蘖芽或顶芽，用肥皂水洗净，在超净工作台上依次用70％酒精表面灭菌10-20秒，0.1％升汞溶液灭菌1～3分钟，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸净芽体表面水分。
5.根据权利要求1所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(3)中切取茎尖培养是切取步骤(2)中所获得的芽点、根蘖芽或顶芽的茎尖，接种于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+琼脂5g/L组成的培养基上进行培养，获得待检菊花组培无性系，培养基的pH为5.6-5.8，茎尖大小为0.2～0.4cm。
6.根据权利要求1所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(5)中脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁是将经检测脱病毒的菊花源源种，进行分化增殖培养。
7.根据权利要求1所述的采用低温处理脱除菊花类病毒的方法，其特征在于所述的步骤(5)中脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁中分化培养基组成为MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+琼脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培养基上25～30天继代一次；待菊花瓶苗长到3～4cm时进行生根培养，生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培养条件温度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后炼苗20-30天移栽，获得脱毒菊花种苗。
全文摘要
本发明属于植物的提纯复壮和繁育，具体地说是采用低温处理脱除菊花类病毒的方法。包括低温处理、消毒处理、切取茎尖培养、类病毒检测、脱毒无性系菊花种苗的组培扩繁等工艺步骤。本发明解决了现有技术存在的热处理加茎尖培养脱除植物病毒的方法不能脱除菊花类病毒、易导致植株干枯、死亡的问题，能够有效地脱除菊花类病毒，其工艺方法简单、易行，且效果较好的特点。该方法对于脱除其他植物类病毒研究具有一定的指导和参考价值。
文档编号A01G7/00GK1926965SQ20061004834
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者谢晓亮, 田伟, 周巧梅, 吴志明, 刘铭, 温春秀 申请人:河北省农林科学院经济作物研究所